Detección de déficits conductuales en ratas después de la lesión cerebral traumática

Resumen

El objetivo de las pruebas de comportamiento presentada aquí es detectar déficits funcionales en ratas después de la lesión cerebral traumática. Cuatro pruebas específicas se presentan que detectan déficits en conductas que reflejan el daño a áreas específicas del cerebro que a veces se extiende hasta un año después de la lesión.

Resumen

Con la mayor incidencia de lesión de cerebro traumática (TBI) en poblaciones civiles y militares, TBI ahora se considera una enfermedad crónica; sin embargo, pocos estudios han investigado los efectos a largo plazo de las lesiones en modelos de roedores de TBI. Se muestra aquí son medidas conductuales que están bien establecidas en la investigación TBI para tiempos temprano después de la lesión, como dos semanas, hasta dos meses. Algunos de estos métodos se ha utilizado anteriormente en tiempos posteriores después de la lesión, hasta a un año, pero por muy pocos laboratorios. Los métodos demostraron aquí son una corta evaluación neurológica para probar reflejos, un equilibrio de viga a prueba de equilibrio, un paseo de la viga prueba de equilibrio y coordinación motora y una versión de la memoria de trabajo del laberinto de agua de Morris que puede ser sensible a los déficits en memoria de referencia. Ratas macho se manejaron y previamente entrenados para neurológica, equilibran y coordinación motora pruebas antes de recibir parasagital percusión fluido (FPI) o lesiones sham. Las ratas pueden ser probadas en la evaluación neurológica corto (neuroscore), el equilibrio de viga y la viga-caminata varias veces, durante la prueba en el laberinto de agua sólo se puede hacer una vez. Esta diferencia es porque las ratas pueden recordar la tarea, confundiendo así los resultados si se repite la prueba se intenta en el mismo animal. Cuando la prueba de uno a tres días después de la lesión, se detectaron diferencias significativas en todas las tareas no-cognitivos tres. Sin embargo, las diferencias en la tarea de paseo de la viga no eran perceptibles en más puntos del tiempo (después de 3 meses). Déficits fueron detectados en 3 meses en el viga de Balance y a los 6 meses en el neuroscore. Déficits en memoria de trabajo se detectaron a 12 meses después de lesión, y un déficit en la memoria de referencia apareció por primera vez a los 12 meses. Así, pruebas de comportamiento estándar pueden ser medidas útiles de déficits conductuales persistentes después de FPI.

Introducción

Los métodos presentados aquí están diseñados para detectar déficits funcionales en áreas específicas del cerebro inducidas por un modelo experimental de TBI en la rata. Se describen cuatro pruebas de comportamiento diferente. En primer lugar, la evaluación neurológica corto, conocida como el neuroscore, se puede realizar sin necesidad de cualquier equipos especializados pero requiere práctica; Esta prueba detecta déficit en los reflejos. En segundo lugar, la prueba de equilibrio de viga detecta déficit en la capacidad de equilibrio. Esta tarea requiere el controlador a la rata basada en una escala ordinal y requiere cierto entrenamiento del controlador. La prueba de equilibrio de viga requiere un haz estrecho y es sensible a los déficits en el sistema vestibular. La tercera prueba evalúa coordinación vestibulomotor. Esta prueba es conocida como la tarea de la viga-a pie, y aunque algún entrenamiento previo de la rata se requiere, este procedimiento es más objetivo que las dos anteriores ya la latencia para atravesar la viga es una medida objetiva que no depende de la puntuación subjetiva. Esta diferencia es porque se mide el tiempo para atravesar un haz estrecho para llegar a una caja de seguridad. La prueba de caminata de la viga requiere un rayo más largo del viga de Balance, así como una caja de escape. Esta prueba mide el déficit en la coordinación motora y equilibrio y por lo tanto es sensible a los daños al cerebelo y áreas del cerebro relacionadas con motor. La versión de la memoria de trabajo del laberinto de agua de Morris (MWM-WM) principalmente pruebas de integración con la corteza prefrontal o la función ejecutiva y función hipocampal. La versión del laberinto acuático de Morris que se muestra puede emplearse para detectar déficits en la memoria de referencia¹.

Estos métodos fueron elegidos en base a su historial bien establecido en la literatura. Cada uno ha sido eficaz en muchas manos desde diferentes laboratorios con múltiples cepas de ratas durante numerosos años de investigación. Sin embargo, en el pasado, después de la lesión mide hasta dos semanas después de que lesión se consideraron puntos de tiempo "crónica". Por lo tanto, para establecer técnicas conductuales para el estudio de los efectos crónicos de TBI en roedores, estos métodos bien conocidos necesarios para evaluar la sensibilidad para detectar TBI inducida por déficits en más puntos del tiempo después de la lesión. Mientras que ahora hay varios modelos de roedores de TBI, el modelo FPI es uno de los más utilizados y se aplica en este estudio. Este modelo fue publicado por primera vez en los años 50², y desde entonces, más de 1.000 documentos han empleado FPI en ratas³. La neuropatología de este tipo de lesiones ha sido bien descrita por nosotros⁴ y otros^5,6,7. Brevemente, lesión neuronal en el hipocampo se ha demostrado para ser dependiente de la dosis utilizando Fluoro-Jade tinción en tiempos cortos después de la lesión, es decir, 24-48 h; mientras que bruto atrofia y cavitación incluyendo adelgazamiento de la cápsula interna y la corteza se ha divulgado en un año después de lesión^6,7.

La representación más significativa de la función cerebral se evalúa mediante el uso de medidas de resultado conductuales después de una lesión cerebral experimental. Sin embargo, la gran mayoría de los experimentos FPI que utilicen medidas de resultado conductuales hace medidas relativamente temprano, típicamente de 1 a 14 días después de la lesión. Utilizando los métodos demostró aquí, que algunos déficits conductuales se pueden detectar a 12 meses después de la lesión¹. Función neurológica, función de vestibulomotor gruesa y coordinación motora fina se evaluaron en los días después de la lesión (PIDs) 1-3 y en 3, 6 y 12 meses después de la cirugía, mediante una evaluación neurológica corto (Neuroscore; modificado de Schallert⁸), la Balanza de astil tarea y el paseo de la viga tarea^9,10,11. Referencia y memoria de trabajo se evaluaron utilizando una versión de la memoria de trabajo de Morris agua laberinto^1,12,13.

Protocolo

Todos los experimentos con animales son primero aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad del rama médico de Tejas, Galveston, Texas como dirigido por los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (8ª edición, Consejo Nacional de investigación).

