Rilevare i deficit comportamentistici in ratti dopo la ferita di cervello traumatica

Riepilogo

L'obiettivo dei test comportamentali qui presentato è quello di rilevare i deficit funzionali in ratti dopo la ferita di cervello traumatica. Quattro test specifici sono presentati che rilevare i deficit nei comportamenti di riflettere i danni ad aree specifiche del cervello a volte che si estende per un anno dopo la ferita.

Abstract

Con la crescente incidenza del trauma cranico traumatico (TBI) in popolazioni civili e militari, TBI è ora considerata una malattia cronica; Tuttavia, pochi studi hanno studiato gli effetti a lungo termine delle lesioni nei modelli del roditore di TBI. Misure comportamentali che sono ben consolidate nella ricerca TBI per volte presto dopo la lesione, ad esempio due settimane, fino a due mesi, sono indicate qui. Alcuni di questi metodi hanno tradotto stati utilizzati ai tempi più tardi dopo la ferita, fino a un anno, ma da pochissimi laboratori. I metodi hanno dimostrato qui sono una breve valutazione neurologica per testare i riflessi, un equilibrio di fascio per testare l'equilibrio, un fascio-a piedi a prova di equilibrio e coordinazione motoria e una versione di memoria di lavoro del labirinto dell'acqua di Morris che possa essere sensibile ai deficit in memoria di riferimento. I ratti maschii sono stati gestiti e pre-addestrati a neurologico, equilibrio e coordinazione motoria test prima di ricevere la ferita di parasagittal fluido percussioni (FPI) o sham lesioni. Ratti possono essere testati sulla breve valutazione neurologica (neuroscore), l'equilibrio di fascio, e il fascio-a piedi più volte, durante il test il labirinto dell'acqua possono essere fatto solo una volta. Questa differenza è perché ratti possono ricordare l'attività, così confondendo i risultati se ripetuti test viene tentata nello stesso animale. Durante il test da uno a tre giorni dopo la ferita, vengono rilevate differenze significative in tutte le tre attività non cognitive. Tuttavia, le differenze nell'attività fascio-a piedi non erano rilevabili a intervalli di tempo più tardi (dopo 3 mesi). Deficit è stato rilevato a 3 mesi in equilibrio di fascio e a 6 mesi nella neuroscore. I deficit nella memoria di lavoro sono stati rilevati fuori a 12 mesi dopo la ferita, e un deficit in una memoria di riferimento per la prima volta a 12 mesi. Così, test comportamentali standard possono essere utili misure di deficit comportamentali persistenti dopo FPI.

Introduzione

I metodi qui presentati sono progettati per rilevare i deficit funzionali in specifiche aree cerebrali indotte da un modello sperimentale di TBI nel ratto. Quattro prove di comportamento diverso saranno descritti. In primo luogo, la breve valutazione neurologica, indicata come il neuroscore, può essere eseguita senza la necessità di qualsiasi apparecchiatura specializzata ma richiede pratica; Questo test rileva i deficit nei riflessi. In secondo luogo, il test di equilibrio di fascio rileva i deficit nella capacità di equilibrio. Questo compito richiede il gestore di segnare il ratto basato su una scala ordinale e richiede un certo allenamento del gestore. Il test di equilibrio di fascio richiede un fascio stretto ed è sensibile ai deficit del sistema vestibolare. Il terzo test valuta la vestibulomotor coordinamento. Questo test è noto come l'attività di fascio-a piedi, e anche se alcuni pre-allenamento del ratto è necessaria, questa procedura è più obiettivo rispetto alle due precedenti come la latenza per attraversare il fascio è una misura obiettiva non dipende dal punteggio soggettivo. Questa differenza è perché viene misurato il tempo di attraversare un fascio stretto per raggiungere una cassetta di sicurezza. Il fascio-Walk test richiede un fascio più lungo dell'equilibrio di fascio, nonché una casella di fuga. Questo test misura i deficit nella coordinazione motoria e l'equilibrio sia e così è sensibile a danni al cervelletto e aree del cervello relative al motore. La versione di memoria di lavoro del labirinto dell'acqua di Morris (MWM-WM) test principalmente funzione hippocampal e integrazione con la corteccia prefrontale o la funzione esecutiva. La versione del labirinto dell'acqua di Morris mostrato è utilizzabile anche per rilevare i deficit nella memoria di riferimento¹.

Questi metodi sono stati scelti in base il loro record di pista ben stabilito nella letteratura. Ognuno è stato efficace in molte mani da diversi laboratori con più ceppi di ratti in numerosi anni di ricerca. Tuttavia, in passato, alberino-ferita di misura fino a due settimane dopo la lesione sono stati considerati punti temporali "cronica". Così, per definire tecniche comportamentali per lo studio di effetti cronici di TBI in roditori, questi metodi ben noti dovuti essere valutato per la sensibilità rilevare TBI indotto i deficit ai più lunghi intervalli di tempo dopo la ferita. Mentre ora ci sono parecchi modelli del roditore di TBI, il modello FPI è uno dei più utilizzati e viene applicato in questo studio. Questo modello è stato pubblicato nel 1950 ' s², e da allora, più di 1.000 documenti hanno impiegato FPI in ratti³. Il neuropathology di questo tipo di ferita è stata ben descritto da noi⁴ e altri^5,6,7. Brevemente, la lesione di un neurone nell'ippocampo ha dimostrato di essere dose-dipendente con Fluoro-Jade macchiatura in tempi brevi dopo la lesione, vale a dire, 24-48 h; mentre l'atrofia lorda e cavitazione tra cui assottigliamento della capsula interna e corteccia è stato segnalato a un anno dopo la ferita^6,7.

La rappresentazione più significativa della funzione del cervello è valutata usando misure comportamentali risultato dopo un trauma cranico sperimentale. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli esperimenti FPI che utilizzano i risultati comportamentali fare misure relativamente presto, in genere da 1 a 14 giorni dopo la ferita. Utilizzando i metodi hanno dimostrato qui, che alcuni deficit comportamentali possono essere rilevati fuori a 12 mesi dopo la ferita¹. Funzione neurologica, funzione vestibulomotor lordo e coordinazione motoria sono stati valutati nei giorni di alberino-ferite (PID) 1-3 e a 3, 6 e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico, utilizzando una breve valutazione neurologica (Neuroscore; per l'ultima volta da Schallert⁸), il Compito di equilibrio di fascio e il fascio-passeggiata compito^9,10,11. Riferimento e memoria di lavoro sono stati valutati usando una versione di memoria di lavoro del Morris water maze^1,12,13.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali in primo luogo sono approvati dal comitato di uso della University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e istituzionali Animal Care come diretto dalla istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (8 ° edizione, Consiglio nazionale delle ricerche).

1. interventi chirurgici e percussioni fluida TBI

1. Ottenere adulto maschio g 300 ratti Sprague-Dawley da un fornitore e casa due per gabbia con cibo e acqua ad libitum in un vivaio con condizioni costanti: luce ciclo (600 h a 1.800 h), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e umidità (40-60%).
2. Prima della chirurgia, gestire i ratti per tre-cinque giorni e poi treno i ratti per la Neuroscore, equilibrio di fascio e procedure di fascio-a piedi da uno a tre giorni prima della valutazione della linea di base. Condurre la valutazione della linea di base o il giorno o la mattina prima della chirurgia.
   Nota: Preparare sempre ratti di controllo, come falsità-azionati o chirurgicamente ingenuo ratti nello stesso modo come quelli che riceverà un infortunio e, in modo casuale o in modo equilibrato, raggruppare i ratti nei gruppi di trattamento.
3. Eseguire un intervento chirurgico in condizioni asettiche (strumenti sterili, camici chirurgici pulito, guanti sterili, maschere e coperture della testa).
4. Anestetizzare ratti utilizzando isoflurano al 4% per induzione e 1.5-2% per la manutenzione. Intubate e ventilare meccanicamente i ratti (utilizzando isoflurano in aria: ossigeno (70: 30) e preparare per la ferita di fluido-percussioni parasagittal come precedentemente descritto^14,15.
5. Infiltrarsi in siti di ferita con 0,10% bupivicane prima della sutura e inserire la supposta rettale acetaminofene (120 mg/kg) prima del risveglio dall'anestesia. Monitorare i ratti per almeno 4 h durante il periodo di recupero e il giorno seguente per segni di infezione, lesioni neurologiche gravi (ad esempio paralisi) o grave disagio (ad es. posizione di Ghiro persistente).
   Nota: Ratti esibendo uno qualsiasi di questi sintomi dovrebbero essere euthanized (4% isoflurane in un'aula di anestetico seguita dalla decapitazione).

