Ultrasonografía en las investigaciones de reproducción Experimental en ratas

Resumen

Este manuscrito describe la utilidad de la ecografía realizada en ratas hembras para el diseño de modelos experimentales para la investigación ginecológica y reproductiva. Se muestra una explicación paso a paso de cómo realizar evaluación ultrasonográfica.

Resumen

Con el desarrollo de la tecnología de reproducción asistida y los límites éticos de la investigación en seres humanos, modelos animales de ratón han sido ampliamente utilizados en medicina reproductiva. En el pasado, el estudio del desarrollo del sistema reproductivo en roedores se ha basado en un solo examen histológico de tejidos suprimidos. Recientemente, con el desarrollo de la ecografía transabdominal de alta resolución, ecografía de alta calidad puede ahora realizarse para evaluar los órganos reproductivos de las ratas, lo que permite un nuevo método para estudiar el sistema reproductor. Se obtuvieron imágenes utilizando un sistema ultrasonográfico de alta resolución. Ecografía ginecológica fue realizada en 28 ratas no-embarazada de ocho semanas de edad y 5 ratas Sprague-Dawley preñadas. Describimos cómo reconocer los órganos del sistema reproductivo y las estructuras asociadas en las típicas vistas durante las diferentes fases del estro del ciclo. Color de flujo que Doppler se utiliza para medir el flujo sanguíneo de la arteria uterina y evaluar cambios del patrón de flujo sanguíneo uterino durante las diferentes etapas del embarazo. Hemos demostrado que la exploración de ultrasonido es un método útil para evaluar cambios en órganos reproductivos internos. Su uso plantea la posibilidad de llevar a cabo experimentos adicionales, incluyendo los procedimientos médicos o quirúrgicos y proporciona la capacidad para monitorear cambios sonográficos a los órganos internos sin sacrificar animales.

Introducción

Modelos animales de ratón han sido ampliamente utilizados en medicina reproductiva, incluyendo embriones y trasplante ovárico^1,2. Sin embargo, en el pasado, el estudio del desarrollo del sistema reproductivo en roedores se ha basado en un solo examen histológico de tejidos suprimidos, y el estudio longitudinal de los cambios del día a día órgano reproductivo no ha sido posible en las ratas³. El ultrasonido ha sido ampliamente utilizado en reproducción asistida en humanos de más de 30 años, pero esta valiosa tecnología sólo se ha aplicado a las ratas recientemente.

Nuestro objetivo fue establecer un enfoque ultrasonographic para evaluar los órganos reproductivos de las ratas de Sprague-Dawley para diseño de modelos experimentales para la investigación de la reproducción y Ginecología y para demostrar el procedimiento porque a nuestro conocimiento, no hay visualizado las publicaciones actuales sobre este procedimiento. Describimos el procedimiento de la examinación ultrasonographic del sistema reproductivo de la rata hembra y los resultados de ultrasonographic presentes en la anatomía y el flujo sanguíneo de la arteria uterina utilizando ultrasonido de alta definición. Supervisamos las características del endometrio, los ovarios y flujo sanguíneo de la arteria uterina en hembras no preñadas en diferentes etapas del ciclo estral para evaluar las diferencias significativas en el espesor del endometrio, la morfología ovárica y del flujo sanguíneo uterino en diferentes etapas del ciclo estral, similar a las mujeres. Utilizamos equipos de ultrasonido de alta calidad con una frecuencia de 70 MHz y una resolución de 30 μm. Nuestro otro objetivo fue evaluar los cambios en la resistencia del flujo sanguíneo uterino en ratas preñadas. Esta técnica permite el estudio de los cambios diarios en los órganos reproductivos sin sacrificar animales.

Hay varias dificultades técnicas en la utilización de ultrasonido en ratas. Estas dificultades son: el endometrio de la rata es mucho más delgado que una hembra humana⁴. Dificultad en la proyección de imagen los ovarios de ratas se ha atribuido a la piel más gruesa y musculatura de la pared abdominal en ratas, que dio lugar a la casi completa atenuación del ultrasonido⁵, y la arteria uterina es mucho más difícil de encontrar en mujeres no embarazadas ratas. Hemos resuelto muchos problemas técnicos con el procedimiento, y para los problemas que quedan, mostramos cómo minimizarlos.

