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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Protokolle für Waschmittel-freie Homogenisierung der kultivierten Säugerzellen basierend auf Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Diese Methode ist ideal für die Überwachung der Partitionierung von peripheren Membranproteinen zwischen löslich und Membran-Fraktionen.

Zusammenfassung

Kultivierte Zellen eignen sich für das Studium der subzellulären Verteilung von Proteinen, einschließlich der peripheren Membranproteine. Genetisch codierte Eindringmittel haben tagged Proteine das Studium der subzellulären Proteinverteilung revolutioniert. Es ist jedoch schwierig zu quantifizieren die Verteilung mit Fluoreszenz-Mikroskopie, vor allem, wenn Proteine teilweise cytosolischen sind. Darüber hinaus ist es oft wichtig, körpereigene Proteine zu studieren. Biochemische Tests wie Immunoblots der Goldstandard für die Quantifizierung der Proteinverteilung nach subzellulären Fraktionierung bleiben. Zwar kommerzielle Kits, die cytosolischen oder bestimmte Fraktionen Membran isolieren wollen, basieren die meisten dieser Kits auf Extraktion mit Reinigungsmitteln, die möglicherweise ungeeignet für das Studium periphere Membranproteine, die leicht aus Membranen extrahiert werden. Hier präsentieren wir ein Waschmittel-freie Protokoll für zelluläre Homogenisierung von Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Wir bestätigen die Trennung der subzellularen Organellen in lösliche und Pellet Brüche in verschiedenen Zelltypen und Proteingewinnung unter mehrere gemeinsame mechanische Homogenisierung nicht-Reinigungsmittel-basierte Methoden zu vergleichen. Einige Vorteile von Stickstoff ist Kavitation die überlegene Effizienz der zellulären Störungen mit minimalen physikalischen und chemischen Schäden an empfindlichen Organellen. In Kombination mit Ultrazentrifugation Stickstoff Kavitation ist eine hervorragende Methode, die Verschiebung von peripheren Membranproteinen zwischen cytosolischen zu untersuchen und Membran-Fraktionen.

Einleitung

Zelluläre Proteine können in zwei Klassen einteilen: diejenigen, die Membranen und diejenigen, die nicht zugeordnet sind. Nicht zugeordneten Membranproteine sind im Zytosol, Nukleoplasma und Lumina von Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) gefunden. Es gibt zwei Klassen von Membran-assoziierte Proteine, integralen und peripheren. Integrale Membranproteine sind auch bekannt als transmembrane Proteine, weil ein oder mehrere Segmente der Polypeptid-Kette erstreckt sich über die Membran in der Regel als eine α-Helix bestehend aus hydrophoben Aminosäuren. Transmembrane Proteine sind co-translationally Membranen im Laufe des Jahres ihre Biosynthese eingeschoben und so konfigurierten bleiben, bis sie catabolized sind. Periphere Membranproteine sind sekundär, Membranen, meist als Folge von Post-translationale Modifikation mit hydrophoben Moleküle wie Lipide angetrieben. Im Gegensatz zur integralen Membranproteine die Vereinigung von peripheren Membranproteinen mit Zellmembranen ist reversibel und kann reguliert werden. Viele periphere Membran Proteine funktionieren im Signalwege und geregelte Zusammenarbeit mit Membranen ist ein Mechanismus zum Aktivieren oder hemmen einen Weg. Ein Beispiel für ein Signalmolekül, das eine periphere Membranprotein ist die kleine GTPase, RAS. Nach einer Reihe von post-translationalen Modifikationen, die Änderung mit einem Farnesyl-Lipid enthalten, fügt modifizierte C-Terminus eines ausgereiften RAS-Proteins in der zytoplasmatischen Broschüre von der Zellmembran. Insbesondere ist der Plasmamembran, wo die RAS die nachgeschaltete Effektor RAF1 eingreift. Um konstitutive Aktivierung von Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weg zu verhindern, sind mehrere Ebenen von Kontrolle über RAS. Neben Rendern RAS durch hydrolysieren GTP in BIP inaktiv, können aktive RAS auch von der Plasmamembran durch Modifikationen oder Interaktionen mit Gefäss-Faktoren zur Signalisierung hemmen freigegeben werden. Obwohl fluoreszierende live Imaging Zellbiologen die Möglichkeit bietet, die subzelluläre Lokalisation der fluoreszierende Protein-Tags peripheren Membran Proteine1beobachten, bleibt eine kritische Notwendigkeit auszuwertende Membran Verband der körpereigene Proteine semi-quantitativ mit einfachen biochemischen Ansätzen.