2. Neuroscore Training e test

1. Neuroscore formazione
   1. Per la formazione sui ratti notoriamente sperimentalmente ingenuo, eseguire i test nel seguente ordine (misure 2.2.1-2.2.5) dall'inizio alla fine, tornare alla gabbia a casa per 1 min, quindi ripetere finché non si ottiene un punteggio pari a zero.
   2. Punteggi di Mark sulla scheda di valutazione per registrare le prove di formazione per ogni ratto. Dopo l'allenamento, è necessario eseguire una sessione di test (Vedi sotto) il giorno stesso o successivo.
      Nota: Se la sessione di test non produce un punteggio di zero per la linea di base, training e test può essere ripetuti o il ratto può essere deviato per un esperimento non-comportamento.
2. Neuroscore test
   Nota: Eseguire i test nell'ordine seguente, ritorno a casa gabbia per 1 min, quindi ripetere due volte per un totale di tre volte.
   1. Test di flessione degli arti anteriori
      1. Sollevare il topo dalla coda e tenere circa 6-12 pollici sopra la superficie del tavolo.
      2. Osservare se il ratto si estende o si flette gli arti anteriori. Punteggio ottenuto la presenza di flessione (1) o assenza (0).
         Nota: La flessione è anormale. Punteggio possibile di 1 x 3 = 3 (totale possibile = 3).
   2. Test di flessione del hindlimb
      1. Sollevare il topo dalla coda e tenere circa 6-12 pollici sopra la superficie del tavolo.
      2. Osservare se il ratto si estende o si flette di zampe posteriori. Punteggio ottenuto la presenza di flessione (1) o assenza (0).
         Nota: La flessione è anormale. Punteggio possibile di 1 x 3 = 3 (cumulativo totale possibile = 6).
   3. Visivamente ha attivato test di piazzamento
      1. Sollevare il topo dalla coda.
      2. Abbassare lentamente il topo verso il bordo della tabella fino a quando il naso è circa 10 cm dal bordo.
      3. Fai avanzare il ratto lentamente verso il bordo (non consentono i baffi a toccare il bordo).
      4. Osservare se il ratto raggiunge e si estende zampe anteriori verso il tavolo. Punteggio ottenuto la presenza (0) o meno (1) di estendere le zampe anteriori.
         Nota: Raggiungendo per la tabella in risposta a segnali visivi è normale. Punteggio possibile di 1 x 3 = 3 (cumulativo totale possibile = 9).
   4. Test di piazzamento azionato a contatto
      1. Tenere il topo, con corpo in mano, in parallelo al bordo del tavolo e zampe anteriori gratis.
      2. Abbassare lentamente il topo verso il bordo della tabella fino a quando i baffi su un lato toccano il bordo del tavolo.
      3. Osservare se il ratto si estende l'arto anteriore sullo stesso lato come i baffi che stanno toccando la tabella verso il bordo della tabella appena tocca i baffi.
         Nota: Elicitazione di questa risposta richiede una notevole pratica e i ricercatori devono essere ben addestrati per eseguire questo test in modo coerente.
      4. Punteggio ottenuto la presenza (0) o meno (1) di raggiungere verso il tavolo.
         Nota: Raggiungere in risposta alla stimolazione tattile è normale. Punteggio possibile di 1 x 3 = 3 (totale possibile = 12).
      5. Ripetere i passaggi 2.2.4.1-2.2.4.4 per il lato opposto. Punteggio possibile di 1 x 3 = 3 (cumulativo totale possibile = 15).
   5. Prova di riflesso prensile hindpaw
      1. Tenere il ratto in una mano con pollice e indice intorno al petto sotto le zampe anteriori.
      2. Toccare delicatamente il palmo del uno hindpaw con l'altro indice.
      3. Osservare se il ratto afferra il dito indice. Punteggio ottenuto la presenza (0) o meno (1) di cogliere.
         Nota: Afferrare è normale. Punteggio possibile di 1 x 3 = 3 (totale possibile = 18).
      4. Ripetere i passaggi 2.2.5.1-2.2.5.3 per il lato opposto. Punteggio possibile di 1 x 3 = 3 (totale possibile = 21).
   6. Segnando
      1. Sommare i punteggi per un possibile totale cumulativo di 7 x 3 = 21. Un punteggio pari a zero è normale.

3. fascio-Balance Training e test

1. Attrezzature
   1. Utilizzare un fascio di 60 cm di lunghezza, 1,75 cm in larghezza, 4,0 cm in altezza, set 90 cm dal pavimento, con una barriera di 30 cm di altezza, 30 cm di larghezza. Fissare il fascio a un tavolo con la barriera attaccata in modo che 50 cm della trave sporge dalla barriera, lontano dal tavolo.
   2. Inserire una casella di sicurezza imbottite sotto la trave per ammorbidire l'impatto dei ratti che cadono.
2. Formazione del fascio-bilancio
   1. A 24-48 h prima dell'intervento chirurgico, posizionare il ratto sulla trave per una prova di s 60.
   2. Se il ratto non riesce a bilanciare il proprio, consentire il topo a cadere la cassetta di sicurezza.
   3. Iniziare a cronometrare quando il ratto è posizionato saldamente sulla trave.
   4. Osservare il ratto per il 60 s periodo e tasso le prestazioni sulla base della seguente scala: 1 = equilibrio stabile di spettacoli (stallieri, passeggiate, tenta di scalare la barriera), 2 = spettacoli traballante equilibrio (coglie i lati del fascio e/o ha movimenti instabili), 3 = cerca di equilibrio ma scivola o r giri sulla trave, si blocca su di abbracciare il fascio, 4 = prova di equilibrio, ma cade dopo 10 s, 5 = si blocca sopra o dal fascio e cadute fuori in meno di 10 s, 6 = Falls off, facendo alcuno sforzo per bilanciare o appendere sulla trave.
   5. Registrare il punteggio del foglio di lavoro.
   6. Consentire il topo a riposare per 15 s in gabbia a casa, quindi ripetere i passaggi 3.2.1-3.2.5 fino a quando il ratto raggiunge tre punteggi di 1 o 2. Il ratto è considerato quindi addestrato.
   7. Eseguire una pre-valutazione a 24 ore o il giorno dell'intervento prima della chirurgia.
3. Test di equilibrio di fascio
   1. A partire da 24 h dopo chirurgia e continuando fino a 4 giorni, verificare i ratti al giorno.
      1. Posizionare il ratto sulla trave e avviare il timer. Osservare il ratto strettamente per 60 s. Record il punteggio del foglio di lavoro.
      2. Tornare alla gabbia a casa di ratto per un periodo di riposo breve (1-3 min).
      3. Ripetere i passaggi 3.3.1.1-3.3.1.2 per un totale di tre prove.