1. cirugías y percusión líquido LCT

1. Obtener adultos macho 300 g ratas Sprague-Dawley de un vendedor y Casa dos por jaula con comida y agua ad libitum en un vivero con condiciones constantes: ciclo ligero (h 600 a 1.800 h), temperatura (21 ° C a 23 ° C) y humedad (40-60%).
2. Antes de la cirugía, manejar las ratas de tres a cinco días y luego tren las ratas para la Neuroscore, viga de Balance y procedimientos de paseo de la viga de uno a tres días antes de la evaluación inicial. Realizar la evaluación inicial ya sea de día o de mañana antes de la cirugía.
   Nota: Siempre preparar las ratas control, funcionada como farsa o quirúrgico ingenuo ratas de la misma manera que recibirá una herida y, al azar o de manera equilibrada, las ratas del grupo en los grupos de tratamiento.
3. Realizar la cirugía en condiciones asépticas (instrumentos estériles, batas quirúrgicas limpias, guantes estériles, mascarillas y cubiertas de la cabeza).
4. Anestesiar ratas con isoflurano al 4% para la inducción y 1.5-2% para mantenimiento. Intubar y ventilar mecánicamente las ratas (uso de isoflurano en aire: oxígeno (70: 30) y prepararse para parasagital de líquido-percusión anteriormente descrito^14,15.
5. Infiltrarse en sitios de la herida con 0.10% bupivicane antes de suturar y supositorio rectal acetaminofén (120 mg/kg) antes de despertar de la anestesia. Controlar las ratas durante al menos 4 horas durante el período de recuperación y al día siguiente para detectar signos de infección, lesión neurológica severa (por ejemplo parálisis) o malestar severo (e.g. la posición persistente Lirón).
   Nota: Las ratas exhibe cualquiera de estos síntomas debe eutanasia (4% isoflurano en una cámara anestésica seguida de la decapitación).

2. Neuroscore formación y pruebas

1. Formación de Neuroscore
   1. Para la formación en las ratas que se sabe que experimentalmente ingenuo, ejecutar a través de las pruebas en el siguiente orden (medidas 2.2.1-2.2.5) desde el principio hasta el final, volver a casa jaula durante 1 minuto y, a continuación, repita hasta que se consigue una puntuación de cero.
   2. Puntuaciones de la marca en la hoja de puntuación para un registro de los ensayos de entrenamiento para cada rata. Después del entrenamiento, realizar una sesión de prueba (véase abajo) en el mismo día o el siguiente.
      Nota: Si la sesión de prueba produce una puntuación de cero para la línea base, entrenamiento y la prueba pueden ser repetidas o la rata puede ser desviada a un experimento de comportamiento no.
2. Neuroscore prueba
   Nota: A través de las pruebas en el orden siguiente, regreso a casa jaula durante 1 minuto, luego repetir dos veces para un total de tres veces.
   1. Prueba de flexión del miembro anterior
      1. Levante la rata por la cola y sostenga cerca de 6 a 12 pulgadas sobre la superficie de la mesa.
      2. Observar si la rata se extiende o flexiona las extremidades anteriores. Anotar la presencia de flexión (1) o ausencia (0).
         Nota: La flexión es anormal. Puntuación posible de 1 x 3 = 3 (Total posible = 3).
   2. Prueba de flexión del miembro posterior
      1. Levante la rata por la cola y sostenga cerca de 6 a 12 pulgadas sobre la superficie de la mesa.
      2. Observar si la rata se extiende o flexiona posteriores. Anotar la presencia de flexión (1) o ausencia (0).
         Nota: La flexión es anormal. Puntuación posible de 1 x 3 = 3 (posible Total acumulado = 6).
   3. Visualmente activa prueba de colocación
      1. Levante la rata por la cola.
      2. Lentamente baje la rata hacia el borde de la mesa hasta que la nariz es de unos 10 cm del borde.
      3. Mover la rata lentamente hacia el borde (no se permiten los bigotes tocar el borde).
      4. Observar si la rata alcanza y extiende a patas delanteras hacia la mesa. Anotar la presencia (0) o ausencia (1) de extender las patas delanteras.
         Nota: Llegar a la mesa en respuesta a señales visuales es normal. Puntuación posible de 1 x 3 = 3 (posible Total acumulado = 9).
   4. Contacto accionado prueba de colocación
      1. Sostenga a la rata, con el cuerpo en la mano, paralelo al borde de la mesa y sin patas delanteras.
      2. Lentamente baje la rata hacia el borde de la mesa hasta que el bigotes en una cara toquen el borde de la mesa.
      3. Observar si la rata extiende el miembro anterior en el mismo lado que el bigotes que se toque la mesa hacia el borde de la mesa tan pronto como toquen el bigotes.
         Nota: El desencadenamiento de esta respuesta requiere práctica considerable y los investigadores deben estar bien entrenados para realizar esta prueba constantemente.
      4. Anotar la presencia (0) o ausencia (1) de llegar hacia la mesa.
         Nota: Llegando en respuesta a la estimulación táctil es normal. Puntuación posible de 1 x 3 = 3 (Total posible = 12).
      5. Repita los pasos 2.2.4.1-2.2.4.4 para el lado opuesto. Puntuación posible de 1 x 3 = 3 (posible Total acumulado = 15).
   5. Prueba reflejo agarre Hindpaw
      1. Sostenga la rata en la una mano con dedos pulgar e índice alrededor del pecho bajo los miembros anteriores.
      2. Toque suavemente la palma de la uno hindpaw con el otro dedo índice.
      3. Observar si la rata toma el dedo índice. Anotar la presencia (0) o ausencia (1) de aferramiento.
         Nota: Aferramiento es normal. Puntuación posible de 1 x 3 = 3 (Total posible = 18).
      4. Repita los pasos 2.2.5.1-2.2.5.3 para el lado opuesto. Puntuación posible de 1 x 3 = 3 (Total posible = 21).
   6. Puntuación
      1. Suma las puntuaciones para un posible total de 7 x 3 = 21. Una puntuación de cero es normal.

3. equilibrio de viga entrenamiento y pruebas

1. Equipo
   1. Uso de un haz de 60 cm de longitud, 1,75 cm de ancho, 4,0 cm de altura, había situado 90 cm del suelo, con una barrera de 30 cm de altura, 30 cm de ancho. Asegure la viga a una tabla con la barrera unida por lo 50 cm de la viga sobresale de la barrera, lejos de la mesa.
   2. Coloque una caja acolchada debajo de la viga para suavizar el impacto de las ratas que caen.
2. Formación de la viga de Balance
   1. A las 24-48 h antes de la cirugía, colocar la rata en la viga de prueba s 60.
   2. Si la rata no equilibrar por sí mismo, permite la rata caiga en la caja de seguridad.
   3. Empezar a cronometrar cuando la rata se coloca firmemente en la viga.
   4. Observar la rata de 60 s periodo y tasa de su funcionamiento basado en la siguiente escala: 1 = muestra equilibrio estable (novio, camina, intenta subir la barrera), 2 = muestra equilibrio inestable (agarra los lados de la viga o movimientos inestables), 3 = intenta equilibrar pero se desliza o r gira sobre la viga, se cuelga en por abrazar la viga, 4 = trata de equilibrio, pero cae después de 10 s, 5 = cuelga sobre o de la viga y se cae apagado en menos de 10 s, 6 = caídas apagado, no haciendo ningún esfuerzo para equilibrar o colgarse de la viga.
   5. Anote el resultado en la hoja de cálculo.
   6. Permitir que la rata a descansar por 15 s en jaula casera, repita pasos 3.2.1-3.2.5 hasta que la rata alcanza tres puntuaciones de 1 o 2. La rata se considera entonces entrenado.
   7. Realizar una evaluación previa a las 24 h o en el día de la cirugía antes de la cirugía.
3. Prueba de equilibrio de viga
   1. A partir de 24 h después de la cirugía y continuar durante 4 días, prueba todos los días las ratas.
      1. Colocar la rata en la viga e iniciar el temporizador. Observar la rata cerca de 60 s. registro la puntuación en la hoja de cálculo.
      2. Volver la rata en la jaula casera durante un breve descanso (1-3 min).
      3. Repita los pasos 3.3.1.1-3.3.1.2 para un total de tres pruebas.

4. Haz caminata entrenamiento y pruebas

1. Equipo
   1. Utilizar una viga de madera 100 cm de longitud, 2,5 cm de ancho y 4,0 cm de altura.
   2. Preparar un soporte ajustable, una mesa ajustable y cuatro clavijas, 2 cm de altura y un gol negro caja 28 cm de largo, 18 cm de altura y 18 cm de ancho, con una abertura en un extremo suficientemente grande para que la rata pase a través.
   3. Conecte el extremo blanco de la viga para el lado abierto de la caja de gol que se coloca sobre la mesa ajustable. Coloque el generador de luz y ruido blanco brillante cerca del extremo inicial de la viga. El extremo inicial de la viga se fija en el soporte ajustable para que la viga y la caja están en el mismo nivel, alrededor de 1 m por encima del piso.
2. Formación a pie de viga
   1. Inicio formación de 24-48 h antes de la cirugía.
   2. Colocar la rata en la caja de gol durante 1 minuto. Después de 1 minuto, quite la rata y comience el juicio.
   3. Para iniciar el juicio, encender la luz y el ruido blanco y colocar la rata en la viga en el lugar del agujero de la clavija más cercana a la caja de gol y permitir que la rata entrar en la caja de gol.
   4. Cuando las patas delanteras de la rata cruzan el umbral de la caja de gol, inmediatamente Apague las fuentes de luz y al ruido (esto es el final de un ensayo).
   5. Permitir que la rata en la caja de gol por 30 s entre cada ensayo.
   6. Repita el procedimiento en 4.2.3-4.2.5 paso dos veces en cada clavija y de la posición inicial. Inserte las clavijas en los agujeros y correr a pie la viga completa uno con las clavijas en su lugar.
   7. Ejecute tres ensayos de viga-paseo cronometrados.
      1. Quite la rata de la caja de gol. Encender la luz y el ruido blanco y poner en marcha el cronometro al colocar la rata en la viga. Detener el cronómetro inmediatamente cuando cruzan el umbral de la caja de gol patas delanteras de la rata y luego inmediatamente a la luz y el ruido.
      2. Registrar la hora en la hoja de cálculo.
      3. Repita los pasos 4.2.7.1-4.2.7.2 hasta que la rata ha logrado tres veces de 5 s o menos. La rata se considera capacitado.
3. Paseo de la viga de la evaluación inicial
   1. En el día o la mañana antes de la cirugía, hacer tres ensayos cronometrados con clavijas en su lugar.
   2. Comience por colocar la rata en la caja de gol para 30 s. quita la rata de la caja de gol y a su vez en el ruido blanco y la luz. La rata al poner en el inicio de la viga y simultáneamente iniciar el cronómetro. Patas delanteras de la rata cruzan el umbral de la caja de gol, inmediatamente Apague las fuentes de luz y ruido y detener el temporizador.
   3. Registrar la hora en la hoja de cálculo. Permitir que la rata en el cuadro de objetivo de 30 s.
   4. Repita pasos 4.3.2-4.3.3 hasta tres latencias se registran en la hoja de cálculo. Volver la rata en la jaula casa finalizada tres ensayos cronometrados.
4. Viga-paseo de prueba
   1. Prueba de las ratas diariamente a partir de 24 h después de la cirugía y continuando hasta 4 días. Realizar tres ensayos cronometrados como en los pasos 4.3.

5. trabajo memoria laberinto de agua

1. Equipo
   1. Uso un tanque lleno de agua hasta una altura de 28 cm y mantenido a 26 ± 1 ° C.
   2. Utilizar una plataforma de vidrio acrílico transparente que es de 10 cm de diámetro en un soporte de 26 cm de altura.
      Nota: Se deberá cubrir la superficie de la plataforma con el silicio en forma de un círculo con una X a través de él. Esto permite a las ratas subir a la plataforma y les da tracción por lo que no se salga.
   3. Se reúnen un cronómetro, una lámpara de calor, toallas desechables, absorbentes, jaulas adicionales y una red de los pescados acuario pequeño y mango largo. Utilice un video computarizado sistema conectado a una cámara de vídeo para grabar la natación de rata y enviar los datos a la computadora. Guardar el vídeo y los datos en el ordenador para su posterior análisis.
2. Pruebas de laberinto de agua de memoria de trabajo
   1. Dar las ratas cuatro pares de ensayos cada día por cinco días consecutivos, colocar la plataforma en cada uno de los cuatro cuadrantes y empezar las ratas de cada uno de los cuatro puntos de partida (N, S, E, W) como se describe a continuación.
   2. En primer lugar definir los pares ubicación plataforma comienza a utilizarse durante todo el experimento.
      Nota: El orden de los cuadrantes donde la plataforma se encuentra y el punto de partida utilizadas en un orden diferente para cada uno de los cinco días de la natación, pero el mismo para cada rata.
      1. Utilizar cuatro puntos de partida (N, S, E o W) y cuatro lugares de la plataforma (cuadrantes 1, 2, 3 o 4; Figura 1). Por ejemplo, (N, 2; E, 4; S, 1; W, 3; Ver figura 1). Plan de un orden equilibrado (no al azar) para evitar puntos de partida demasiado cerca de las plataformas (No punto de partida es el mismo cuadrante como la ubicación de la plataforma). Configurar una hoja de datos usando los cuadrantes de la plataforma y cuatro puntos de partida.
      2. Escribir un protocolo para el vídeo que sigue el software a utilizar en orden a video las ratas nadando y para recoger datos especificados (p. ej., duración de la natación, velocidad, distancia recorrida antes de encontrar la plataforma).
         Nota: El software de seguimiento se detendrá automáticamente la grabación después de la duración especificada. El protocolo debe permitir para especificar donde se encuentra la plataforma, cómo muchos ensayos a ejecutar por animal, y cómo muchos animales se probará por sesión, y también la duración máxima permitida (por ejemplo, 120 s).
      3. Prueba de las ratas de 4-6 por sesión.
         Nota: más de 6 ratas crean un problema en la sincronización entre las ratas y pueden conducir a error por el controlador. Las cajas de calentamiento también se llena de gente.
   3. Ensayo 1
      1. Abra el vídeo software de rastreo y cargar el protocolo correcto incluyendo el mapa del laberinto de agua.
      2. Coloque la plataforma en el lugar asignado (por ejemplo, 2; Figura 1) y comprobar que coincide con el mapa en el software. Preparar el software de seguimiento para iniciar cuando la rata entra en el campo de visión de la cámara.
      3. Colocar la rata en el tanque de cara a la pared en la ubicación asignada (p. ej., N; Figura 1) e inmediatamente iniciar el temporizador.
      4. Permiten la s ratas 120 encontrar la plataforma. Cuando la rata encuentra la plataforma, el temporizador y el tiempo en la hoja de registro. Si la rata no puede encontrar la plataforma, lo conducen a la plataforma con la mano y grabar 120 s. permitir la rata 15 s para permanecer en la plataforma.
   4. Ensayo 2
      1. Compruebe que el software está listo para el juicio 2. Vuelva a colocar la rata en el tanque en la misma posición partida (N). Repita el paso 5.2.3.4.
   5. Después del ensayo 2, colocar la rata en el recinto caliente durante 4 minutos mover la plataforma en la segunda ubicación (4; Figura 1) y comprobar que coincide con el mapa en el software.
   6. Repetición de prueba de 1 y 2 procedimientos (pasos 5.2.3-5.2.4) hasta los cuatro a partir de ubicación/plataforma emparejamientos se terminan.

6. Análisis de datos

1. Neuroscore
   1. Transferir manualmente los resultados manuscritos en una hoja de cálculo de computadora.
   2. En resumen los resultados de cada ensayo obtener tres puntuaciones por rata en cada día.
   3. Formato de los datos para el análisis estadístico (ya sea en el formato largo o ancho dependiendo de la preferencia de software).
      Nota: La forma larga tiene una sola columna para el tratamiento (en este caso, rellena con "Ingenuo", "Impostor" o "TBI"), una sola columna por día (en este caso "0", "1", "2" o "3") y una sola columna para juicio ("1", "2" o "3"). El formato ancho tiene una sola columna para cada combinación de niveles del factor (para una sola columna para ingenuos, día 0, 1 ensayo, otra columna para ingenuos, día 0, prueba 2, etc.)
   4. Promedio de la puntuación para cada animal en cada día. Puesto que había tres pruebas realizadas en cada jornada habrá tres valores para cada animal por día.
   5. Evaluar si los datos se distribuyen normalmente. Uso que una no paramétrica estadística (e.g., Kruskal-Wallis) prueba para analizar si el puntaje de cada día es diferente entre los grupos. En este caso, ya que estos datos no son continuos, no están normalmente distribuidos.
   6. Para determinar dónde radican las diferencias, hacer pruebas post-hoc , como el análisis de post-hoc de Tukey.
      Nota: Aquí, el software estadístico R paquete¹⁶, la función Kruskal.test() y la posthoc.kruskal.nemenyi.test dentro de los pares múltiples comparación de decir filas paquete (PMCMR)¹⁷ fueron utilizados.
   7. Además, prueba a ver si hay alguna diferencia entre días dentro de cada grupo.
      Nota: por ejemplo, para ver si los animales simulada se comportan diferentemente en el día 0 en comparación con el día 1, día 2 o día 3. Para ello, ejecute una unidireccional medidas repetidas ANOVA. Esto se puede lograr en R usando la función ezANOVA dentro del paquete de ez.
   8. Para ejecutar un ANOVA de medidas repetidas, compruebe primero el supuesto de esfericidad.
      Nota: Aquí, los datos indican que el en factor (día) hace cumplir con el supuesto de esfericidad para INGENUO y falso, pero no para TBI. Por lo tanto, una corrección no es necesaria para INGENUOS o farsa. Para los datos TBI, utilice la corrección de Greenhouse-Geisser.
   9. Si se encuentran diferencias significativas, realizar una prueba post-hoc para determinar dónde radican las diferencias. Esto se logra en R usando los pares t-función de prueba. Parcela los resultados como un diagrama de caja, como se muestra en los resultados representativos (figura 2).
2. Balanza de astil
   1. Transferir manualmente las partituras manuscritas a una hoja de cálculo de computadora. Formato de los datos para el análisis estadístico (ya sea en formato ancho o largo dependiendo de la preferencia de software). Ver nota en paso 6.1.3.
   2. Promedio de las puntuaciones para cada rata en cada día para que cada rata tendrá 1:20 por día. Para probar si el puntaje de cada día es diferente entre INGENUO, SHAM y TBI, evaluar si los datos se distribuyen normalmente.
      Nota: en este caso, puesto que los datos no son continuos, estos datos no están normalmente distribuidos. Por lo tanto, utilizar una prueba estadística no paramétrica (por ejemplo, la prueba de Kruskal-Wallis).
   3. Para determinar dónde radican las diferencias, hacer pruebas post-hoc , p. ej., análisis de post-hoc de Tukey. Para comprobar las diferencias entre días dentro de cada grupo de tratamiento, ejecución repetido de un solo sentido medidas ANOVA (ver paso 6.1.7). Comprobar la hipótesis de esfericidad.
      Nota: En este estudio, los datos indican que el factor (día) no cumple con el supuesto de esfericidad para cualquiera de los grupos, tan usado corrección de continuidad. Utilice la corrección de continuidad de invernadero Grier.
   4. Representar los resultados en un diagrama de caja como se muestra en los resultados representativos (figura 3).
3. Paseo de la viga
   1. Transferir manualmente resultados manuscritas en una hoja de cálculo de computadora. Promedio de las latencias de viga a pie tres para cada animal para cada día. Formato de los datos para el análisis estadístico (ver paso 6.1.3).
   2. Evaluar si los datos se distribuyen normalmente.
      Nota: en este caso, los datos es continuos y se distribuyeron normalmente. Por lo tanto, utilizar un ANOVA unidireccional para determinar si la latencia de cada día es diferente entre ingenuo, SHAM y TBI.
   3. Para ver si existe alguna diferencia entre días dentro de un grupo de tratamiento, ejecute un unidireccional medidas repetidas ANOVA. Primero Verifique el supuesto de esfericidad.
      Nota: En este estudio, los datos indican que el factor (día) no cumple con el supuesto de esfericidad para cualquiera de nuestros grupos, por lo que se utilizan las correcciones de la continuidad. Utilice la corrección de Greenhouse-Grier.
   4. Representar los resultados en un diagrama de caja como se muestra en los resultados representativos (figura 4).
4. Laberinto de agua de memoria de trabajo
   1. Transferir los datos del hoja de cálculo o seguimiento de programa informático a una hoja de cálculo. Seleccionar los resultados a ser analizados.
      Nota: Muchos resultados posibles están disponibles para el análisis de seguimiento de programas de ordenador. Ejemplos de resultados seleccionados para análisis pueden incluir: latencia, longitud de la ruta, thigmotaxia y velocidad de nado. Más comúnmente informaron resultado latencia, como en el ejemplo proporcionado.
   2. Formato de los datos para el análisis estadístico (ya sea en formato ancho o largo dependiendo de la preferencia de software).
      Nota: La forma larga tiene una sola columna para el tratamiento (en este caso, rellena con "Ingenuo", "Impostor" o "TBI"), una sola columna por día (en este caso "1", "2", "3", "4" o "5") y una sola columna de ensayo (ya sea "1", "2", "3", "4", "5" "6", "7" o "8"). También necesitamos una columna adicional para identificar el intento ("1" o "2"). Gran formato tiene una sola columna para cada combinación de niveles del factor (por ejemplo, una sola columna para ingenuos, día 1, 1, intento ensayo 1, otra columna para ingenuos, día 1, prueba 2, intento 2). También, la diferencia entre la prueba 1 y 2 de la prueba puede ser calculada para cada sesión y analizada como una escala de diferencia.
   3. Para encontrar si hay una diferencia general entre los grupos de lesiones, siga los siguientes pasos.
      1. En primer lugar, promedio de la latencia del laberinto de agua para cada animal para 1 día.
         Nota: Hubo cuatro sesiones cada día, así que media los cuatro valores por animal para cada uno de ensayo 1 y 2 de la prueba. Hacer este cálculo para los restantes días así.
      2. Para comprobar las diferencias de la lesión total, ejecutar un dos vías medidas repetidas ANOVA. Hay dos factores, la lesión y el día. La lesión es una entre el factor grupo y día es un factor de grupo. Nota: Aquí R fue utilizado.
      3. Si los resultados indican una diferencia significativa debido a una lesión, a continuación, ejecute un post-hoc de Tukey para ver dónde radican las diferencias.
   4. Para buscar hacia fuera si hay diferencias entre los grupos de lesiones en días específicos realice los siguientes pasos.
      Nota: Día 1 se utiliza como un ejemplo, y el mismo análisis debe hacerse para los siguientes días. Además, este análisis se realiza de varias maneras, primero para el ensayo 1, segunda para Trial 2 sólo y la terceros la diferencia entre la prueba 1 y 2 de ensayo. Ensayo 1 se utiliza como un ejemplo; los mismos pasos que deba ser utilizado para otros análisis.
      1. En primer lugar, promedio de la latencia del laberinto de agua para cada animal para 1 día. Puesto que había cuatro repeticiones de "Prueba 1" cada día, un promedio de los cuatro valores para cada animal.
      2. Evaluar si los datos se distribuyen normalmente.
         Nota: en este caso, los datos es continuos y se distribuyeron normalmente. Por lo tanto, utilizar el ANOVA de una vía para determinar si la latencia de laberinto de agua el día 1 es diferente entre INGENUO, SHAM y TBI. Paquete de software estadístico R y la función de aov() fueron utilizados aquí.
      3. Utilice un nivel de significancia de 5%. Si la resultante p-value es menor que 0.05, luego existen diferencias significativas entre los grupos.
      4. Para determinar dónde radican las diferencias, utilice el post-hoc de Tukey. Esta es la función de TukeyHSD() en R.
   5. Para averiguar si hay diferencias entre los días dentro de los grupos de tratamiento, siga estos pasos.
      1. En primer lugar, ejecute un unidireccional medidas repetidas ANOVA. Esto se puede lograr en R usando la función ezANOVA dentro del paquete de ez.
      2. Antes de ejecutar un ANOVA de medidas repetidas, compruebe primero el supuesto de esfericidad.
         Nota: El en factor cumple (día) el supuesto de esfericidad para todos los grupos, por lo tanto no es necesario utilizar corrección de continuidad.
      3. Si se observan diferencias entre días (p-valores inferiores a 0,05), luego realizar una prueba post-hoc para determinar exactamente dónde radican las diferencias. Este paso se logra en R usando la función pairwise.t.test.
   6. Ver los resultados mediante gráficos de línea (figura 5). También, se puede graficar ensayo 1-ensayo 2.

Resultados

Resultados del procedimiento de neuroscore (figura 2) demuestran la posibilidad de falsos positivos (grupos SHAM y TBI en el día 0) y la sensibilidad de esta prueba para detectar pequeñas diferencias. Falsos positivos pueden ocurrir cuando la rata no es bien habituada al procedimiento, por lo que no es completamente relajado. Día 0 es antes de la cirugía, idealmente que todas las ratas deben alcanzar el criterio de una puntuación de 0 antes de entrar en un estudio. Días 1-3 demuestran la sensibilidad de esta prueba para detectar pequeños cambios en la puntuación. Si bien hay un potencial para una puntuación tan alta como el 21, puntuaciones superiores a 3 son inusuales en este modelo. En este ejemplo, repetido medidas ANOVA no revelaron ninguna diferencia entre días de INGENUO (p = 0,78) o simulado (p = 0.09); sin embargo, para el grupo de TCE se encontraron diferencias entre días (p < 0.05). Comparación pares de post-hoc indicaron que día 0 es significativamente diferente de los días 1, 2 y 3. Este resultado demuestra que la lesión produce cambios pequeños pero significativos en la evaluación neurológica.

Posterior análisis mediante la prueba de Kruskal-Wallis comparó INGENUO, SHAM y TBI cada día, seguida de post-hoc de Tukey para determinar exactamente dónde radican las diferencias. Para el día 0, la estadística de prueba fue de 13.37, p = 0,001, y farsa era perceptiblemente diferente del INGENUO (p = 0,008). Idealmente, no debería haber ninguna diferencia entre grupos en el día 0, como se han administrado sin tratamientos o procedimientos. En este caso, las ratas deben más habituadas al procedimiento, o transferidas a un estudio de comportamiento no. Para el día 1, la estadística de prueba fue 32.39, p = 9.75e-8, con la prueba post-hoc , indicando que la farsa y TBI fueron significativamente diferentes de INGENUO (p = 0,002, p = 5.9e-7, respectivamente). Para el día 2, la estadística de prueba fue 23.39, p = 8.34e-6 y SHAM y TBI eran diferentes de INGENUO (p = 0,002, p = 6.8e-5). Para el día 3, la estadística de prueba fue de 38.4, p = 4.59e-9, y otra vez, SHAM y TBI fueron significativamente diferentes de INGENUO (p = 0.001, p = 2.1e-8, respectivamente). Estos resultados apuntan al hecho de que la preparación de la farsa también produce algunos déficits en la evaluación neurológica en ocasiones después de lesión.

Representante de la viga de Balance resultados (figura 3) demuestran la sensibilidad de la prueba de equilibrio de viga a déficits poco después de la lesión (figura 3, izquierda) y en un momento ya después de la lesión (figura 3, derecha). La sensibilidad de la prueba de equilibrio de la viga a los efectos de la lesión cerebral disminuye con el tiempo, porque las ratas lesionadas edad y aumento de peso, han incrementado dificultad equilibrio en la viga. En momentos más adelante, el haz se activa para que las ratas están equilibrado en el lado más ancho de la viga. Sin embargo, por 6 meses después de lesión, esta prueba no es sensible a los efectos de la lesión como edad o peso confundir la capacidad para realizar la tarea (figura 3, derecha). Alternativamente, curación puede haber ocurrido en el sistema vestibular, y estos datos reflejan que la capacidad de las ratas para equilibrar alcanza el mismo nivel que los grupos de control.

Al comparar cada día ingenuo, SHAM y TBI, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. Los resultados para los puntos de tiempo temprano después de lesiones se muestran en la figura 3, a la izquierda. En el día 0, la prueba de Kruskal-Wallis encontró el valor de la estadística de prueba que 6,81, p = 0.033. Hubo una diferencia significativa entre los grupos, con la de post-hoc Tukey mostrando que el ingenuo grupo era diferente simulado (p = 0.038); sin embargo, los tres grupos tenían medios muy por debajo de 2.0, indicando que todas las ratas habían reunido los criterios a seguir. Sería preferible que no diferencias entre grupos en el día 0, pero ya que todos los grupos están por debajo de 2, puede continuar en el estudio. El PID 1, la estadística de la prueba de Kruskal-Wallis fue 69.72, p = 7.25e-16. El post-hoc de Tukey mostró que el grupo de TCE fue significativamente diferente de la ingenua y la farsa de grupos (p = 4.9e-14, p = 9.1e-08, respectivamente). El día 2, la estadística de la prueba de Kruskal-Wallis fue 62.84 y p = 2.26e-14, con la prueba post-hoc mostrando TBI diferente de INGENUO y simulado (p = 1.0e-10, p = 2.1e-10 respectivamente). El día 3, la estadística de la prueba de Kruskal-Wallis fue 62.69 y p = 2.44e-14. La prueba post-hoc mostró diferentes de ingenuo y farsa, TBI (p = 9.6e-12, p = 1.7e-08, respectivamente). Además miramos para ver si había alguna diferencia entre días dentro de cada grupo. Uso repetido medidas ANOVA, INGENUO, no hubo diferencias entre días (p = 0.367). Para farsa y TBI hubo diferencias entre días (p = 0,002, p = 3.90e-29, respectivamente). Post-hoc comparaciones pares reveladas para simulacro día 1 es significativamente diferente del día 2 y día 3 (p = 0.001, p = 0,01, respectivamente), y para TBI, día 0 es significativamente diferente de la forma días 1, 2 y 3 (p < 2e-16, p = 5.5e-16 y p = 2.7e-13, respectivamente). Día 1 también es significativamente diferente de 3 días (p = 0,036).

A los 6 meses después de lesión, se realizaron comparaciones entre INGENUO, SHAM y TBI cada día utilizando la prueba de Kruskal-Wallis (figura 3, derecha). En el día 0, el valor de la estadística de prueba fue 3.36 y p = 0.187, así que no hubo diferencias en el día 0. Todos los medios estuvieron por debajo de 2, indicando que todas las ratas y los grupos cumplieron con los criterios a seguir en el estudio. La estadística de prueba fue el PID 1, 6.11, p = 0.047; sin embargo, el análisis post-hoc mediante la prueba de post hoc de Tukey demostró que ninguno de los grupos fueron significativamente diferente al contabilizar múltiples pruebas de hipótesis. El día 2, la estadística de prueba fue de 4.09, p = 0,13, ns, y el día 3, la estadística de prueba fue 2.91, p = 0,23, ns. Por lo tanto, no hubo diferencias entre los grupos de lesiones en cualquier día dado.

Además, observar las diferencias entre días dentro de los grupos de tratamiento, un ANOVA de medidas repetidas revelaron diferencias significativas entre días para INGENUOS, SHAM y TBI (p = 0.0003, p = 2.61e-5, p = 5.59e-7, respectivamente; Figura 3, derecha). Pruebas post-hoc demostraron las siguientes diferencias. Para INGENUOS, día 0 fue significativamente diferente de los días 1, 2 y 3 (p = 0,002, p = 0.044, p = 0,004, respectivamente). Para la farsa, todos los días fueron significativamente diferentes entre sí: día 0 fue significativamente diferente de los días 1, 2 y 3 (p = 0.0006, p = 0.001, p = 0,0006, respectivamente); Día 1 fue significativamente diferente de los días 2 y 3 (p = 0.031, p = 0,0006, respectivamente); y el día 2 fue significativamente diferente de 3 días (p = 0.044). Para TBI, es significativamente diferente de días 1, 2 y 3 día 0 (p = 0,0005, p = 0.0008, p = 0,0005, respectivamente).

Se muestran los resultados de la prueba de caminata de la viga en dos puntos del tiempo (figura 4). Similar al viga de Balance, esta prueba detecta déficit temprano después de la lesión (figura 4, izquierda). Sin embargo, a los 6 meses después de lesión, no hay diferencias significativas entre los grupos (figura 4, derecha), lo que sugiere curación ocurrieron en el grupo lesionado. Este resultado puede reflejar efectos de edad más avanzada y aumento de peso.

Para comparar INGENUO, SHAM y TBI cada día temprano después de la lesión, se utilizó un ANOVA unidireccional. No hubo diferencias en el día 0 (F = 0.859, p = 0.426) y todas las latencias por debajo de 5 s, indicando que todas las ratas cumplieron con los criterios a seguir en el estudio. El PID 1, hubo una prueba significativa estadística de 15.36, p = 1.18e-6. Prueba de post hoc de Tukey indicó una diferencia significativa entre LCT e INGENUO (p = 0.000004) y TBI y simulado (p = 0.0001). El día 2, hubo una diferencia significativa entre los grupos (F = 9.49, p = 0.0002). Pruebas post hoc revelaron diferencias entre LCT e INGENUO (p = 0.0002) y TBI y simulado (p = 0,005). El día 3, la estadística general de la prueba es igual a 6.27, p = 0.0025, indicando que existen diferencias entre los grupos. Post-hoc de Tukey demostró que otra vez, TBI era diferente de INGENUO y falso (p = 0,003, p = 0.035, respectivamente).

Utilizando una medida repetida unidireccional ANOVA, se analizaron diferencias entre días dentro de los grupos de tratamiento. En primer lugar se comprobó la hipótesis de esfericidad para cada grupo. El factor (día) no cumplía con el supuesto de esfericidad para los grupos INGENUO o simulado, por lo tanto la corrección de continuidad, invernadero Grier se aplicó a los grupos. Para la farsa, no hubo diferencias entre días (p = 0.066), INGENUO y TBI había (p = 0,006, p = 2.89E-7, respectivamente). Las comparaciones post-hoc mostró por INGENUO, la diferencia fue entre el día 0 y día 1 (p = 0.003). Para TBI, las diferencias fueron entre el día 0 y días 1, 2 y 3 (p = 9.2e-6, p = 0,0005, p = 0,002, respectivamente), y había una diferencia entre el día 1 y día 3 (p = 0,018).

6 meses después de lesión, no hubo diferencias significativas entre INGENUO, simulado o TBI en cualquier día (día 0, F = 0,315, p = 0.732; Día 1, F = 0,336, p = 0.717; Día 2, F = 0.5, p = 0,61; Día 3, F = 1.17, p = 0.322; Figura 4, derecha). Al comparar las diferencias entre días dentro de cada grupo, hubo una diferencia significativa en el grupo de TCE (p = 0,026), día 0 ser distinto a los días 1, 2 y 3 (p = 0,026, p = 0,002, p = 0.002). No hubo diferencias entre los días INGENUO o SHAM (p = 0.104, p = 0.063, respectivamente).

Datos de la versión de la memoria de trabajo del laberinto acuático de Morris se pueden graficar en una variedad de maneras. Aquí demostramos los resultados (figura 5, izquierda) de 3 meses y 12 meses (figura 5, derecha) después de lesión con línea de gráficas para representar el curso del tiempo y diagramas de caja para proporcionar un resumen general de los datos (figura 5, abajo). Podemos entonces visualizar comparaciones 1 ensayo y ensayo 2 comparaciones independientemente en cada día, así como diferencias general debido a una lesión. Latencias de ensayo 1 representan la memoria de referencia y Trial 2 latencias representan la memoria de trabajo.

Los datos de las ratas 3 meses después de la lesión se muestran en la figura 5, izquierda. Ensayo 1 (figura 5, superior izquierda), al comparar INGENUO, SHAM y TBI, sólo día 4 mostró una diferencia significativa entre los grupos (F = 4.12, p = 0.025), con el post-hoc de Tukey indica que TBI era diferente de INGENUO (p = 0.019). Ensayo 2 (figura 5, centro izquierda), había una diferencia significativa: el día 1 (F = 5,93, p = 0.006), con análisis post-hoc indicando que TBI era diferente de SHAM (p = 0,005). El ANOVA de medidas repetidas no se encontró una diferencia global entre grupos de lesiones a los 3 meses (p = 0,56). Estos resultados sugieren que estas ratas tienen déficit pequeño pero significativo en referencia, así como memoria de trabajo a los 3 meses después de lesión.

A los 12 meses después de lesión, comparación ensayo 1 ingenua, SHAM y TBI (figura 5, derecha), repetido medidas ANOVA demostraron un efecto general significativo de lesiones (F = 3.94, p = 0,03). Comparaciones de pares revelaron que TBI fue significativamente diferente de INGENUO y falso (p = 0,043 y p = 0.006., respectivamente) (figura 5, abajo a la derecha). Además, comparando grupos de lesiones en cada día, utilizando un ANOVA unidireccional, se detectó una diferencia significativa en el día 3 (F = 7.28, p = 0.003). Comparación post-hoc reveló que TBI era diferente de SHAM (p = 0.0018) (figura 5, arriba a la derecha). Para el ensayo 2, medidas repetidas ANOVA encontraron una diferencia significativa debido a una lesión (F = 3.97, p = 0,029), con post-hoc pares comparaciones detectar la diferencia entre LCT y simulado (p = 0,017) (figura 5 , abajo a la derecha). ANOVA unidireccional en cada día encontraron diferencias significativas en los días 2 y 4. El día 2 (F = 4.02, p = 0.028), post-hoc de Tukey determinó que TBI era diferente de SHAM (p = 0.023). En el día 4 (F = 4.12, p = 0.026), análisis post-hoc encontraron una diferencia entre LCT y simulado (p = 0.025) (figura 5, centro derecha).

Figura 1. Diagrama del laberinto de agua. Este diagrama muestra las localizaciones de la plataforma posibles (1, 2, 3, 4) y puntos de partida (N, S, E, W) para el laberinto de agua de Morris de memoria de trabajo. Las ratas se permiten dos ensayos de cada emparejamiento de ubicación/plataforma partida. Hay un intervalo entre ensayos de 15 s y 4 min el resto en una cámara de calentamiento entre pares de ensayos para un total de cuatro pares de ensayos para cada sesión diaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Resultados de la prueba de neuroscore Todas las ratas fueron capacitadas para tareas pruebas reflejas simples antes del día 0 (véase el texto para obtener más información sobre formación, pruebas y puntuación). Resultados se muestran como mediana (línea negra), primeras y terceros cuartiles (límites de caja) y 10^th y 90^º percentiles (barras de error). La media también se indica por las líneas rojas y los puntos como puntos negros. Se presentan datos para la línea de base de día 0 y días después de la lesión 1-3. Los resultados del post-hoc t-test para cada punto del tiempo se muestran en los gráficos: * p < 0.001 vs TBI día 0; ^ p < 0.001 vs mismo día INGENUO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Resultados de la prueba de equilibrio de viga Todas las ratas fueron entrenadas para equilibrar en la viga hasta que podría equilibrar por 60 s para tres ensayos consecutivos (Ver texto para detalles sobre capacitación, pruebas y puntuación). En pruebas posteriores, las ratas se calificaron en una escala de 1 a 6 con 1 que significa el equilibrio normal y 6 lo que significa ningún intento de permanecer en la viga. Resultados se muestran como mediana (línea negra), primeras y terceros cuartiles (límites de caja) y 10^th y 90^º percentiles (barras de error). La media también se indica por las líneas rojas y los puntos como puntos negros. Se presentan datos para la línea de base de día 0 puntuación, días después de la lesión (izquierda) 1-3 y 6 meses después de la lesión (derecha). Los resultados del post-hoc t-test para cada punto del tiempo se muestran en los gráficos. Días 0-3: * P < 0.001vs TBI día 0; ^ p < 0,001 vs mismo día INGENUO; @ p < 0.001 vs mismo día simulado. De 6 meses: * p < 0.001vs TBI día 0; # p < 0.001 vs ingenuidad día 0; & p < 0.001 vs impostor día 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Resultados de la prueba a pie de viga Todas las ratas fueron entrenadas para atravesar la viga mientras que teje entre postes para escapar en una caja de seguridad. Fueron entrenados hasta que cumplían criterios de ≤ 5 s en tres ensayos consecutivos (Ver texto para detalles sobre capacitación, pruebas y puntuación). Prueba de línea de base se completó en el día 0 y las ratas fueron probadas posteriormente en los días 1-3 después de la lesión (izquierda). También fue el caso de un subconjunto de las ratas a los 6 meses después de la lesión (derecha). Los resultados se graficaron como mediana (línea negra), primeras y terceros cuartiles (límites de caja) y 10^th y 90^º percentiles (barras de error). La media también es indicada por las líneas rojas y los puntos como puntos negros. En los gráficos se muestran los resultados de las pruebas post-hoc para cada punto del tiempo. Días 0-3: * P < 0.001vs TBI día 0; ^ p < 0,001 vs mismo día INGENUO; @ p < 0,001 vs mismo día simulado; De 6 meses: * p < 0.001vs TBI día 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Resultados de la memoria de trabajo Morris laberinto de agua. Resultados se muestran para los grupos de ratas a los 3 meses (columna izquierda) y 12 meses (columna derecha). Los paneles superiores muestran las latencias promedio (tiempo que tardaron las ratas para encontrar la plataforma) en los primeros ensayos de la Asociación de dos ensayos para cada uno de los cinco días de prueba. Los paneles medios muestran las latencias promedio de los ensayos de segundo cada día. Resultados de los análisis post-hoc se muestran en los gráficos (* p < 0.05 vs mismo día simulado; ^ p < 0.05 vs mismo día INGENUO). Los paneles inferiores un resumen de los resultados que muestra la mediana (línea negra), 25 de^mayo y 75 percentiles de^th (límites de caja) y 10^th y 90^º percentiles (barras de error). La media también se indica por las líneas rojas y los puntos como puntos negros. Resultados de los análisis post-hoc se muestran en los gráficos (*p < 0.05 vs mismo ensayo simulado, ^ p < 0.05 vs mismo juicio INGENUO). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Al realizar cualquier tipo de pruebas de comportamiento, es fundamental ser constante. Este detalle incluye muchas consideraciones que parecen insignificantes pero que tienen un impacto importante en la respuesta del animal. Un paso importante que no puede soslayarse es la aclimatación de los animales para su hogar-jaula/situación antes de cualquier experimento. Esta preparación reduce los efectos de la respuesta de estrés fisiológico de los animales, que pueden alterar los resultados conductuales¹⁸. Del mismo modo, es absolutamente esencial que cada esfuerzo es hecho para manejar todos los animales de la misma manera. Esta consistencia incluye, como aclimatación se mencionó anteriormente, a la vivienda y aclimatación a manipulación y transporte entre las habitaciones antes del entrenamiento o de prueba. Este concepto no se puede exagerar. Manejo de animales descuidado es desastroso para cualquier prueba comportamiento¹⁹. Asimismo, cada esfuerzo debe hacerse para animales de prueba a la misma hora del día, ya sea durante su ciclo de claro u oscuro. Para las pruebas aquí, prueba en fase de claro u oscuro es aceptable, siempre y cuando las pruebas se realizan constantemente. Prueba hecha en diferentes momentos durante el ciclo circadiano se ha demostrado para alterar los resultados conductuales^18,20. Además, el controlador, así como el animal debe estar en un estado de calma, libre de estrés para maximizar la exactitud de los resultados.

Particularmente en el caso de lo Neuroscore negativos y falsos positivos son comunes. Falsos positivos ocurren típicamente cuando un animal no es totalmente habituado al manejo y prueba. El animal debe estar completamente relajado la respuesta observada es reflexiva y no debido a los músculos apretando de reacción a estrés o miedo. Un controlador de tensión puede influir en los resultados mediante la transmisión de estrés para el animal. Por lo tanto, manteniendo la rata demasiado apretado o demasiado flojo pueden tanto ser problemáticos. Además, si el controlador está nervioso, esto puede confundir la reacción de las ratas. También existe el riesgo de que un observador inexperto malinterpretan la respuesta de la rata. Buen entrenamiento y mucha práctica son esenciales para el éxito y la consistencia de la Neuroscore.

En general, la preocupación principal con estas pruebas es la falta de una gran diferencia y a veces no hay diferencia, entre grupos de tratamiento. Puesto que los animales pueden reaccionar diferentemente a diferentes controladores, ruidos, veces de día y potencialmente, temporada²¹, se debe hacer todo lo posible para reducir los posibles factores de confusión.

Los resultados de las tareas de equilibrio de viga y viga-a pie que se muestra a continuación demuestran que estas pruebas son útiles después de lesión para detectar déficits en la función vestibulomotor. Estos déficits suelen resolución por tiempo^1,14. En este modelo, a los 6 meses después de lesión, han resuelto los déficit inducidos por la lesión. Los resultados del punto de tiempo de 6 meses indican que no hay diferencias entre INGENUO, simulado o lesionados de las ratas; sin embargo, todas las ratas han sido relajantes en sus jaulas hogar durante 6 meses, envejecimiento y aumentar de peso. Así, por el momento volver a los 6 meses después de la cirugía (o equivalentes en el caso de INGENUO), esencialmente están volviendo viejo y gordo, y por lo tanto todos los grupos no funcionan tan bien como lo hizo frente a sus valores basales día 0 resultados.

Otra consideración importante es que la prueba de comportamiento utilizada es la prueba correcta. Por ejemplo, las pruebas que aquí se piensan para representar la función de áreas específicas del cerebro. Un ejemplo es el sistema vestibular, que es importante para el equilibrio. Áreas del cerebro involucradas en la función sensoriomotora, tales como la corteza incluyendo la corteza sensoriomotora, el tálamo, las neuronas corticoespinales, ganglios basales, nigro-estriado, para nombrar unos pocos, son todos los involucrados en la coordinación de vestibulomotor. Así, los déficits en la balanza de astil o haz caminata indican posibles déficits en estas áreas. Además, el hipocampo y la corteza prefrontal están implicados en el aprendizaje y la memoria las funciones probadas por el laberinto de agua de memoria de trabajo. Incluso cuando se selecciona la prueba correcta, las limitaciones de las pruebas que se emplean deben tenerse en cuenta. Por ejemplo, ninguna de las pruebas presentadas aquí son sensible a los déficits en el estado de ánimo, como depresión, ansiedad o las interacciones sociales tales como impulsividad, agresión y toma de decisiones. Para reiterar, es imprescindible elegir la prueba apropiada para el área de comportamiento y de cerebro ser evaluados.

Interpretación y análisis de datos conductuales deben ser abordados con precaución. Se recomienda incluir análisis de poder de cada tipo de ensayo por separado, ya que, utilizando un resultado conductual como una medida de un déficit neuronal, es por su naturaleza, una medida cruda de un sutil efecto. Además, diferentes pruebas requieren diferentes tipos de análisis estadísticos. Por ejemplo, los ensayos Neuroscore y viga de equilibrio descritos dependen de la interpretación de un observador capacitado para anotar el comportamiento utilizando una escala ordinal. Estos tipos de datos no son continuos y no normalmente distribuido, entonces no paramétrica estadística debe ser utilizada, como el test de Kruskal-Wallis, según lo demostrado en las secciones 6.1 y 6.2. Alternativamente, el paseo de la viga y pruebas de laberinto de agua de memoria de trabajo producen datos que son continuos y normalmente distribuido, tan paramétrica estadística se puede utilizar, como ANOVA unidireccional o medidas repetidas ANOVA dos vías, como se muestra en las secciones 6.3 y 6.4.

Las tareas conductuales presentadas aquí han resistido la prueba del tiempo y dan resultados reproducibles, especialmente cuando se combina con el modelo FPI en ratas, aunque existen muchos otros métodos de pruebas de comportamiento para la lesión cerebral. La neuroscore es una corta evaluación realizada con un mínimo de equipo. Otras pruebas de reflejos y la fuerza están disponibles y podrían incorporarse una evaluación neurológica, como la tarea del lateral de la pulsión, la aquinesia prueba, la prueba del plano inclinado y fuerza de prensión (ver Fujimoto et al. ²² y oro et al. ²³). el equilibrio de viga y viga-paseo tareas descritas son las medidas de vestibulomotor déficits después de lesión. Coordinación de Vestibulomotor puede considerarse una medida de comportamiento locomotor bruto, mientras que otras medidas de déficit locomotor bruta incluyen el Rotarod, el poste giratorio y abierta actividad de campo. La capacidad de nadar, medida como velocidad de nado en el laberinto de agua, es también una indicación de la coordinación motora gruesa^22,23. La tarea de laberinto de agua de la memoria de trabajo completa este conjunto de pruebas de detección tanto de referencia (indicados por la prueba 1) déficits de la memoria y trabajar déficits de memoria (indicados por Trial 2 o la diferencia entre la prueba 1 y 2 de prueba). Otras medidas de la función cognitiva incluyen el laberinto radial de ocho brazos, el laberinto de Barnes, la prueba de reconocimiento de objetos nuevos y variantes del laberinto de agua. Estas variaciones incluyen el original laberinto acuático de Morris y el laberinto de Lashley III (otra vez ver Fujimoto et al. ²² y oro et al. ²³). esta batería de pruebas ha demostrado para ser útil después de lesiones y, en diversos grados, que a 12 meses después de la lesión¹.

Además, las tareas demostradas aquí pueden utilizarse con diferentes cepas, sexo y edad de las ratas; sin embargo, puede necesitar alojamiento para diferentes tamaños y en los casos de mayor fragilidad. Por ejemplo, las ratas mayores, más pesadas necesitan un haz más amplio para la tarea de la viga de Balance y las ratas envejecidas, frágiles, puede necesitar laberinto de menor duración de los tiempos de nadar en el agua. Así, hay espacio para la flexibilidad en estas pruebas y potencial para el desarrollo de nuevas pruebas para hipótesis y situaciones diferentes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles Rivers Laboratories 251 Ballardvale St Wilmington, MA 01887-1096 Phone: 800-522-7287	CD-IGS rats, strain code 001	male, albino, 300-350g at arrival
Name	Company	Catalog Number	Comments
Beam-Balance
Beam	home built		wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish
C-clamp	Home Depot	1422-C	2 1/2"
barrier	Home Depot		styrofoam, 18" x 17 1/2"
table (for both BB & BW)	generic office supply		37" h x 30" w x 60" l
Name	Company	Catalog Number	Comments
Beam-Walk
Beam	home built		wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor)
escape box	home built		woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w
nails (pegs)			2"
hinges
clamps
white noise machine	San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600		http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
light	Home Depot
Name	Company	Catalog Number	Comments
Morris Water Maze
fiberglass pool	manufacturer unknown
(similar to one made by SDI)	San Diego Instruments	7000-0723	72" diameter x 30" deep (~ 500 gal)
plexiglass platform	hand-made by Maggie Parsley		10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface
(similar to one made by SDI)	SDI	7500-0272
plexiglass animal boxes w/ lids	UTMB Machine Shop		2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h
spot lights/ heat lamps	Home Depot		3 around pool, 2 over boxes to dry animals
AnyMaze	San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600	/9001	http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/