Seguimiento exitoso de sonográficas cambios en los órganos reproductivos de las ratas sin necesidad de sacrificar animales se abrirá la posibilidad de construir modelos animales futuro de la medicina reproductiva y otros procedimientos quirúrgicos.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y de acuerdo con la llegada (investigación Animal: presentación de informes en Vivo experimentos) directrices. El protocolo recibió una licencia para experimentación animal cumpliendo con la Directiva 2010/63/UE, con el número de autorización A13170404 (Anexo 1). Todos los experimentos fueron realizados en un laboratorio certificado por la Unión Europea, siguiendo las directrices nacionales para el cuidado ético de los animales (RD 53/2013, la Directiva 63/2010). El protocolo fue aprobado por el Comité de ética de los experimentos del Animal de la Universidad de Murcia.

1. animal preparación

Nota: Todos los experimentos fueron apoyados por el Animal sección de experimentación de la Universidad de Murcia y de la obstetricia y Ginecología Departamento de Murcia Universidad.

1. Uso de 8 semanas de edad ratas Sprague-Dawley (28 ratas hembra) con 200-250 g de peso en todos los experimentos.
   Nota: Aquí también utilizamos 5 ratas preñadas.
2. Para obtener las ratas embarazadas, ocho semanas de edad femeninas y fertilidad ratas macho de la jaula y mate de 17:00 -23:00 h. identificación de un tapón vaginal a la mañana siguiente fue interpretado como apareamiento de éxito. Considerar el día 1 de gestación, al día siguiente después de que fueron apoyadas.
3. Llevar a cabo los experimentos en 9, 15 y 18 días de gestación.
4. Ratas de la casa en grupos de dos con libre acceso al alimento y agua y mantienen en ciclos de luz/oscuridad de 12 h regular.
5. Aclimate a las condiciones de la instalación por un mínimo de dos semanas, después de usar citología vaginal diario por la mañana para evaluar en la regularidad y frecuencia de celo.
   Nota: Se seleccionaron 28 ratas con una fase de estro normal 4 a 5 días para su inclusión en el estudio.

2. preparación de las ratas para la proyección de imagen

Nota: La imágenes fueron obtenidas mediante ecografía transabdominal de alta resolución. Fases del ciclo estral se determinaron mediante citología de frotis vaginal.

1. Antes del estudio imagenológico, anestesiar la presa en la cámara de la inducción con isoflurano gas de 2-3%.
2. Retire el animal inmediatamente colocar el hocico dentro de un cono de nariz conectado al sistema de anestesia y mantener el animal en 1.5-2% isoflurano durante la examinación ultrasonographic.
3. Quitar la piel del margen costal del abdomen caudal clippers y crema depilatoria.
4. Coloque la rata anestesia en posición supina sobre una mesa caliente para asegurar la rata y garantizar una comodidad óptima y el mantenimiento de los parámetros fisiológicos de la duración de la sesión de imágenes. Todos los parámetros fisiológicos deben integrarse con las imágenes y datos capturan en tiempo real a través de la aplicación de ultrasonido.
5. Inserte suavemente una sonda rectal (después de lubricar) para monitorear la temperatura del cuerpo (37,5 ° C ± de 0.5 ° C).
6. El transductor (30 Hz) en un soporte estacionario y muévala a lo largo del eje vertical y eje horizontal (adelante-atrás y lado a lado) usando una palanca de mando manual o a mano.
7. Aplicar bálsamo oftálmico basados en petróleo en los ojos de la rata para evitar que se sequen durante el procedimiento.

3. procedimiento de examen

Nota: Anatomía de los órganos reproductivos de la rats´: la vagina se encuentra dorsal a la vejiga urinaria y se divide en dos cuernos uterinos que se extienden hacia los riñones. Los ovarios están conectados a los cuernos uterinos a través de los oviductos (figura 1). El útero está situado en la región posterior a los riñones.