4. fascio-Walk Training e test

1. Attrezzature
   1. Utilizzare una trave di legno 100cm di lunghezza, 2,5 cm di larghezza e 4,0 cm in altezza.
   2. Preparare un supporto regolabile, un tavolo regolabile e quattro picchetti, 2 cm di altezza e un obiettivo nero box 28 cm in lunghezza, altezza 18 cm e 18 cm di larghezza, con un'apertura su una fine abbastanza grande per il ratto di passare attraverso.
   3. Collegare l'estremità di destinazione del fascio al lato aperto della casella obiettivo che è posizionato sul tavolo regolabile. Collocare il generatore di luce e rumore bianco luminoso vicino all'estremità di partenza del fascio. All'estremità di partenza del fascio è fissato il supporto regolabile così il fascio e box sono allo stesso livello, circa 1 m sopra il pavimento.
2. Formazione del fascio-a piedi
   1. Inizio formazione 24-48 h prima della chirurgia.
   2. Posizionare il ratto nella casella obiettivo per 1 min. Dopo 1 min, rimuovere il ratto e iniziare la prova.
   3. Per iniziare la prova, accendere la luce e il rumore bianco e posizionare il ratto sulla trave nella posizione del foro peg più vicino alla casella di obiettivo e consentire il topo a entrare nella scatola di obiettivo.
   4. Quando i piedi anteriori del ratto varcare la soglia della finestra di obiettivo, spegnere immediatamente le fonti di luce e rumore (questa è la fine di una prova).
   5. Consentire il topo a riposare nella casella obiettivo per 30 s tra ogni prova.
   6. Ripetere la procedura a passaggio 4.2.3-4.2.5 due volte in ogni posizione di peg e dalla posizione di partenza. Inserire i perni nei fori ed eseguire una completa fascio-passeggiata con i pioli in luogo.
   7. Eseguire tre prove cronometrate di fascio-a piedi.
      1. Rimuovere il ratto dalla casella obiettivo. Accendere la luce e il rumore bianco e avviare il cronometro quando si posiziona il ratto sulla trave. Fermare il cronometro immediatamente quando piedi anteriori del ratto varcare la soglia della finestra di obiettivo e quindi immediatamente spegnere la luce e rumore.
      2. Registrare il tempo del foglio di lavoro.
      3. Ripetere i passaggi 4.2.7.1-4.2.7.2 fino a quando il ratto ha raggiunto tre volte di 5 s o meno. Il ratto è ormai considerato addestrato.
3. Fascio-passeggiata valutazione basale
   1. Il giorno o la mattina prima della chirurgia, fare tre prove cronometrate con chiodini in luogo.
   2. Iniziare posizionando il ratto nella casella obiettivo per 30 s. Rimuovi ratto dal casella di goal e girare sul rumore bianco e la luce. Posizionare il ratto all'estremità di inizio del fascio e contemporaneamente avviare il cronometro. Quando i piedi anteriori del ratto varcare la soglia della finestra di obiettivo, immediatamente spegnere le fonti di luce e rumore e fermare il timer.
   3. Registrare il tempo del foglio di lavoro. Consentire il topo a rimanere nella casella obiettivo per 30 s.
   4. Ripetere passaggi 4.3.2-4.3.3 fino a tre latenze vengono registrate nel foglio di lavoro. Tornare dalla gabbia ratto dopo tre prove cronometrate sono state completate.
4. Fascio-Walk test
   1. Testare i ratti giornalmente a partire 24 h dopo l'intervento chirurgico e continuando per fino a 4 giorni. Eseguire tre prove cronometrate come nei passaggi 4.3.

5. funzionamento del labirinto dell'acqua di memoria

1. Attrezzature
   1. Uso un serbatoio riempito d'acqua per un'altezza di 28 cm e mantenuta a 26 ± 1 ° C.
   2. Utilizzare una piattaforma di vetro acrilico trasparente che è di 10 cm di diametro su un basamento 26 cm in altezza.
      Nota: La superficie superiore della piattaforma deve essere spalmata con silicio in forma di un cerchio con una X su di esso. Questo permette i ratti salire sulla piattaforma e dà loro trazione in modo da non scivolare fuori.
   3. Raccogliere un cronometro, una lampada di calore, asciugamani monouso, assorbenti igienici, gabbie supplementari e una rete dei pesci acquario piccolo, manico lungo. Utilizzare un video computerizzato tracking system che è collegato ad una videocamera per registrare il nuoto di ratto e invia i dati al computer. Salvare il video e dati sul computer per un'analisi successiva.
2. Prova del labirinto dell'acqua di memoria di lavoro
   1. Dare i ratti quattro paia di prove ogni giorno per cinque giorni consecutivi, posizionare la piattaforma in ciascuno dei quattro quadranti e avviare i ratti da ciascuno dei quattro punti di partenza (N, S, E, W), come descritto di seguito.
   2. Prima di definire le coppie partenza piattaforma di localizzazione geografica per essere utilizzato in tutto l'esperimento.
      Nota: L'ordine dei quadranti dove la piattaforma si trova e il punto di partenza utilizzato necessità di essere in un ordine diverso per ognuno dei cinque giorni di nuoto, ma lo stesso per ogni ratto.
      1. Utilizzare quattro punti di partenza (N, S, E o W) e quattro punti di piattaforma (quadranti 1, 2, 3 o 4; Figura 1). Per esempio, (N, 2; E, 4; S, 1; W, 3; vedere la Figura 1). Piano un ordine equilibrato (non casuale) per evitare punti di partenza troppo vicino alle piattaforme (nessun punto di partenza è il quadrante stesso come la posizione di piattaforma). Impostare un foglio di dati utilizzando i quadranti di piattaforma e quattro punti di partenza.
      2. Scrivere un protocollo per il video tracking software da utilizzare nell'ordine a video i ratti di nuoto e di raccogliere dati specificato (ad esempio, la durata della nuotata, velocità, distanza percorsa prima di trovare la piattaforma).
         Nota: Il software di monitoraggio si arresta automaticamente la registrazione dopo la durata specificata. Il protocollo dovrebbe consentire di specificare dove si trova la piattaforma, come molte prove da eseguire per animale, e quanti animali saranno testati per ogni sessione, e anche la durata massima consentita (ad es., 120 s).
      3. 4-6 ratti per ogni sessione di prova.
         Nota: più di 6 ratti creare un problema nella sincronizzazione tra ratti e possono portare all'errore dal gestore. Le caselle di riscaldamento anche diventano affollate.
   3. Prova 1
      1. Aprire il video software di monitoraggio e caricare il protocollo corretto inclusa la mappa del labirinto di acqua.
      2. Posizionare la piattaforma nella posizione assegnata (ad es., 2; Figura 1) e verifica che corrisponda la mappa nel software. Preparare il software di monitoraggio per iniziare quando il topo entra nel campo visivo della telecamera.
      3. Posto il ratto nel serbatoio rivolto verso la parete nella posizione assegnata (ad es., N; Figura 1) e immediatamente avviare il timer.
      4. Consentire il ratto 120 s trovare la piattaforma. Quando il ratto rileva la piattaforma, arrestare il timer e registrare il tempo del foglio di lavoro. Se il ratto non riesce a trovare la piattaforma, portano alla piattaforma a mano e registrare 120 s. Consenti il ratto 15 s per rimanere sulla piattaforma.
   4. Prova 2
      1. Verifica che il software è pronto per la prova 2. Posto il ratto torna nel serbatoio nella stessa posizione di partenza (N). Ripetere il passaggio 5.2.3.4.
   5. Dopo Trial 2, posto il ratto nel recinto riscaldato per 4 min. spostare la piattaforma per la seconda posizione (4; Figura 1) e verifica che corrisponda la mappa nel software.
   6. Ripetere Trial 1 e 2 procedure (procedura 5.2.3-5.2.4) fino a partire la piattaforma di localizzazione geografica abbinamenti tutti e quattro sono state completate.

