Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Resumen

Describimos una plataforma basada en el chip para el cultivo en tres dimensiones de las células de micro-biorreactores. Un chip puede albergar hasta 10 millones de euros. células que pueden ser cultivadas bajo condiciones definidas con precisión en lo que respecta al flujo de fluidos, etc tensión de oxígeno en un asa estéril, cerrado de circulación.

Resumen

Hemos desarrollado un sistema de pila de chips basados ​​en la cultura para el cultivo en tres dimensiones de las células. El chip es normalmente fabricados a partir de polímeros no biodegradables, por ejemplo, policarbonato o polimetacrilato de metilo mediante moldeo por inyección micro, micro o estampado en caliente de termoformado micro. Sin embargo, también puede fabricarse a partir de polímeros biodegradables. Sus dimensiones son de 0.7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (hxwxl). Las principales características de los chips utilizados son una red de hasta 1.156 cúbicos micro-contenedores (cf-chip) cada uno del tamaño de 120 a 300 x 300 x 300 μ (hxwxl) o huecos redondos con un diámetro de 300 μ y una profundidad de 300 μ (r-chip). El andamio puede albergar a 10 millones. celdas en una configuración en tres dimensiones. Para un óptimo de nutrientes y suministro de gas, el chip se inserta en una carcasa de bio-reactor. El biorreactor es parte de un circuito cerrado de circulación de esterilización que, en la configuración más simple, es adicionalmente consta de una bomba de rodillo y un depósito medio de un suministro de gas. El biorreactor puede ser ejecutado en la perfusión, superfusión, o incluso un modo de operación mixta. Nos han cultivado con éxito líneas celulares y células primarias en períodos de varias semanas. Para las células de hígado de rata primaria que podría mostrar una preservación de las funciones organotípicos por más de 2 semanas. Para las líneas celulares de carcinoma hepatocelular que podría mostrar la inducción de genes específicos de hígado o no expresa sólo un poco en la cultura monocapa estándar. El sistema también podría ser útil como una célula madre del sistema de cultivo ya que los experimentos primera diferenciación con líneas de células madre fueron prometedores.

Protocolo

Este documento describe el uso de una plataforma basada en el chip (fig. 1) para el cultivo en tres dimensiones de las líneas celulares y células primarias. Dado que muchas células se expresan las funciones organotípicos sólo en un entorno 3D, hemos desarrollado un chip de polímero que ofrece un andamio para que las células pueden adherirse en todas las direcciones espaciales, y que puede ser montado en una carcasa de biorreactor para el control del flujo de fluidos , etc tensión de oxígeno Dependiendo del diseño experimental, la superficie del polímero puede ser modificado por diversas técnicas, por ejemplo, radiación UV, PECVD, γ-injerto o química húmeda convencionales.

Figura 01

1. Desaireación y hidrófilos del chip

Antes de su uso, el chip tiene que ser desaireada y hydrophilized. Para ello, una serie de alcohol se lleva a cabo. Soluciones de isopropanol que consta de 100%, 70%, 50%, 30% de isopropanol en DMPC agua tratada se preparan y el chip se sumerge en cada concentración, a partir de la solución al 100%, para un máximo de 30 años. El paso final de la serie se compone de pirocarbonato pura de dimetilo (DMPC) de agua tratada. A partir de ahora, es importante para mantener húmedo el chip.

2. Colágeno I recubrimiento

Después de la serie de alcohol, el chip es generalmente recubierto con una solución de colágeno I de la cola de rata. De la solución madre de colágeno de 2 mg / ml en el 0,2% de ácido acético una alícuota correspondiente al 30 mg de proteína de colágeno se diluye con agua tratada con DMPC a un volumen final de 150 microlitros. Esto da como resultado una capa de colágeno de la superficie del chip, con una densidad de 10 mg de colágeno I por cm ² de superficie.

3. La inoculación de las células de carcinoma hepatocelular

Células de carcinoma hepatocelular de la línea Hep G2 se trypsinized y contados. Para experimentos a corto plazo (1 a 6 días) 5 * 10 ⁶ células se inoculan en cada chip y el correspondiente control de 6 cm placas de cultivo tisular petri. Para inoculte, el chip de 5 * 10 ⁶ células se resuspenden en 150 l medio de cultivo y se coloca en la parte superior de la zona de microestructura del chip (fig. 2). Posteriormente, se coloca en una incubadora durante 2-3 horas. Durante este período de incubación de las células de los sedimentos en los contenedores de micro-y se adhieren al colágeno I recubierto de andamios.