1. Identificación del útero
   1. Mediante el uso de la vejiga como un punto de referencia para encontrar el cuello uterino, siga la cerviz para encontrar la sucursal de los cuernos uterinos derecho e izquierdos.
   2. Cambiar a la visualización bidimensional y video seleccionando "Modo B". Mida el diámetro antero-posterior de cada cuerno uterino en la región mediados de-ístmica en una imagen de la línea media sagital. Detectar medidas usando el software del sistema ultrasonographic.
   3. Medir el grosor endometrial de borde ecogénico a borde ecogénico en la cavidad endometrial en una imagen de la línea media sagital en modo"B".
   4. Cambiar al modo Doppler color seleccionando "Doppler Color". Utilizar Doppler color para identificar la fuente de sangre del endometrio y medir el flujo de sangre del endometrio. Seleccione los siguientes parámetros en el modo Doppler color: filtro de paso alto situado a 4 Hz, conjunto de frecuencia de repetición de pulsos entre 4 y 48 kHz y la puerta Doppler pulsada entre 0.2 a 0.5 mm.
2. Identificación del flujo sanguíneo de la arteria uterina
   1. Doppler obtener formas de onda en la arteria uterina cerca del margen inferior lateral de la Unión útero cervical cerca de la arteria ilíaca en cada lado.
   2. Utilice los siguientes parámetros en el modo Doppler: filtro de paso alto situado a 6 Hz, conjunto de frecuencia de repetición de pulsos entre 4 y 48 kHz y la puerta Doppler pulsada entre 0.2 a 0.5 mm.
   3. Tenga cuidado de alinear el haz Doppler para minimizar el ángulo Doppler y flujo sanguíneo. Registrar el ángulo entre el haz Doppler y el buque. Valores más allá de un ángulo de 60° son inexactos y deben evitar⁶.
   4. Medir la velocidad de pico sistólica (PSV) y la velocidad diastólica final (EDV) de tres ciclos consecutivos. Luego calcular la presión sanguínea sistólica y diastólica (S) proporcion (PSV/EDV) el índice de resistencia (RI) ([PSV-EDV] / PSV) valores para cada cuerno uterino.
   5. Medir el flujo sanguíneo de la arteria uterina de 5 ratas preñadas durante la 9^th, 15^th, 18^º día de gestación.
3. Identificación de ovarios y flujo sanguíneo de la arteria ovárica
   Nota: Los ovarios de rata hembra se encuentran laterales a los riñones a ambos lados del animal y residen en los cojines gordos encontrados el extremo del cuerno uterino (figura 1).
   1. Imagen del ovario, comenzar con la sonda en un plano transversal y colocar en el aspecto lateral del animal ligeramente por debajo de las costillas. El riñón y la almohadilla de grasa tienen un aspecto de hyperechoic en comparación con el ovario.
   2. Medir el límite externo del ovario y folículos. Los números en la escala de cada imagen son en milímetros, con incrementos de 0,1 mm.
      Nota: la proyección de imagen modo Doppler Color y Power Doppler modo ayuda con identificación de intensidad de ovario y flujo direccional.

4. diseño del estudio

1. Controlar el ciclo estral por citología de frotis vaginal.
2. Dividir todas las ratas en dos grupos. Grupo 1 o los fértil (o periovulatory), son las ratas que estaban en el proestro y estro ciclo de fases. Para grupo 2 o post-fértil, son las ratas que estaban en diestro temprano y diestro tardío fases del ciclo.
3. Monitorizar y comparar el diámetro antero-posterior de cada cuerno uterino en la región mediados de-ístmica en grupos 1 y 2.
4. Monitorizar y comparar el grosor endometrial y las características del endometrio en los grupos 1 y 2.
5. Supervisar y comparar el tamaño (diámetro máximo) y las características de los ovarios y localizar cualquier periovulatory folículos en ambos ovarios en grupos 1 y 2.
6. Monitorizar y comparar el flujo de sangre de la arteria uterina en los grupos 1 y 2.
7. Monitorizar y comparar el flujo de sangre de la arteria uterina de ratas embarazadas en diferentes etapas del embarazo (días 9, 15 y 18 de gestación).
8. Realizar análisis estadísticos utilizando SPSS. Presentar datos como la media ± desviación estándar (SD) o mediana con rangos intercuartil. Analizar los resultados utilizando la prueba t de estudiante entre los diferentes grupos. Un valor P de menos de 0,05 se consideró una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

No hubo diferencias significativas en los diámetros antero-posterior de cuerno uterino o en el espesor del endometrio entre los dos lados del cuerno uterino (tabla 1). En comparación con el grupo 2, el grosor endometrial promedio en el grupo 1 fue más gruesas, pero no significativas las diferencias (P > 0.05) fueron encontradas entre los dos grupos (figura 3). Sin embargo, se encontró líquido dentro del útero (8 de 28 ratas) cerca del ciclo de estro asociado con cambio...

Discusión

Debido a las modificaciones procesales y resolución de problemas que era necesario en este estudio, a pesar de nuestro objetivo de identificar todas las fases del estro ciclo en ratas utilizando ultrasonido, fuimos incapaces de encontrar diferencias significativas. Presumimos que estas dificultades pueden ser porque el ciclo estral dura sólo unos días en ratas, a diferencia del ciclo en las mujeres. Estamos seguros que todas las mediciones se realizaron en exactamente el momento adecuado para determinar las diferencia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system*	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit.	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD	Envigo, inc.		Rat strain
Lubricating Gel	General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System	Cibertec S.A		Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)	General Supply
Isoflurane	Esteve Veterinaria		Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.