6. analisi dei dati

1. Neuroscore
   1. Trasferire manualmente i risultati scritti a mano in un foglio di calcolo del computer.
   2. Sommare i risultati per ogni prova ottenere tre punteggi per ratto ogni giorno.
   3. Formattare i dati per l'analisi statistica (sia nel formato lungo o largo a seconda delle preferenze del software).
      Nota: Il formato lungo ha una sola colonna per trattamento (in questo caso, popolato con "Ingenuo", "Sham" o "TBI"), una singola colonna per giorno (in questo caso "0", "1", "2" o "3") e una singola colonna per trial ("1", "2" o "3"). Il formato wide ha una sola colonna per ogni combinazione di livelli di fattore (quindi una singola colonna per ingenuo, giorno 0, prova 1, un'altra colonna per ingenuo, giorno 0, prova 2, ecc.)
   4. Il Punteggio per ogni animale in media ogni giorno. Dato che c'erano tre prove fare ogni giorno ci saranno tre valori per ogni animale al giorno.
   5. Valutare se i dati siano distribuiti normalmente. Uso che un non parametrici statistici (ad es., Kruskal-Wallis) test per analizzare se il Punteggio di ogni giorno è differente tra i gruppi. In questo caso, dal momento che questi dati non sono continui, essi non sono normalmente distribuiti.
   6. Per determinare dove si trovano le differenze, fare test post-hoc , quali analisi post-hoc di Tukey.
      Nota: Qui, il pacchetto di software statistico R¹⁶, la funzione di Kruskal.test() e la funzione di posthoc.kruskal.nemenyi.test all'interno il Pairwise più confronto di dire ranghi pacchetto (PMCMR)¹⁷ sono state usate.
   7. Inoltre, test per vedere se ci sono eventuali differenze tra i giorni all'interno di ogni gruppo.
      Nota: ad esempio, per vedere se gli animali SHAM si comportano in modo diverso il giorno 0 rispetto al giorno 1, giorno 2 o 3 giorni. A tale scopo, eseguire un unidirezionale misure ripetute ANOVA. Questo può essere ottenuto in R utilizzando la funzione di ezANOVA all'interno del pacchetto di ez.
   8. Per eseguire un misure ripetute ANOVA, controllare innanzitutto le ipotesi sui sfericità.
      Nota: Qui, i dati indicano che all'interno di fattore (giorno) fa incontrare l'assunzione di sfericità per INGENUO e SHAM, ma non per TBI. Così, una correzione non è necessaria per INGENUO o SHAM. Per i dati TBI, utilizzare la correzione di Greenhouse-Geisser.
   9. Se vengono rilevate differenze significative, eseguire un test post-hoc per determinare dove si trovano le differenze. Questo risultato è ottenuto in R utilizzando la pairwise t-funzione test. Rappresentare graficamente i risultati come un box plot, come mostrato nei risultati rappresentativi (Figura 2).
2. Equilibrio di fascio
   1. Trasferire manualmente le partiture manoscritte in un foglio di calcolo del computer. Formattare i dati per l'analisi statistica (sia in formato di lunghezza o la larghezza a seconda delle preferenze del software). Vedere nota al punto 6.1.3.
   2. Media i punteggi per ogni ratto ogni giorno in modo che ogni ratto avrà 1:20 al giorno. Per verificare se il Punteggio di ogni giorno è diverso tra INGENUO, SHAM e TBI, valutare se i dati siano distribuiti normalmente.
      Nota: In questo caso, poiché i dati non sono continui, questi dati non sono normalmente distribuiti. Pertanto, utilizzare un test statistico non parametrico (ad esempio, il test di Kruskal-Wallis).
   3. Per determinare dove si trovano le differenze, fare test post-hoc , ad esempio, analisi post-hoc di Tukey. Per verificare le differenze tra i giorni all'interno di ciascun gruppo di trattamento, misure di esecuzione ripetuto di un one-way ANOVA (Vedi punto 6.1.7). Verifica le ipotesi sui sfericità.
      Nota: In questo studio, i dati indicano che all'interno di fattore (giorno) non soddisfa l'assunzione di sfericità per uno qualsiasi dei gruppi, quindi usate le correzioni di continuità. Utilizzare la correzione di continuità di serra-Grier.
   4. Rappresentare graficamente i risultati su un box plot come mostrato nei risultati rappresentativi (Figura 3).
3. Fascio-a piedi
   1. Trasferire manualmente i risultati scritti a mano in un foglio di calcolo del computer. Media delle latenze di fascio-a piedi tre per ciascun animale per ogni giorno. Formattare i dati per l'analisi statistica (Vedi punto 6.1.3).
   2. Valutare se i dati vengono normalmente distribuiti.
      Nota: In questo caso, i dati sono continui e viene normalmente distribuiti. Pertanto, utilizzare un one-way ANOVA per determinare se la latenza ogni giorno è diversa tra ingenuo, SHAM e TBI.
   3. Per vedere se c'è qualche differenza tra i giorni all'interno di un gruppo di trattamento, eseguire un unidirezionale misure ripetute ANOVA. Controllare innanzitutto le ipotesi sui sfericità.
      Nota: In questo studio, i dati indicano che all'interno di fattore (giorno) non soddisfa l'assunzione di sfericità per uno qualsiasi dei nostri gruppi, pertanto vengono utilizzate le correzioni di continuità. Utilizzare la correzione di serra-Grier.
   4. Rappresentare graficamente i risultati su un box plot come mostrato nei risultati rappresentativi (Figura 4).
4. Labirinto di acqua di memoria di lavoro
   1. Trasferire i dati dal programma di rilevamento di computer o foglio di lavoro in un foglio di calcolo. Selezionare i risultati da analizzare.
      Nota: Molti possibili esiti sono disponibili per l'analisi da computer programmi di monitoraggio. Esempi di risultati selezionati per analisi possono includere: latenza, la lunghezza del percorso, thigmotaxia e velocità di nuotata. Il più comunemente segnalati esito è la latenza, in quanto utilizzato nell'esempio fornito.
   2. Formattare i dati per l'analisi statistica (sia in formato di lunghezza o la larghezza a seconda delle preferenze del software).
      Nota: Il formato lungo ha una sola colonna per trattamento (in questo caso, popolato con "Ingenuo", "Sham" o "TBI"), una singola colonna per giorno (in questo caso "1", "2", "3", "4" o "5") e una singola colonna per prova (o "1", "2", "3", "4", "5" "6", "7" o "8"). Abbiamo anche bisogno di un'ulteriore colonna per identificare il tentativo ("1" o "2"). Grande formato ha una sola colonna per ogni combinazione di livelli di fattore (così per esempio, una singola colonna per ingenuo, giorno 1, prova 1, tentativo 1, un'altra colonna per ingenuo, giorno 1, tentativo di prova 2, 2). Inoltre, la differenza tra prova 1 e prova 2 può essere calcolata per ogni sessione e analizzata come una partitura di differenza.
   3. Per trovare se c'è una differenza complessiva tra i gruppi di lesioni, procedere come segue.
      1. In primo luogo, media la latenza del labirinto di acqua per ogni animale per 1 giorno.
         Nota: C'erano quattro sessioni ogni giorno, così media dei quattro valori per animale per ogni prova 1 e prova 2. Fare questo calcolo per i giorni rimanenti pure.
      2. Per verificare differenze di lesioni complessive, Esegui un bidirezionale misure ripetute ANOVA. Ci sono due fattori, del pregiudizio e giorno. La ferita è una tra fattore di gruppo e il giorno è all'interno di fattore di gruppo. Nota: Qui è stato utilizzato R.
      3. Se i risultati indicano una differenza significativa a causa di infortunio, quindi eseguire test post-hoc di Tukey, una per vedere dove si trovano le differenze.
   4. Per trovare fuori se ci sono differenze tra i gruppi di lesioni in giorni specifici procedere come segue.
      Nota: Giorno 1 viene utilizzato come esempio, e la stessa analisi deve essere fatto per tutti i giorni seguenti. Inoltre, questa analisi è fatto in diversi modi, in primo luogo per prova 1 solo, secondo prova solo per 2 e la terzi per la differenza tra prova 1 e prova 2. Prova 1 viene utilizzato come esempio; la stessa procedura deve essere utilizzati per le altre analisi.
      1. In primo luogo, media la latenza del labirinto di acqua per ogni animale per 1 giorno. Dato che c'erano quattro ripetizioni di "Trial 1" ogni giorno, media dei quattro valori per ogni animale.
      2. Valutare se i dati vengono normalmente distribuiti.
         Nota: In questo caso, i dati sono continui e viene normalmente distribuiti. Pertanto, utilizzare l'One-way ANOVA per determinare se la latenza di labirinto di acqua il giorno 1 è diversa tra INGENUO, SHAM e TBI. Pacchetto software statistico R e la funzione di aov() sono stati usati qui.
      3. Utilizzare un livello di significatività 5%. Se la risultante p-valore è minore di 0,05, quindi ci sono differenze significative fra i gruppi.
      4. Per determinare dove si trovano tali differenze, è possibile utilizzare test post-hoc di Tukey. Questa è la funzione di TukeyHSD() in R.
   5. Per scoprire se ci sono differenze tra giorni all'interno dei gruppi di trattamento, attenersi alla seguente procedura.
      1. Eseguire innanzitutto un unidirezionale misure ripetute ANOVA. Questo può essere ottenuto in R utilizzando la funzione di ezANOVA all'interno del pacchetto di ez.
      2. Prima di eseguire un misure ripetute ANOVA, controllare innanzitutto le ipotesi sui sfericità.
         Nota: L'entro fattore incontra (giorno) l'assunzione di sfericità per tutti i gruppi, così non c'è alcuna necessità di utilizzare le correzioni di continuità.
      3. Se vengono rilevate differenze tra giorni (p-valori meno di 0,05), quindi eseguire un test post-hoc per determinare esattamente dove si trovano le differenze. Questo passaggio avviene in R utilizzando la funzione pairwise.t.test.
   6. Grafico i risultati utilizzando grafici (Figura 5). Inoltre, può essere graphed Trial 1-prova 2.

Risultati

Risultati della procedura neuroscore (Figura 2) dimostrano il potenziale per falsi positivi (SHAM e TBI gruppi al giorno 0) e la sensibilità di questo test per rilevare piccole differenze. Falsi positivi possono verificarsi quando il topo non è ben abituato alla procedura, quindi non è completamente rilassato. Giorno 0 è prima dell'intervento, quindi, idealmente, tutti i ratti dovrebbero raggiungere il criterio di un punteggio pari a 0 prima di entrare in uno studio. Giorni 1-3 dimostrano la sensibilità di questo test per rilevare piccole variazioni nel punteggio. Mentre c'è un potenziale per un punteggio più alto 21, punteggi superiori a 3 sono insoliti in questo modello. In questo esempio, ripetute misure ANOVA non ha rivelato differenze tra giorni per INGENUO (p = 0,78) o SHAM (p = 0,09); Tuttavia, per il gruppo TBI c'erano differenze tra giorni (p < 0,05). Il confronto pairwise post-hoc ha indicato che giorno 0 è significativamente diverso da giorni 1, 2 e 3. Questo risultato dimostra che la lesione prodotta piccoli ma significativi cambiamenti nella valutazione neurologica.

Ulteriore analisi utilizzando il test di Kruskal-Wallis rispetto INGENUO, SHAM e TBI ogni giorno, seguita da test post-hoc di Tukey per determinare esattamente dove si trovano le differenze. Per giorno 0, il risultato statistico della prova è stato 13,37, p = 0,001, e SHAM era significativamente differente da INGENUO (p = 0,008). Idealmente, non ci dovrebbe essere nessuna differenza fra gruppi il giorno 0, come non sono state somministrate trattamenti o procedure. In questo caso, i ratti dovrebbero essere ulteriormente abituati alla routine, o trasferiti ad uno studio di non-comportamento. Per 1 giorno, il risultato statistico della prova è stato 32,39, p = 9.75e-8, con il test post-hoc , che indica che SHAM e TBI erano significativamente differenti da INGENUO (p = 0,002, p = 5.9e-7, rispettivamente). Per il Day 2, il risultato statistico della prova è stato 23,39, p = 8.34e-6 e SHAM e TBI erano differenti da INGENUO (p = 0,002, p = 6.8e-5). Per 3 giorno, il risultato statistico della prova è stato 38.4, p = 4.59e-9, e ancora una volta, erano significativamente differenti da INGENUO SHAM e TBI (p = 0.001, p = 2.1 e-8, rispettivamente). Questi risultati sottolineano il fatto che la preparazione di SHAM produce anche alcuni deficit nella valutazione neurologica a volte presto dopo la lesione.

Equilibrio di fascio rappresentante risultati (Figura 3) dimostra la sensibilità del test equilibrio di fascio ai deficit subito dopo la ferita (Figura 3, a sinistra) e in più un punto di tempo dopo la lesione (Figura 3, destra). La sensibilità del test equilibrio di fascio agli effetti della ferita di cervello diminuisce nel tempo, perché come i ratti illesi età e aumento di peso, essi hanno aumentato la difficoltà a bilanciare sulla trave. Intervalli di tempo più tardi, il fascio è girato quindi i ratti sono bilanciamento sul lato più largo del fascio. Tuttavia, entro 6 mesi dopo la ferita, questo test non è più sensibile agli effetti della ferita come età e/o peso confondere la capacità di eseguire l'operazione (Figura 3, destra). In alternativa, la guarigione potrebbe essersi verificato nel sistema vestibolare, e questi dati riflettono accuratamente che la capacità dei ratti di equilibrare raggiunge lo stesso livello come i gruppi di controllo.

Nel confronto di ingenuo, SHAM e TBI ogni giorno, abbiamo usato il test di Kruskal-Wallis. I risultati per i punti di tempo presto dopo lesioni sono mostrati in Figura 3, a sinistra. Il giorno 0, il test di Kruskal-Wallis trovato il valore della statistica test per essere 6,81, p = 0,033. C'era una differenza significativa tra i gruppi, con test post-hoc di Tukey mostrando che l'ingenuo gruppo era diverso da SHAM (p = 0.038); Tuttavia, tutti i tre gruppi hanno avuti mezzi ben di sotto di 2.0, che indica che tutti i ratti avevano incontrato i criteri per continuare. Sarebbe preferibile non avere nessuna differenza fra gruppi il giorno 0, ma dal momento che tutti i gruppi sono sotto 2, possono continuare nello studio. Il PID 1, la statistica test di Kruskal-Wallis è stato 69.72, p = 7.25e-16. Test post-hoc di Tukey ha mostrato che il gruppo TBI era significativamente differente da ingenuo e Sham gruppi (p = 4.9e-14, p = 9.1e-08, rispettivamente). Il giorno 2, la statistica test di Kruskal-Wallis è stato 62,84 e p = 2.26e-14, con il test post-hoc mostrando TBI diverso da INGENUO e SHAM (p = 1.0 e-10, p = 2.1 e-10 rispettivamente). Il giorno 3, la statistica test di Kruskal-Wallis è stato 62,69 e p = 2.44e-14. Il test post-hoc ha mostrato TBI diverso da ingenuo e SHAM, (p = 9.6e-12, p = 1.7 e-08, rispettivamente). Abbiamo inoltre esaminato per vedere se ci fossero eventuali differenze tra i giorni all'interno di ogni gruppo. Utilizzando un ripetute misure ANOVA, INGENUO, non c'erano differenze tra giorni (p = 0,367). Per SHAM e TBI c'erano differenze tra giorni (p = 0,002, p = 3.90e-29, rispettivamente). Confronti a coppie post-hoc ha rivelati per SHAM giorno 1 è significativamente diverso da giorno 2 e giorno 3 (p = 0.001, p = 0,01, rispettivamente), e per TBI, giorno 0 è significativamente differente forma giorni 1, 2 e 3 (p < 2e-16, p = 5.5 e-16 e p = 2.7e-13, rispettivamente). 1 ° giorno è anche significativamente diverso dal 3 ° giorno (p = 0,036).

A 6 mesi dopo la ferita, confronti tra INGENUO, SHAM e TBI sono stati fatti ogni giorno usando il test di Kruskal-Wallis (Figura 3, destra). Il giorno 0, il valore del risultato statistico della prova è stato 3,36 e p = 0,187, quindi non c'erano differenze il giorno 0. Tutti i mezzi erano sotto 2, che indica che tutti i ratti e gruppi soddisfano i criteri per continuare nello studio. Il PID 1, il risultato statistico della prova è stato 6.11, p = 0,047; Tuttavia, analisi post-hoc utilizzando il test post-hoc di Tukey ha mostrato che nessuno dei gruppi erano significativamente differenti quando contabilità per più test di ipotesi. Il giorno 2, il risultato statistico della prova è stato 4,09, p = 0,13, ns, e il giorno 3, il risultato statistico della prova è stato 2,91, p = 0.23, ns. Così, non ci erano nessun differenze fra i gruppi di lesioni in un dato giorno.

Inoltre, guardando le differenze tra i giorni all'interno dei gruppi di trattamento, una misure ripetute ANOVA ha rivelato differenze significative fra i giorni per INGENUO, SHAM e TBI (p = 0,0003, p = 2.61e-5, p = 5.59e-7, rispettivamente; Figura 3, destra). Test post-hoc ha dimostrato le seguenti differenze. Per INGENUO, giorno 0 era significativamente differente da giorni 1, 2 e 3 (p = 0,002, p = 0,044, p = 0,004, rispettivamente). Per SHAM, tutti i giorni erano significativamente differenti gli uni dagli altri: giorno 0 era significativamente differente da giorni 1, 2 e 3 (p = 0,0006, p = 0.001, p = 0,0006, rispettivamente); 1 ° giorno era significativamente differente da giorni 2 e 3 (p = 0,031, p = 0,0006, rispettivamente); e 2 ° giorno era significativamente differente dal 3 ° giorno (p = 0.044). Per TBI, giorno 0 è significativamente diverso da giorni 1, 2 e 3 (p = 0,0005, p = 0,0008, p = 0,0005, rispettivamente).

I risultati del test Beam-Walk sono mostrati in due punti temporali (Figura 4). Simile all'equilibrio di fascio, questo test rileva deficit presto dopo la lesione (Figura 4, sinistra). Tuttavia, entro 6 mesi dopo la ferita, non ci sono differenze significative fra i gruppi (Figura 4, destra), suggerendo la guarigione si è verificato nel gruppo di feriti. Questo risultato può riflettere gli effetti di età più avanzata e aumento di peso.

Per confrontare INGENUO, SHAM e TBI ogni giorno presto dopo la lesione, è stato utilizzato un one-way ANOVA. Non c'erano differenze il giorno 0 (F = 0,859, p = 0.426) e tutte le latenze erano sotto 5 s, che indica che tutti i ratti hanno risposto ai criteri per continuare nello studio. Il PID 1, c'era una statistica test significativo di 15,36, p = 1.18-6. Prova di post hoc di Tukey ha indicato una differenza significativa tra TBI e INGENUO (p = 0.000004) e TBI e SHAM (p = 0,0001). Il giorno 2, c'era una differenza significativa tra i gruppi (F = 9,49, p = 0,0002). Test post-hoc ha rivelato differenze tra TBI e INGENUO (p = 0,0002) e TBI e SHAM (p = 0,005). Il giorno 3, il risultato statistico della prova generale equivale a 6,27, p = 0,0025, indicando che ci sono differenze fra i gruppi. Test post-hoc di Tukey ha mostrato che ancora una volta, TBI era diverso da INGENUO e SHAM (p = 0,003, p = 0,035, rispettivamente).

Utilizzando una misura ripetuta One-way ANOVA, differenze tra giorni all'interno dei gruppi di trattamento sono state esplorate. Innanzitutto l'assunzione di sfericità era controllato per ogni gruppo. All'interno di fattore (giorno) non soddisfaceva il presupposto di sfericità per i gruppi di INGENUO o SHAM, così la correzione di continuità, serra-Grier è stato applicato a tali gruppi. Per farsa, non c'erano differenze fra giorni (p = 0,066), INGENUO e TBI c'erano (p = 0,006, p = 2.89E-7, rispettivamente). I confronti post-hoc ha mostrato per INGENUO, la differenza era tra giorno 0 e 1 giorno (p = 0,003). Per TBI, le differenze erano tra giorno 0 e giorni 1, 2 e 3 (p = 9.2 e-6, p = 0,0005, p = 0,002, rispettivamente), e c'era una differenza tra 1 giorno e 3 ° giorno (p = 0,018).

A 6 mesi dopo la ferita, non c'erano differenze significative tra INGENUO, SHAM o TBI in qualsiasi giorno (giorno 0, F = 0.315, p = 0.732; Giorno 1, F = 0.336, p = 0,717; Giorno 2, F = 0,5, p = 0,61; Giorno 3, F = 1.17, p = 0,322; Figura 4, destra). Quando si confrontano le differenze tra i giorni all'interno di ogni gruppo, c'era una differenza significativa nel gruppo TBI (p = 0,026), con il giorno 0 è diverso dai giorni 1, 2 e 3 (p = 0,026, p = 0,002, p = 0,002). Non c'erano differenze tra ogni giorni per INGENUO o SHAM (p = 0,104, p = 0.063, rispettivamente).

I dati della versione di memoria di lavoro del labirinto dell'acqua di Morris possono essere rappresentati graficamente in una varietà di modi. Qui dimostriamo i risultati per 3 mesi (Figura 5, sinistra) e 12 mesi (Figura 5, destra) dopo la ferita utilizzando sia la linea grafici per rappresentare il decorso e trame di casella per fornire un riepilogo generale dei dati (Figura 5, in basso). Quindi possiamo visualizzare Trial 1 confronti e comparazioni Trial 2 in modo indipendente su ogni giorno così come le differenze complessive a causa di infortunio. Latenze Trial 1 rappresentano la memoria di riferimento e le latenze Trial 2 raffigurano la memoria di lavoro.

I dati dai ratti di 3 mesi dopo l'infortunio sono mostrati in Figura 5, sinistra. Per prova 1 (Figura 5, in alto a sinistra), quando si confrontano INGENUO, SHAM e TBI, solo giorno 4 hanno mostrato una differenza significativa tra i gruppi (F = 4.12, p = 0,025), con test di Tukey post hoc indicando che TBI era diverso da NAÏVE (p = 0,019). Per prova 2 (Figura 5, in mezzo a sinistra), c'era una differenza significativa il giorno 1 (F = 5.93, p = 0,006), con analisi post-hoc indicando che TBI era diverso da SHAM (p = 0,005). Le misure ripetute ANOVA non hanno trovato una differenza complessiva tra gruppi di lesioni a 3 mesi (p = 0,56). Questi risultati indicano che questi ratti hanno piccoli ma significativi deficit in riferimento, così come la memoria di lavoro a 3 mesi dopo la ferita.

A 12 mesi dopo la ferita, confronto prova 1 INGENUO, SHAM e TBI (Figura 5, destra), ripetuto misure ANOVA ha dimostrato un significativo effetto complessivo della ferita (F = 3,94, p = 0,03). Confronti a coppie ha rivelato che TBI era significativamente differente dal sia INGENUO e SHAM (p = 0,043 e p = 0,006., rispettivamente) (Figura 5, in basso a destra). Inoltre, confrontando la ferita gruppi ogni giorno, usando un one-way ANOVA, una differenza significativa è stata rilevata il giorno 3 (F = 7.28, p = 0,003). Il confronto post-hoc ha rivelato che TBI era diversa da SHAM (p = 0,0018) (Figura 5, in alto a destra). Per Trial 2, le misure ripetute ANOVA ha trovato una differenza significativa a causa di infortunio (F = 3,97, p = 0,029), con confronti a coppie post hoc rileva la differenza tra TBI e SHAM (p = 0,017) (Figura 5 , in basso a destra). One-way ANOVA su ogni giorno trovato differenze significative sui giorni 2 e 4. Il giorno 2 (F = 4,02, p = 0,028), test post-hoc di Tukey trovato che TBI era diverso da SHAM (p = 0,023). Il giorno 4 (F = 4.12, p = 0,026), analisi post-hoc trovano una differenza tra TBI e SHAM (p = 0,025) (Figura 5, in centro a destra).

Figura 1. Diagramma del labirinto dell'acqua. Questo diagramma illustra le posizioni di piattaforma possibile (1, 2, 3, 4) e punti di partenza (N, S, E, W) per il labirinto di Morris acqua memoria di lavoro. Ratti sono consentite due prove da ogni associazione iniziale di piattaforma di localizzazione geografica. C'è un intervallo Inter-trial di 15 s e 4 minuti di riposo in una camera di riscaldamento tra coppie di prove per un totale di quattro paia di prove per ogni sessione giornaliera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Risultati del test neuroscore. Tutti i ratti sono stati addestrati per semplici compiti di reflex test prima del giorno 0 (Vedi testo per informazioni dettagliate sulla formazione, test e segnando). Risultati sono mostrati come mediana (linea nera), primi e terzi quartili (limiti della casella) e 10^th e 90^th percentili (barre di errore). La media è inoltre indicata dalle linee rosse e dai punti periferici come puntini neri. I dati sono presentati per il giorno 0 baseline e post-lesioni giorni 1-3. I risultati del post-hoc t-test per ciascun punto di tempo sono indicati sui grafici: * p < 0,001 vs TBI giorno 0; ^ p < 0,001 vs stesso giorno INGENUO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Risultati della prova di equilibrio di fascio Tutti i ratti sono stati addestrati per bilanciare sulla trave fino a quando non hanno potuto equilibrio per 60 s su tre prove consecutive (Vedi testo per ulteriori dettagli su formazione, test e il punteggio). Il test successivi, ratti sono stati segnati su una scala da 1-6 con 1 che significa equilibrio normale e 6 non significare alcun tentativo di rimanere sulla trave. Risultati sono mostrati come mediana (linea nera), primi e terzi quartili (limiti della casella) e 10^th e 90^th percentili (barre di errore). La media è inoltre indicata dalle linee rosse e dai punti periferici come puntini neri. I dati sono presentati per la previsione del giorno 0 Punteggio, post-lesioni giorni 1-3 (a sinistra) e 6 mesi dopo la ferita (a destra). I risultati del post-hoc t-test per ciascun punto di tempo sono indicati sui grafici. Per i giorni 0-3: * P < 0,001vs TBI giorno 0; ^ p < 0.001 vs stesso giorno INGENUO; @ p < 0,001 vs stesso giorno SHAM. Per 6 mesi: * p < 0,001vs TBI giorno 0; # p < 0,001 vs INGENUO giorno 0; & p < 0,001 vs SHAM giorno 0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Risultati del fascio-Walk test. Tutti i ratti sono stati addestrati per attraversare il fascio mentre tessitura fra gli alberini di fuggire in una cassetta di sicurezza. Essi sono stati addestrati fino a quando hanno incontrato i criteri di ≤ 5 s su tre prove consecutive (Vedi testo per ulteriori dettagli su formazione, test e il punteggio). Test della linea di base è stata completata il giorno 0 e ratti sono stati successivamente esaminati nei giorni 1-3 dopo la lesione (a sinistra). Un sottoinsieme dei ratti è stato riprovato anche a 6 mesi dopo la ferita (a destra). I risultati vengono rappresentati graficamente come mediana (linea nera), primi e terzi quartili (limiti della casella) e 10^th e 90^th percentili (barre di errore). La media è anche indicata dalle linee rosse e dai punti periferici come puntini neri. I risultati dei test post-hoc per ogni punto di tempo sono indicati sui grafici. Per i giorni 0-3: * P < 0,001vs TBI giorno 0; ^ p < 0.001 vs stesso giorno INGENUO; @ p < 0,001 vs stesso giorno SHAM; Per 6 mesi: * p < 0,001vs TBI Day 0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Risultati della memoria di lavoro Morris water maze. Risultati sono mostrati per gruppi separati di ratti a 3 mesi (colonna sinistra) e a 12 mesi (colonna destra). I pannelli superiori Visualizza le latenze medie (ora ci sono voluti i ratti per trovare la piattaforma nascosta) le prime sperimentazioni dell'abbinamento di due-trial per ciascuno dei cinque giorni di test. I pannelli mostrano le latenze medie delle prove seconda ogni giorno. Risultati dell'analisi post-hoc sono indicati sui grafici (* p < 0.05 vs stesso giorno SHAM; ^ p < 0.05 vs stesso giorno INGENUO). I pannelli inferiori riepilogare i risultati mostrando la mediana (linea nera), 25^th e 75^th percentili (limiti della casella) e 10^th 90^th percentili (barre di errore). La media è inoltre indicata dalle linee rosse e dai punti periferici come puntini neri. Risultati dell'analisi post-hoc sono indicati sui grafici (*p < 0.05 vs stessa prova SHAM, ^ p < 0.05 vs stesso prova INGENUO). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Quando lo svolgimento di qualsiasi tipo di test comportamentali, è fondamentale essere coerenti. Questo dettaglio include molte considerazioni che sembrano insignificante, ma hanno un impatto importante sulla risposta dell'animale. Un passo importante che non può essere trascurato è acclimatazione degli animali alla loro situazione di home-gabbia/alloggiamento prima di qualsiasi esperimento. Questa preparazione riduce gli effetti della risposta di stress fisiologico degli animali, che possono alterare i risultati comportamentali¹⁸. Allo stesso modo, è assolutamente essenziale che ogni sforzo è fatto per gestire tutti gli animali allo stesso modo. Tale coerenza include, come accennato in precedenza, acclimatazione all'abitazione e anche acclimatazione a manipolazioni e trasporti tra camere prima formazione o test. Questo concetto non può essere sopravvalutato. Gestione animale sciatta è disastrosa per qualsiasi test comportamentali¹⁹. Allo stesso modo, ogni sforzo deve essere fatto per testare gli animali allo stesso tempo del giorno, sia durante il loro ciclo scuro o chiaro. Per le prove qui discussione, test durante la fase di chiaro o scuro è accettabile, fino a quando i test vengono eseguiti in modo coerente. Test effettuati in tempi diversi durante il ciclo circadiano è stato indicato per alterare i risultati comportamentali^18,20. Inoltre, il gestore, nonché l'animale deve essere in uno stato di libero, calma lo stress al fine di massimizzare la precisione dei risultati.