Figura 2

4. La inserción del chip en la caja del biorreactor

Después del período de incubación, el chip se retira de la incubadora y montado en el alojamiento biorreactor. Para ello, bajo la mesa de trabajo limpia, el biorreactor premontados se retira del embalaje estéril y desmontado en un grado que permita la inserción del chip. El chip se manipulan con cuidado con una pinza estéril y se coloca en la ranura que contiene la junta que sella el chip y que se traduce en la generación de un compartimiento superior e inferior en el biorreactor. Entonces, el biorreactor se reunieron de nuevo y trasladado a la incubadora donde se encuentra conectado a la bomba, el suministro de gas y el analizador de oxígeno.

5. Llenado del sistema

Tan pronto como el bio-reactor está conectado al depósito medio, la bomba y el suministro de gas del circuito cerrado de circulación se llena con el medio. Esto se realiza mediante la colocación de la forma de 3 conectores de tal manera que superfusión, que se define como el flujo del medio sobre la parte superior del chip, se logra. Esto lleva a una descarga de aire encerrado de la circulación biorreactor sin eliminar las células del andamio. Después de que el sistema esté completamente lleno con el medio, la forma de 3 conectores están conectados de tal manera que la perfusión, que se define como el flujo por debajo del chip a través del tejido, se consigue. En la configuración de la perfusión de la circulación se ajusta a las necesidades de la célula que normalmente oscila en los hepatocitos 60 hasta 500 l / min.

6. Muestreo

Durante el experimento, las muestras de medio se pueden extraer. Para ello, las jeringas están conectadas a los puertos de estériles en la parte superior del depósito medio. Después de la toma de muestras, los puertos se esterilizan con isopropanol al 70%.

7. El aislamiento de las células intactas del chip para aplicaciones de aguas abajo

Al final del experimento, los biorreactores están desconectados del suministro de gas y la bomba de rodillos, trasladado a la mesa de trabajo limpia y desmontada como se describió anteriormente. Con una pinza estéril el chip se retira de la vivienda biorreactor, puestoen un 3,5 cm placa de Petri y se enjuagaron con PBS. Posteriormente, el chip se incubaron con tripsina / EDTA (0,25% / 0,53 mm) durante 5-15 minutos en una incubadora para separar las células de la zona de microestructura. La suspensión de células recogidas se centrifuga durante 5 minutos a 600 g. Las células se pueden utilizar para las aplicaciones convencionales de aguas abajo, por ejemplo, el ARN, total o aislamiento de las proteínas. De manera rutinaria, se aísla el ARN total (PARIS kit, Ambion Inc., Austin, Texas, EE.UU.) para el análisis de microarrays y en tiempo real RT-PCR. Expresión de la proteína se analiza después de la tinción inmunohistoquímica de las células dentro del chip con un microscopio de barrido láser, pero también se puede analizar de otra manera, por ejemplo, mediante citometría de flujo.

Discusión

Hemos desarrollado una plataforma basada en el chip para el cultivo en tres dimensiones de las células en biorreactores activamente perfusión micro. Los chips pueden ser fabricados a partir de no-biodegradables, así como polímeros biodegradables por moldeo por inyección micro, estampado en caliente y micro técnicas de termoformado ^3. Dependiendo del diseño experimental, la superficie del polímero puede ser modificada por ^cuatro radiación UV. Líneas de hepatocitos celular, así como hepatocitos primarios de ra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells	Other	ATCC	HB-8065
Collagen I from rat tail	Reagent	Roche Group	11 179 179 001
PARIS kit	Reagent	Ambion	AM1921
Syto16	Reagent	Invitrogen	S7578
anti cytokeratin 18	Antibody	Abcam	ab668	Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS
Anti E-cadherin	Antibody	Abcam	ab1416	Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS.
Goat anti-albumin	Reagent	Bethyl Laboratories	E80-129	Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS
Rabbit anti-mouse IgG1	Antibody	Invitrogen	A11059	Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA
Cy3 anti-goat IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA