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Resumen

Se describe un protocolo para generar la proliferación y fibroblastos dérmicos humanos primarios quietos, seguimiento las tasas de decaimiento de transcripción y la identificación de genes diferencialmente decadentes.

Resumen

Quietud es un estado temporal, reversible en el que las células han dejado de división celular, pero conservan la capacidad de proliferar. Varios estudios, incluido el nuestro, han demostrado que la quietud se asocia con cambios generalizados en la expresión génica. Algunos de estos cambios se producen a través de cambios en el nivel o la actividad asociada a la proliferación de factores de transcripción, como E2F y MYC. Hemos demostrado que el decaimiento del mRNA también puede contribuir a cambios en la expresión génica entre células proliferantes y quietas. En este protocolo, se describe el procedimiento para el establecimiento de culturas quietas y proliferación de fibroblastos humanos de prepucio cutáneo. A continuación describimos los procedimientos para inhibir la nueva transcripción en las células proliferantes y quietas con actinomicina D (ActD). ActD tratamiento representa un enfoque sencillo y reproducible a disociar la nueva transcripción de la descomposición de la transcripción. Una desventaja del ActD tratamiento es que el curso del tiempo debe ser limitado a un corto plazo porque ActD afecta la viabilidad celular. Niveles de transcripción son monitoreados en el tiempo para determinar las tasas de decaimiento de transcripción. Este procedimiento permite la identificación de genes y de isoformas que exhiben decaimiento diferencial en proliferación contra fibroblastos quiescentes.

Introducción

Niveles de estado estacionario de transcripciones reflejan la contribución de síntesis transcripción y decaimiento de la transcripción. Regulado y coordinado de la transcripción es un importante mecanismo de control de procesos biológicos1,2,3,4. Por ejemplo, tasas de decaimiento de transcripción han demostrado para contribuir a la serie temporal de acontecimientos después de la activación por el factor de necrosis tumoral citoquinas inflamatorias del5.

Previamente hemos demostrado que la transición entre la proliferación y quietud en fibroblastos humanos primarios se asocia con cambios en los niveles de transcripción de muchos genes6. Algunos de estos cambios reflejan las diferencias en la actividad de factores de transcripción entre estos dos Estados.

Cambios en la tasa de decaimiento de una transcripción también pueden contribuir a cambios en el nivel de expresión de una transcripción en dos diferentes Estados7,8. Basado en los resultados anteriores que la transición entre la proliferación y la inactividad se asocia con cambios en los niveles de varios microRNAs9, le preguntamos si también hay una contribución de la descomposición de la transcripción diferencial de los cambios expresión génica en proliferación contra fibroblastos quiescentes.

Para monitorear la estabilidad de la transcripción, se determinó la tasa de decaimiento de las transcripciones genoma en proliferación versus células quiescentes. Para lograr esto, supervisamos las tasas de decaimiento en proliferación contra fibroblastos quiescentes introduciendo un inhibidor de la transcripción nueva y monitoreo de la tasa en que desaparecieron expedientes individuales con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que, en comparación con los métodos que simplemente controlar la expresión génica global, por inhibición de la síntesis nueva de transcripción, seremos capaces de determinar la tasa de decaimiento de estas transcripciones por separado de la tasa a la que son transcrito.

ActD tratamiento para inhibir transcripción nueva y para determinar las tasas de decaimiento de transcripción se ha aplicado con éxito en múltiples estudios anteriores. ActD se ha utilizado para disecar la importancia de la estabilidad del RNA en los cambios en la abundancia de transcripción que resultan del tratamiento con citoquinas proinflamatorias5. Un enfoque similar también se ha utilizado para disecar las diferencias en la tasa de decaimiento de transcripción en proliferación versus células C2C12 diferenciadas como adoptan un fenotipo muscular diferenciado del10. Otro ejemplo, global mRNA vida media también se han detectado en pluripotentes y11de las células madre embrionarias de ratón distinguido. En estos ejemplos, decaimiento del mRNA se ha demostrado para ser importante para la regulación de la abundancia de transcripción y para la transición de células a células diferentes Estados.

Aplicación de los métodos descritos a continuación, descubrimos cambios en las tasas de decaimiento de la transcripción en aproximadamente 500 genes cuando se comparan los fibroblastos en proliferación y quieto Estados12. En particular, hemos descubierto que los objetivos del microRNA miR-29, que es regulada en células quiescentes, se estabilizan cuando las células de transición a la inactividad. Aquí describimos la metodología que se utilizó para determinar las tasas de decaimiento en las células proliferantes y quietas. Esta metodología es útil para comparar las tasas de decaimiento mRNA mundiales en dos distintos pero similares condiciones cuando se busca información sobre genes el decaerse rápidamente. También podría utilizarse para abordar otras cuestiones como el efecto de las condiciones de cultivo celular en decaimiento de la transcripción, por ejemplo, en dos dimensiones versus tres culturas dimensionales. Las tasas de decaimiento pueden ser genoma determinado con métodos tales como microarrays o RNA-seq. alternativamente, qPCR en tiempo real o el borrar norteño puede utilizarse para determinar las tasas de decaimiento en una base de gen por gen o isoforma de la isoforma. Estas tasas pueden utilizarse para calcular la vida media de cada gen supervisada y para identificar genes con índices de caries que son diferentes en dos condiciones.

Protocolo

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por comités de revisión institucional en la Universidad de Princeton y la Universidad de California, Los Ángeles.

1. preparar los fibroblastos proliferantes y contacto-inhibido para ActD tiempo curso

Nota: Este protocolo usa una timecourse con cuatro puntos de tiempo. Pueden recogerse tres muestras biológicamente independientes por punto por la recogida de las placas de cultivo de tejidos diferentes en un experimento, o el experimento puede repetirse varias veces con diferentes culturas de las células. En nuestra experiencia, un plato de cultivo de tejidos de 10 cm (diámetro) (una placa) proporciona suficiente RNA para el análisis. Si es necesario, pueden combinarse múltiples platos de cultivo de tejidos para que cada muestra incrementar el número de células en cada punto. Además, se puede realizar el mismo experimento con fibroblastos aislados de diferentes individuos como Replica biológica verdaderamente independiente.

  1. Establecer culturas quietas y proliferación de células para el análisis de descomposición de la transcripción. Para las células proliferantes, dividir las células cada tres días mientras que las células inhibición de contacto están llegando a ser inhibida por el contacto.
    1. Para las células inhibición de contacto, cambiar el medio cada 2 días durante 7 días. Dividir las células proliferantes 2 días antes de los fibroblastos de la inhibición de contacto están listos para la colección. En la figura 1se muestra un ejemplo de un esquema de cultura de célula. Los pasos restantes de esta sección proporcionan un protocolo detallado para el establecimiento y división de las células.
  2. Fibroblastos dérmicos primarios aislados de la piel neonatal según protocolos establecidos13. Fibroblastos de pasaje para una población homogénea.
    Nota: Fibroblastos pueden ser congelados y descongelados, si es necesario.
  3. Descongelar o replate fibroblastos, si es necesario. Crecer fibroblastos en DMEM con 10% de suero bajo condiciones estériles en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% CO2. Utilice los fibroblastos que han crecido de menos de 10 pasos. Fibroblastos deben ser < 80% confluente en el día de la división de las células formando poblaciones proliferación y quietas.
  4. Para dividir una placa de cultivo de tejidos en múltiples placas, precalentamiento PBS, tripsina y medio con suero en un baño de agua de 37 ° C por 20 min.
  5. Aspirar o utilice una pipeta para extraer el medio de cada placa de cultivo de tejidos con células para ser replated.
  6. Pipeta PBS caliente en cada plato (10 mL de solución para una placa de 150 mm, 5 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6) y 1 mL para un pozo de una placa bien 12.
  7. Aspirado o pipeta para extraer PBS de cada placa de cultivo de tejidos.
  8. Suavemente la pipeta 1 x tripsina-EDTA en cada plato (8 mL de solución para una placa de 150 mm, 3 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6 y 1 mL para un pozo de una placa bien 12).
    Nota: Hacer 1 x tripsina-EDTA diluyendo estéril 10 x tripsina-EDTA en PBS estéril. La solución final 1 x debe ser 0,05% 0,02% y tripsina EDTA.
  9. Incubar tripsina con células durante 5 minutos.
  10. Golpear suavemente la placa para desalojar las células de la placa.
  11. Pipeta para resuspender las células en una suspensión unicelular.
  12. Transferencia de células en solución de tripsina a un tubo cónico que contiene el mismo volumen de DMEM con 10% de suero (8 mL de solución para una placa de 150 mm, 3 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa de la pozo 6 y 1 mL para un pozo de 12 bien la placa).
  13. Desactivación de las células a 4 ° C durante 5 minutos a 1.000 x g para eliminar tripsina.
  14. Resuspender las células en un volumen adecuado de medio y cuentan con un hemacitómetro para determinar la concentración de la célula.
  15. 5 x 105 células por placa de cultivo de tejidos de 100 mm para la proliferación y células inhibidas por el contacto de la semilla.
  16. Usando este método, establecer las muestras proliferación e inhibida de contacto requeridas para el análisis (figura 1).

2. ActD tiempo curso

  1. Resuspender ActD a una concentración stock de 1 mg/mL (1 mg de ActD, uso 950 μl de PBS estéril y 50 μl de DMSO estéril).
    Nota: Soluciones congeladas del ActD deben ser estables durante un mes a-20 ° C. Soluciones diluidas deben ser descartadas y no almacenadas para su uso posterior.
  2. Añadir ActD al volumen adecuado de medio precalentado para cultura biológica celular replicar todas las placas que fueron fijados por el 0, 120, 240 y 480 min horarios (figura 2). Añadir ActD a una concentración de 15 μg por mL de medio. Mezcla bien aspirar apagado el medio viejo y añadir medio ActD-que contiene a las células.
    1. Para un stock de 1 mg/mL, añadir 15 μl ActD por cada mL de medio, por ejemplo, para 10 mL de medio por placa de 100 mm, añadir 150 μL ActD.
  3. Para recolectar la muestra de punto cero, aspirar suavemente el medio ActD y pipeta precalentada PBS en las células. Pipeta 10 mL de solución para una placa de 150 mm, 5 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6 y 1 mL para un pozo de una placa bien 12.
  4. Aspirar suavemente o pipeta de PBS.
    Nota: Todos los pasos que implica aislamiento de RNA deben realizarse con agua libre de ARNasa, libre de ARNasa tubos de microcentrífuga y pipetas libres de Rnasa. Guantes deben ser usados y cambiados con frecuencia cuando se trabaja con el ARN.
  5. Añadir solución de isotiocianato de guanidina fenol (1 mL/10 cm placa con 4 x 105 a 4 x 107 células) directamente a la placa de cultivo de tejidos.
    Nota: Solución de isotiocianato de guanidina fenol es una solución monofásica que mantiene la calidad del RNA durante la lisis de las células y separación de RNA, DNA y proteínas entre sí.
    PRECAUCIÓN: El fenol con isotiocianato de guanidina son corrosivos. Usar protección adecuada.
  6. Pipeta el fenol-guanidina isotiocianato solución celular la mezcla arriba y abajo varias veces para hacer una mezcla homogénea.
    Nota: La solución de isotiocianato de guanidina fenol lisado puede guardarse a 4 ° C durante la noche o a-20 ° C por hasta un año.
  7. Recoger cada momento transcurrido la cantidad apropiada de tiempo utilizando el método descrito en pasos 2.3-2.6.

3. aislamiento de ARN Total de isotiocianato de guanidina fenol solución lisado

  1. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos asegurar la completa disolución de complejos RNA-proteína.
    Nota: Los pasos del Protocolo de solución de isotiocianato de guanidina fenol pueden realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
  2. Introducir transcripciones de spike en el control que pueden ser detectadas con la metodología utilizada.
Introducir estos controles en cada muestra en una cantidad conocida y concentración.
Nota: El externo RNA control consortium (ERCC) spike en control mix14 ha sido específicamente diseñado como un punto de control para RNA-seq. También puede usarse para Norte Blot o qPCR en tiempo real. Spike en controles diseñados específicamente para tecnologías de microarrays están también disponible (véase Tabla de materiales).
  • Transferir la mezcla de solución de isotiocianato de guanidina de fenol a un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL con una pipeta. Añadir 0,2 mL de cloroformo a la mezcla de solución de isotiocianato de guanidina fenol por cada 1 mL de solución de isotiocianato de guanidina fenol utilizada (por ejemplo, Añadir 0.3 mL cloroformo a 1,5 mL fenol-guanidina isotiocianato solución de una mezcla).
  • Agitar el tubo de microcentrífuga vigorosamente durante 15 s y luego incubar la mezcla isotiocianato de guanidina-fenol-cloroformo a temperatura ambiente durante 3 minutos.
  • Centrifugado de muestras a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 ° C.
    Nota: Después de la vuelta inicial, la muestra debe separar en 3 capas - una capa orgánica roja en la parte inferior, una interfase de blanco/color de rosa en el centro y una capa clara acuosa en la parte superior (figura 3).
  • Transferir la capa acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga 2.0 mL usando una micropipeta.
    Nota: Tenga cuidado de no alterar la interfase durante este proceso. Está bien dejar parte de la fracción acuosa. Es mejor dejar a parte de la fracción acuosa que para también incluir algunas de las capas de interfase, como la interfase capa contaminaría el ARN con el ADN. La capa acuosa será aproximadamente la mitad del volumen inicial, hasta cerca de 0,9 mL de la mezcla de solución/cloroformo isotiocianato de guanidina de fenol fue de 1,8 mL.
  • Deseche la interfase y la fracción orgánica.
  • Añadir un volumen igual de 2-propanol a la fracción acuosa e invertir el tubo 10 veces. Añadir hasta 1 μl de solución acuosa de 20 mg/mL de glucógeno por 20 μl de muestra, especialmente si la producción se espera que sea baja porque obtuvieron menos de 106 células.
    Nota: Esto resultará en un pellet denso, sólido que es fácil de controlar tras los pasos de la vuelta que seguirán.
  • Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  • Centrifugado de muestras a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 ° C. Asegurarse de que, al final de esta vuelta, el ARN se precipitó para formar una pelotilla blanca en la parte inferior del tubo.
  • Con una pipeta, retire y descarte el sobrenadante teniendo especial cuidado de no perturbar el pellet de RNA blanco.
    Nota: Una punta de la pipeta sueltas sostenida en la mano se puede utilizar para quitar exceso etanol. Si el pellet de RNA está perturbado, pero no descarta, el investigador puede repetir la vuelta y quitar el sobrenadante nuevamente. Evitar desechar el precipitado como esto exigirá al investigador a repetir todo el procedimiento.
  • Preparar una solución de 75% etanol y 25% agua libre de nucleasa. Añadir 1 mL de etanol al 75% por 1 mL de reactivo de solución de isotiocianato de guanidina fenol para lavar el pellet.
  • Centrifugado de muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
  • Después de quitar la mayor parte del sobrenadante, utilice una pipeta para extraer tanto etanol como sea posible, mientras que todavía teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
    Nota: El pellet de RNA es menos compacto en este paso y tiende a moverse. Ser muy cuidadoso al manipular el diábolo en este punto para evitar perder el ARN.
  • Hacer girar muestras 12.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente para que sedimenten todas etanol exceso.
  • Retire todo exceso etanol el tubo usando una micropipeta teniendo cuidado para no perturbar el sedimento.
  • Deje que el RNA pellets aire seco durante 5 minutos.
  • Añadir 50 μl de agua libre de nucleasa para el pellet de RNA y resuspender el precipitado en el agua libre de nucleasa.
  • Tratar las muestras con 1 μl de DNasa (2 unidades/μL) para eliminar el ADN y luego inactivar DNasa y cationes (véase Tabla de materiales).
  • Almacenar las muestras de RNA en tubos de microcentrífuga de 2,0 mL a-80 ° C.

    • 4. Análisis de la abundancia de transcripción

    1. Cuantificar RNA y RNA busque pureza utilizando un espectrofotómetro.
      Nota: La proporción de absorbancia a 260 nm y 280 nm debe ser aproximadamente de 2.0 para el ARN.
    2. Análisis RNA con un gel de agarosa al 1% o una tecnología equivalente a visualizar el grado de degradación.
      Nota: Dos claras bandas representando a 18S y 28S rRNA debe ser claramente visible (figura 4). Si estas bandas no son visibles, puede degradar el ARN. Consejos tiros problemas de degradación de RNA se encuentran en la discusión.
    3. Monitor la abundancia de transcripción en las alícuotas recogidas de ARN en comparación con el tacon de estándar interno utilizando microarrays15, RNA-Seq16, qPCR en tiempo real17, o Northern blots18.
      1. Determinar la abundancia de cada transcripción en cada punto de tiempo en comparación con un tacon en el control de conocida abundancia.
        Nota: Para microarrays, los valores serán intensidades de fluorescencia. Para lacras norte, bandas en la película de rayos x se pueden cuantificar. Para qPCR en tiempo real, abundancia de transcripción puede determinarse por comparación con estándares conocidos con el 2- σσCT método19. Para RNA-Seq, valores normalizados pueden determinarse como FPKM o fragmentos por kilobase del exón por millones Lee asignados. Para las tasas de decaimiento de la isoforma específica, datos de RNA-Seq pueden analizarse utilizando metodologías isoform-consciente como DEXSeq20. Las tasas de decaimiento de la isoforma específica se determinan mejor con RNA-seq. Si han de determinarse con los datos de microarray, los datos deben ser analizados en una punta de prueba en lugar de una base de gen por gen. El analista debe tener cuidado al interpretar la información de un número limitado de sondeos. Por ejemplo, pueden ser 5 o menos las puntas de prueba que son de caracter informativos sobre una determinada isoforma. En este caso, el analista tendrá que determinar si el comportamiento de estas sondas es lo suficientemente consistente para que los resultados son confiables.
    4. Realizar en tiempo real qPCR el RNA aislado17 en las muestras recolectadas para analizar genes rápidamente que se decae, como c-Myc y un gen lentamente que se decae como GAPDH, ganar la confianza eso decaimiento de transcripción las tasas fueron detectadas con precisión.
      Nota: Para más confirmación, sondas qPCR en tiempo real de la isoforma específica pueden ser desarrolladas y utilizadas para monitorear la abundancia de isoformas específicas por tiempo21.

    5.Determinación del ritmo de decaimiento constante

    1. Para cada punto de tiempo, registro de transformación de los valores de abundancia de cada transcripción (gen-isoforma específica o).
      Nota: Transformación de registro de los valores convertirá curvas de decaimiento exponencial en líneas que se pueden caber con un decaimiento lineal modelo22.
    2. Encajan en el perfil de expresión de cada transcripción (gen-isoforma específica o) a un modelo de decaimiento lineal. La fórmula de este modelo es f (t) = C - r * t. En esta ecuación, C es una constante que representa la cantidad a partir de una transcripción, r es la tasa de disminución, y t es el tiempo desde el inicio del experimento. De esta ecuación, determinar la velocidad de descomposición como r*ln(10) (ver referencia11).
      Nota: El paquete de software maSigPro es un enfoque de regresión diseñado para detectar diferencias de Perfil de expresión genética significativa en tiempo curso datos23. Resultados para maSigPro y código de ejemplo están disponibles en: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
    3. Filtrar los genes que no ajustar un modelo log-lineal de la desintegración. Esto se puede lograr con una prueba F de ANOVA.
      Nota: la prueba F se basa en el estadístico F, que se define como la variación entre medias de la muestra dividida por la variación dentro de las muestras. Corregir los valores de p para las comparaciones múltiples mediante la aplicación de la lineal elevador Benjamini y Hochberg false discovery procedimiento24. Un valor de q mayor que 0.05 con el F-test puede utilizarse como un atajo para los genes que no ajustar un modelo log-lineal de la desintegración.
    4. Realizar una prueba F de ANOVA para determinar las transcripciones con un término de interacción significativa entre una condición categórica de ciclo celular y el tiempo (tasa de falso descubrimiento, FDR < 0.05).

    Resultados

    Hemos divulgado previamente los resultados de análisis de microarray de las tasas de decaimiento de transcripción en fibroblastos humanos primarios proliferación e inhibida por el contacto durante un tiempo de 8 horas curso12. Se proporciona una lista de genes con un cambio significativo en la estabilidad de la transcripción comparación de fibroblastos proliferantes y contacto-inhibida en la tabla adicional 1. Se proporcionan las intensidades ...

    Discusión

    Quietud puede ser inducida por señales externas, incluyendo retiro de mitógenos o suero, falta de adhesión celular y la inhibición de contacto. Inhibición de contacto, uno de varios posibles métodos para inducir la quietud, es un proceso altamente evolutionarily conservado en el que las células de salida ciclo celular proliferativo en respuesta a contacto de célula a célula. Nos centramos aquí en inhibición de contacto como un ejemplo de un método para inducir la quietud. Estudios previos han reportado que co...

    Divulgaciones

    Los autores tienen intereses que compiten a revelar.

    Agradecimientos

    HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones para HAC (P.I. David Botstein), Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General del centro de la beca de excelencia P50 GM071508 PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, ciencia nacional Fundación beca OCI-1047879 David agosto, Nacional Institute of General Medical Ciencias R01 GM081686, Instituto Nacional de ciencias médicas General R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center de medicina regenerativa & investigación con células madre, centro de salud/UCLA CTSI NIH de la mujer Iris Cantor Grant UL1TR000124 y la sociedad de la leucemia linfoma. Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P50CA092131. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. HAC es un miembro del Eli & Edythe amplia centro de medicina regenerativa & investigación con células madre, el Instituto de Biología Molecular de la UCLA y el programa interdepartamental de Bioinformática de UCLA.

    Materiales

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C
    Equipment for running agarose gels
    Sterile tissue culture plates and conical tubes
    Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-118
    Fetal bovine serumVWR35-010-CV
    Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture
    Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis
    Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples
    RNaseZapInvitrogenAM9780For decontaminating work surfaces from RNase
    2.0 ml eppendorf tubes
    Trypsin-EDTA  Solution 10XMillipore Sigma9002-07-07
    Sterile PBSLife Technologies14190-250
    TrizolThermo Fisher Scientific15596018
    Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mginhibits transcription
    Sterile DMSOFisher Scientific31-761-00MLsolvent for actinomycin D
    ChloroformThermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc product
    IsopropanolFisher ScientificBP2618500molecular biology grade
    EthanolFisher ScientificBP28184molecular biology grade
    RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)Thermo Fisher ScientificR0551carrier for RNA precipitation
    TURBO DNA-free KitThermo Fisher ScientificAM1907removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,  inactivates DNA and removes divalent cations
    AgaroseThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc product
    Loading dye for RNA gelThermo Fisher ScientificR0641suitable even for denaturing electrophoresis
    Millenium RNA markersThermo Fisher ScientificAM7150RNA ladder
    One-color RNA Spike-in KitAgilent Technology5188-5282Example spike-in control for Agient microarray analysis
    Tris baseFisher ScientificBP152-1molecular biology grade, for TAE buffer
    Glacial acetic acidFisher ScientificA38-500for TAE buffer
    EDTAFisher ScientificBP120-500electrophoresis grade, for gels
    Ethidium bromideMillipore SigmaE7637for molecular biology
    External RNA Controls Consortium RNA Spike-in MixThermo Fisher Scientific4456740Spike-in control for RNA Seq
    TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)IlluminaRS-122-2101for RNA Seq
    96-well 0.3 ml PCR plateThermo Fisher ScientificAB-0600for real-time qPCR
    Microseal B adhesive sealsBio-RadMSB1001for real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free Reagent ReservoirsVWR89094-662for real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free Eight tube strips and capsThermo Fisher ScientificAM12230for real-time qPCR
    SuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010for real-time qPCR
    AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880for real-time qPCR

    Referencias

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