Die richtige biochemische Auswertung der Protein Aufteilung zwischen Membran und löslichen Brüche hängt entscheidend von zwei Faktoren ab: zelluläre Homogenisierung und effiziente Trennung von Membran und löslichen Brüche. Obwohl einige Protokolle, darunter die am weitesten verbreitete kommerzialisierten Kits von Waschmittel-basierte Zelle Homogenisierung abhängen, können diese Methoden Analyse durch die Gewinnung von Membranproteinen in die lösliche Phase2zu verschleiern. Dementsprechend liefern nicht Reinigungsmittel basierte, mechanische Methoden der Zellaufschluss sauberere Ergebnisse. Es gibt mehrere Methoden der mechanischen Störungen der Zellen in Kultur angebaut oder geerntet aus Blut oder Organe. Dazu gehören Dounce Homogenisierung, feinen Nadel Störung, kugelgelagerte Homogenisierung, Beschallung und Stickstoff Kavitation. Wir bewerten hier Stickstoff Kavitation und vergleichen es mit anderen Methoden. Stickstoff-Kavitation stützt sich auf Stickstoff, die in das Zytoplasma der Zellen unter hohem Druck aufgelöst wird. Nach Gleichgewichtherstellung wird die Zellsuspension abrupt auf den atmosphärischen Druck ausgesetzt, so dass Stickstoffluftblasen entstehen im Zytoplasma, die die Zelle als Folge ihrer Aufbrausen aufreißen. Wenn der Druck hoch genug ist, Stickstoff Aufbrausen stören kann der Kern3 und Membran gebunden Organellen wie Lysosomen4. Jedoch wenn der Druck gering genug gehalten wird, unterbrechen die Dekompression die Plasmamembran und ER aber nicht andere Organellen, dabei verschütten Zytosol und intakte zytoplasmatischen Organellen in der Homogenat, der die Cavitate5festgelegt ist. Aus diesem Grund ist Stickstoff Kavitation die Methode der Wahl für die Isolierung von Organellen wie Lysosomen und Mitochondrien.

Es ist jedoch auch eine hervorragende Möglichkeit der Vorbereitung eine homogenisierte, die leicht in Membran und löslichen Brüche unterteilt werden kann. Der Druckbehälter ("the Bomb" bezeichnet) verwendet, während Kavitation besteht aus einem dicken Edelstahl-Gehäuse, die hohen Druck mit einem Einlass für die Lieferung des Gases Stickstoff aus einem Tank und einem Auslass mit einem einstellbaren Auslassventil widersteht.

Stickstoff-Kavitation wurde für Zelle Homogenisierung seit den 1960er Jahren6verwendet. Im Jahr 1961 Jäger und Commerfold7 Stickstoff Kavitation als eine praktikable Option für Säugetier-Gewebe Störung etabliert. Seitdem Forscher haben die Technik, um verschiedene Zellen und Gewebe mit Erfolg angepasst, und Stickstoff Kavitation ist ein Grundnahrungsmittel in mehreren Anwendungen, einschließlich der Membran Vorbereitung8,9, Kerne und Organelle geworden Vorbereitung10,11, und labile biochemischen Abbau. Derzeit beschäftigen Zellbiologen häufiger andere Methoden der Zelle Homogenisierung, weil die Vorteile von Stickstoff Homogenisierung nicht weit ausgeschrieben, Stickstoff-Bomben teuer sind und es ist ein Irrglaube, das ist eine relativ große Anzahl von Zellen Erforderlich. Protokolle für Stickstoff Kavitation, zellfreie Homogenates mit intakten Zellkernen zu erreichen sind nicht veröffentlicht worden, und in die meisten veröffentlichten Bewertungen Volumen von 20 mL Zellsuspension dienten. Um diese klassische Technik aktuelle Anforderungen der Arbeit mit kleinen Proben entsprechend anzupassen, stellen wir einen geänderten Protokoll der Stickstoff Kavitation speziell für kultivierten Zellen. Nach Stickstoff Kavitation, das Homogenat ist getrennt in lösliche (S) und Membran (P) Brüche durch differentielle Zentrifugation, zuerst mit einem Lowspeed Spin, Kerne und ungebrochene Zellen zu entfernen, und dann mit einem High-Speed-Spin (> 100.000 x g) trennen Membranen aus der löslichen Fraktion. Wir analysieren die Effizienz der Trennung mit Immunoblots und Stickstoff Kavitation mit anderen Techniken, mechanische Störungen zu vergleichen. Wir untersuchen auch die osmotische Wirkung der Homogenisierung Puffer während Stickstoff Kavitation.

Protokoll

1. Puffer und Ausrüstung Vorbereitungen

  1. Chill 45 mL Zelle Störung Bomben, 15 mL-Tuben und Ultrazentrifugation Rohre bei 4 ° c
  2. Vorbereiten und chill Homogenisierung Puffer pro 2 x 10 7 Zellen bei 4 ° c hinzufügen eine Protease Inhibitor Tablette kurz vor dem Einsatz 25 mL.
    Hinweis: Homogenisierung Puffer enthalten in der Regel KCl, anstatt NaCl besser reflektieren intrazellulären Salzzusammensetzung. Homogenisierung Puffer verwendet, die in diesem Protokoll besteht aus 10 mM HEPES bei pH 7,4, 10 mM KCl und 1,5 mM MgCl 2 (nachfolgend hypotone Homogenisierung Puffer). Die meisten Puffer können für Stickstoff Kavitation angepasst werden (siehe Diskussion).
  3. Vorbereiten und chill-6 mL 1 x Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (PBS) Puffer pro Probe bei 4 ° c hinzufügen Protease Inhibitor Tabletten vor Gebrauch frisch.
    Hinweis: In diesem Protokoll verwendeten PBS-Puffer besteht aus 10 mM Na 2 HPO 4 bei pH 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl.
  4. Vorbereiten und chill 4 mL Solubilisierung Puffer pro Probe bei 4 ° c Hinzufügen einer Protease Inhibitor Tablet kurz vor Gebrauch.
    Hinweis: Solubilisierung Puffer verwendet, die in diesem Protokoll ist 1 X Radioimmunoprecipitation (RIPA) Testpuffer, bestehend aus 25 mM Tris bei pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 % Natrium Deoxycholate, 0,1 % SDS und 1 % NP-40. Erläuterung Nr. 4.6.

2. Handy-Ernte

  1. wachsen 2 x 10 7-10 x 10 9 Gewebekultur Zellen mit der empfohlenen Nährmedien für den Zelltyp. In der Regel liefert ein 15-cm-Schüssel 2 x 10 7 HEK-293-Zellen kultiviert in DMEM bei 90 % Konfluenz ( Abbildung 1).
  2. Entfernen das Wachstumsmedium durch Vakuum.
  3. Platz für adhärente Zellen, die Kultur-Gerichte auf dem Eis, waschen Sie die Zellen direkt auf die Kultur Gerichte sanft mit gekühlten Homogenisierung Puffer zweimal (10 mL Puffer pro 15 cm Schüssel pro Waschgang) und ernten die Zellen mit einem großzellige Schaber in einem entsprechenden Volumen von Homogenisierung Puffer; Für Aussetzung Zellen die Zelle Pellet in gekühlten Homogenisierung Puffer zweimal (10 mL Puffer pro 50 mL Kultur pro Waschgang) mit 500 X g Spin bei 4 ° C für 5 min waschen sammeln und Aufschwemmen der gewaschenen Zelle Pellet in einem entsprechenden Volumen der Homogenisierung Puffer auf Eis.
    Hinweis: die Lautstärke sollte anhand der Anforderungen für die Proteinkonzentration in den geplanten Experimenten sowie die minimalen/maximalen Lautstärke in die Zelle Störung Bombe erlaubt. Eine allgemeine Richtlinie ist 2-10 x 10 7 Zellen/mL oder pellet-ca. 10 Bände der Zelle. Dieses Protokoll ist für drei 15-cm-Gerichte der HEK-293-Zellen in 2 mL Homogenisierung Puffer optimiert.

3. Stickstoff-Kavitation

  1. Übertragung der Zellsuspension auf eine saubere und gekühlte Bombe im Eisbad auf Aufsehen Platte.
    Achtung: Die Bombe hat, hohen Druck, niedrige Temperatur, Stickstoffgas – tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung .
  2. Mikro magnetische Stir Bar im Inneren der Bombe und Einschalten der rühren Platte weiterhin Aussetzung Homogenität.
  3. Die Aussetzung einer Protease-Inhibitor-Tablette hinzu und schließen Sie die Bombe pro Hersteller ' Anweisung s.
  4. Druck allmählich die Bombe mit einem Stickstoff-Gas-Tank pro Hersteller ' s Anweisung bis die Bombe Manometer liest 300 bis 600 Psi. Alle Ventile schließen und trennen der Stickstofftank.
    Hinweis: Der erforderlichen Druck variieren mit der Art der Zelle. Hier führten wir Kavitation bei 350 bis 400 Psi für HEK-293, NIH-3 t 3 und Jurkat Zellen.
  5. Warten Sie 20 Minuten erlauben den Stickstoff zu lösen und das Gleichgewicht innerhalb der Zellen zu erreichen.
  6. Entfernen Sie überschüssiges Wasser rund um das Auslassventil mit einem Tuch Handtuch. Öffnen Sie das Ablassventil vorsichtig, um eine tropfenweise Freisetzung von Homogenat erreichen und sammeln in einer vorgekühlt 15 mL Tube.
    Hinweis: Am Ende der Sammlung werden ein Spurt von Homogenat und Gas entstehen mit einem Zischen. Stellen Sie sicher, dass das Gas nicht Ursache zuvor erfassten kavitieren aus dem Rohr schießen (daher die Verwendung von 15 mL Röhrchen statt 1,5 mL Röhrchen). Sobald die Spurt beginnt, schließen Sie das Ablassventil und öffnen Sie des Einlassventils Stickstoff abrupt um drucklos machen die Bombe und Kavitation der verbleibenden Zellen in die Bombe. Offen die Bombe für ordnungsgemäße Wiederherstellung und gründliche Reinigung.
    Hinweis: Die endgültige Cavitate sollte ein milchiges Aussehen mit Schaum an der Spitze haben. Rühren Sie leicht mit einer Pipettenspitze, den Schaum vor Zentrifugation abklingen zu lassen.
    Hinweis: Untersuchen Sie die Cavitate Phasenkontrast-Mikroskopie die Homogenisierung Effizienz bestimmen. Geben Sie einen Tropfen 15 µL Kavitation an der Oberfläche der Mikroskopie Rutsche und mit einem Deckglas abdecken. Wiederholen Sie Schritt 3.4-3.6 nur dann, wenn zu viele ungebrochene Zellen werden mit einem 20 X Ziel erkannt.
    Hinweis: Wenn Homogenisierung Puffer keine EDTA oder EGTA enthält, fügen Sie es, die gesammelten auf eine Endkonzentration von 1 mM innerhalb von 5 min nach der Entlassung kavitieren.