In particolare nel caso di Neuroscore, falsi positivi e negativi sono comuni. Falsi positivi si verificano in genere quando un animale non è completamente abituato alla gestione e al controllo. L'animale deve essere completamente rilassato così la risposta osservata è riflessivo e non a causa di muscoli di serraggio da reagire fuori di stress o di paura. Un gestore teso può influenzare i risultati trasmettendo lo stress per l'animale. Pertanto, tenendo il ratto troppo strette o troppo larghe possono entrambi essere problematici. Inoltre, se il gestore è nervoso, ciò può confondere la reazione dei ratti. C'è anche il rischio che un osservatore inesperto verrà non interpretino correttamente la risposta del ratto. Buon allenamento e un sacco di pratica sono essenziali per il successo e la coerenza della Neuroscore.

In generale, la preoccupazione principale con questi test è la mancanza di una grande differenza e a volte nessuna differenza, tra gruppi di trattamento. Poiché gli animali possono reagire diversamente ai diversi gestori, rumori, ore del giorno e potenzialmente, stagioni²¹, ogni sforzo deve essere fatto per ridurre tutti i fattori possibili di confusione.

I risultati delle attività di equilibrio di fascio e fascio-passeggiata mostrato qui dimostrano che questi test sono utili presto dopo la ferita per rilevare i deficit nella funzione vestibulomotor. Questi deficit in genere risolvere oltre tempo^1,14. In questo modello, entro 6 mesi dopo la ferita, i deficit indotti da lesioni hanno risolto. I risultati del punto di tempo di 6 mesi indicano che ci sono differenze tra NAIVE, SHAM o ratti feriti; Tuttavia, tutti i ratti sono stati rilassanti nelle loro gabbie casa per 6 mesi, invecchiamento e aumento di peso. Così, per il momento che sono ri-testati a 6 mesi post-chirurgia (o equivalente nel caso di INGENUO), essenzialmente stanno diventando vecchio e grasso, e pertanto tutti i gruppi non andò così bene come hanno rispetto ai loro valori basali giorno 0 risultati.

Un'altra considerazione importante è che il test di comportamento utilizzato è quello corretto. Ad esempio, i test impiegati qui sono pensati per rappresentare la funzione di specifiche aree cerebrali. Un esempio è il sistema vestibolare, che è importante per l'equilibrio. Aree del cervello coinvolte nella funzione sensitivo-motoria, come la corteccia tra cui corteccia sensorimotoria, il talamo, i neuroni corticospinali, gangli basali, nigro-striato, per citarne alcuni, sono tutti coinvolti nel coordinamento di vestibulomotor. Quindi, i deficit nell'equilibrio di fascio o fascio-passeggiata indicano potenziali carenze in questi settori. Inoltre, l'ippocampo e la corteccia prefrontale sono coinvolti nell'apprendimento e la memoria funzioni testate da labirinto dell'acqua di memoria di lavoro. Anche quando il test corretto viene scelto, le limitazioni dei test che sono impiegati devono essere tenute presente. Ad esempio, nessuno dei test qui presentati sono sensibili ai deficit di umore, come depressione, ansia o delle interazioni sociali quali aggressioni, processo decisionale o impulsività. Per ribadire, è indispensabile scegliere il test appropriato per l'area di comportamento e cervello da valutare.

Interpretazione e analisi dei dati comportamentali deve essere affrontate con cautela. Si consiglia vivamente di includere analisi di potenza di ogni tipo di prova separatamente, perché, utilizzando un risultato del comportamento come misura di un deficit neurale, è per sua natura, una misura semplice di un effetto sottile. Inoltre, test diversi richiedono diversi tipi di analisi statistiche. Ad esempio, i test di Neuroscore ed equilibrio di fascio descritti dipendono l'interpretazione di un osservatore addestrato a segnare il comportamento utilizzando una scala ordinale. Questi tipi di dati non sono continui e non normalmente distribuite, così non parametriche statistiche devono essere utilizzate, ad esempio il test di Kruskal-Wallis, come dimostrato in sezioni 6.1 e 6.2. In alternativa, il fascio-Walk e prove di lavoro memoria acqua labirinto producono dati che sono continui e distribuite normalmente, così parametriche statistiche possono essere utilizzate, come One-way ANOVA o misure ripetute ANOVA a due vie, come dimostrato in sezioni 6.3 e 6.4.

I compiti del comportamento presentati qui hanno resistito alla prova del tempo e forniscono risultati riproducibili, particolarmente quando accoppiato con il modello FPI in ratti, anche se esistono molti altri metodi di test comportamentali per il trauma cranico. La neuroscore è una breve valutazione eseguita con un minimo di attrezzatura. Altre prove di forza e riflessi sono disponibili e potrebbero essere inseriti in una valutazione neurologica, quali il compito di pulsion laterale, il test di acinesia, il test del piano inclinato e forza prensile (Vedi Fujimoto et al. ²² e oro et al. ²³). l'equilibrio di fascio e fascio-passeggiata attività descritte sono misure dei deficit di vestibulomotor dopo la ferita. Vestibulomotor coordinamento può essere considerata una misura del comportamento motorio lordo, mentre altre misure dei deficit motorio lordo includono il Rotarod, il palo rotante e aprire il campo di attività. La capacità di nuotare, misurata come velocità di nuotata durante il labirinto di acqua, è anche un'indicazione di coordinazione motoria lordo^22,23. Il compito del labirinto dell'acqua di lavoro memoria completa questo set di test di rilevazione entrambe fanno riferimento i deficit di memoria (indicati da Trial 1) e lavorando i deficit di memoria (indicati da Trial 2 o la differenza tra prova 1 e prova 2). Altre misure della funzione conoscitiva includono il labirinto radiale a otto bracci, il labirinto di Barnes, il test di riconoscimento di oggetto romanzo e diverse varianti del labirinto dell'acqua. Queste variazioni includono l'originale labirinto di acqua di Morris e il labirinto di Lashley III (nuovo Vedi Fujimoto et al. ²² e oro et al. ²³). questa batteria di test ha dimostrato di essere utile presto dopo la lesione e, in misura diversa, fuori a 12 mesi dopo la ferita¹.

Inoltre, le attività hanno dimostrate qui possono essere utilizzate con diversi ceppi, il sesso ed età dei ratti; Tuttavia, gli alloggi potrebbero essere necessario prevedere diverse dimensioni e nei casi di maggiore fragilità. Per esempio, ratti anziani, più pesante bisogno un fascio più ampio per l'attività di equilibrio di fascio e ratti invecchiati, fragile, potrebbe bisogno di minore durata dei tempi di nuotare nell'acqua labirinto. Così, c'è spazio alla flessibilità in questi test e potenziale per lo sviluppo di nuovi test per ospitare ipotesi e situazioni diverse.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles Rivers Laboratories 251 Ballardvale St Wilmington, MA 01887-1096 Phone: 800-522-7287	CD-IGS rats, strain code 001	male, albino, 300-350g at arrival
Name	Company	Catalog Number	Comments
Beam-Balance
Beam	home built		wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish
C-clamp	Home Depot	1422-C	2 1/2"
barrier	Home Depot		styrofoam, 18" x 17 1/2"
table (for both BB & BW)	generic office supply		37" h x 30" w x 60" l
Name	Company	Catalog Number	Comments
Beam-Walk
Beam	home built		wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor)
escape box	home built		woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w
nails (pegs)			2"
hinges
clamps
white noise machine	San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600		http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
light	Home Depot
Name	Company	Catalog Number	Comments
Morris Water Maze
fiberglass pool	manufacturer unknown
(similar to one made by SDI)	San Diego Instruments	7000-0723	72" diameter x 30" deep (~ 500 gal)
plexiglass platform	hand-made by Maggie Parsley		10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface
(similar to one made by SDI)	SDI	7500-0272
plexiglass animal boxes w/ lids	UTMB Machine Shop		2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h
spot lights/ heat lamps	Home Depot		3 around pool, 2 over boxes to dry animals
AnyMaze	San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600	/9001	http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/