4. Trennung von Cytosolic und Membrane Brüche

  1. Zentrifuge Cavitate bei 500 X g für 10 min bei 4 ° C, ungebrochene Zellen und Kerne entfernen.
    Hinweis: Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt zu, bis keine sichtbaren Pellet entsteht und sammeln Sie die Post Nuclear überstand (PNS) unter Vermeidung des Schaums oben schweben. Erneut Zentrifugieren den Schaum um weitere Sammle und kombiniere PNS, falls erforderlich ( Abbildung 1).
  2. Verarbeiten die PNS wie gewünscht um Bruchteile von Interesse zu erhalten. Zum Zwecke der cytosolischen trennen und Membran-Fraktionen übertragen Sie die PNS an einer Ultrazentrifuge Rohr und führen Sie Ultrazentrifugation wie gewünscht. Dieses Protokoll ist optimiert für eine < 3,5 mL Probe in einem Polycarbonat Ultrazentrifugen Rohr und Ultrazentrifugation 350.000 x g für 1 h bei 4 ° c
  3. Sammeln mit einer 1 mL-Pipette überstand (S-Bruch).
  4. Sorgfältig abspülen das Pellet mit 3 mL kaltem PBS ohne es zu stören. Entfernen Sie die PBS durch Vakuum.
    Hinweis: Wenn die Kontamination von der Membran Bruch durch cytosolische Proteine ein größerer Bedeutung als der Verlust der Probe ist, Aufschwemmen der Pellets in 3 mL kaltem PBS und Re-Ultrazentrifugen wie in Schritt 4.2. Entfernen Sie die PBS durch Vakuum.
  5. Aufschwemmen der Pellet vollständig in einem entsprechenden Volumen der Waschmittel-haltigen Solubilisierung Puffer der Wahl. Um Zelle Gleichwertigkeit zu erreichen, verwenden Sie die gleiche Menge an Solubilisierung Puffer als die cytosolische Fraktion.
    Hinweis: Wir empfehlen 1 X RIPA Puffer als Solubilisierung Puffer für effiziente Membran-Protein-Extraktion. Wenn keine nachgeschalteten Assay für Membran Bruchteil erforderlich ist, verwenden Sie 1 X laemmli Probenpuffer für maximale Membran Proteingewinnung.
    Hinweis: Wir empfehlen verdrängen und das Pellet in Solubilisierung Puffer in ein sauberes Röhrchen auf ein Rohr Rotator bei 4 ° C für maximal Membran Proteingewinnung.
    Hinweis: Wenn die Kugel ist zu klebrig (zu viele Lipide) th effizient entfernt werdene Ultrazentrifugen Rohr in Solubilisierung Puffer, wir empfehlen Snap Einfrieren das Pellet in flüssigem Stickstoff und schnell verdrängen die Pellets aus der Ultrazentrifuge Tube mit einem Mini Metallspatel, bevor das Pellet taut.
    Hinweis: Alternativ Membran Pellets können nur Nukleinsäuretablette und nicht solubilisiert in einem nicht-Reinigungsmittel-haltigen Puffer, ein P-Anteil der Membran Vesikel Aussetzung zu produzieren, in diesem Fall die Zentrifugation Schritt 4.6 nicht erforderlich ist. Solche Brüche P eignen sich bei der Untersuchung von Funktionen wie Enzym-Aktivitäten, die Membran Vereinigung abhängig sind.
  6. Zentrifuge voll solubilisiert Pellet-Suspension aus Schritt 4.5 bei 20.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge für 10 min bei 4 ° c den Überstand mit einer 1-mL-Pipette (P-Anteil) zu sammeln und entsorgen das Pellet (unlöslichen Lipide).
  7. Gewünschte Assays wie westliche Beflecken mit der cytosolischen bzw. Membran Brüchen führen, oder bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die Aufteilung des zellulären Proteinen aus PNS in der löslichen cytosolische Fraktion (S) oder Membran Pellet Bruchteil (P). Wir untersuchten drei repräsentativen Zelllinien aus verschiedenen Zelltypen: HEK-293 (epitheliale), NIH-3 t 3 (Fibroblasten) und Jurkat (Lymphozyten). Rho Guanin Dissoziation Inhibitor (RhoGDI) und kationen-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (CIMPR) dienten als Positivkontrollen für cytosolischen und Membra...

Diskussion

Die Vorteile von Stickstoff Kavitation gegenüber anderen Methoden der mechanischen Störungen sind vielfältig. Vielleicht ist der wichtigste Vorteil seine Fähigkeit, sanft aber effizient Proben zu homogenisieren. Die physikalischen Grundlagen der Dekompression kühlt Proben statt erzeugen lokale Erwärmung Schaden wie Ultraschall und Reibung/Scheren Techniken basiert. Kavitation ist auch äußerst effizient in der Plasmamembran zu stören. Da Stickstoff werden Luftblasen innerhalb jeder einzelnen Zelle bei der Dekompr...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von GM055279, CA116034 und CA163489 finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Disruption Vessel (45 mL)Parr Instrument4639Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL)Kontes885300-0002Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½Becton Dickinson329461Needle
Atg12 antibodySanta Cruz271688Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibodySanta Cruz47778Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibodyDSHBE7-sMouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibodySanta Cruz23954Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibodySanta Cruz373863Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibodySanta Cruz271803Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibodyAbcam124767Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibodySanta Cruz137130Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibodySanta Cruz373746Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibodySanta Cruz514419Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibodySanta Cruz55597Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibodySanta Cruz374022Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibodySanta Cruz59820Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibodySanta Cruz81598Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibodyCell Signaling Technology2024SRabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibodySanta Cruz376248Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibodyDSHBH4A3-cMouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibodySanta Cruz48345Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibodyAbcam137029Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibodyThermoMA3-067Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibodySanta Cruz398052Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibodySanta Cruz360Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibodySanta Cruz74459Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibodySanta Cruz12322Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tubeBeckman Coulter349622Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotorBeckman Coulter349481rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal UltracentrifugeBeckman Coulter364300ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsRoche11697498001protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm BladeCorning353089large cell scraper
Magnetic Stir BarFisher Scientific14-513-57SIXmicro stir bar
Ceramic-Top Magnetic StirrerFisher ScientificS504501ASmagnetic stirrer

Referenzen

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