JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Transkript çürüme oranları izleme ve differentially çürüyen genlerin belirlenmesi için bir protokolü üreten Proliferasyona ve durgun birincil insan dermal fibroblastlar, açıklayın.

Özet

Sendika hangi hücreleri hücre bölünmesi kesildiği tarih var, ancak kapasitesi çoğalırlar korumak tersine çevrilebilir, geçici bir durumdur. Bizimki de dahil olmak üzere birden fazla çalışmalar sendika gen ekspresyonu yaygın değişiklikler ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu değişikliklerin bazıları düzeyi veya etkinlik E2F ve MYC gibi nükleer silahların yayılmasına karşı ilişkili transkripsiyon faktörlerin değişiklikleri yoluyla ortaya çıkar. MRNA decay gen ekspresyonu Proliferasyona ve durgun hücreler arasında değişimler de katkıda bulunabilir göstermiştir. Bu protokol için insan dermal sünnet fibroblastlar Proliferasyona ve durgun kültürleri oluşturma yordamı açıklanmaktadır. O zaman Actinomycin D (ActD) ile Proliferasyona ve durgun hücrelerdeki yeni transkripsiyonu inhibe için yordamlar açıklar. ActD tedavi transkript çürüme yeni transkripsiyon dissociating için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım temsil eder. Bir ActD tedavi ActD hücre canlılığı etkilediğinden zamanlı Kurs için bir kısa zaman dilimi sınırlı olmalıdır dezavantajdır. Transkript düzeyleri transkript çürüme hızı için zaman içinde izlenir. Bu yordam, genler ve karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde fark çürüme sergi izoformlarının tanımlanması için verir.

Giriş

Transkript düzeyde kararlı duruma katkı transkript sentezi ve transkript çürüme yansıtır. Düzenlenmiş ve koordine transkript çürüme biyolojik süreçlerin1,2,3,4kontrol etmek için önemli bir mekanizmadır. Örneğin, transkript çürüme oranları etkinleştirme aşağıdaki olaylar zamansal serisi için katkıda bulunmak için inflamatuar sitokin tümör nekrozis faktör5tarafından gösterilmiştir.

Biz daha önce yayılması ve birincil insan fibroblast sendika arasında geçiş değişiklikleri birçok genler6transkript düzeyleri ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu değişikliklerin bazıları bu iki devlet arasında transkripsiyon faktörleri Faaliyet farklılıkları yansıtmaktadır.

Transkript'ın çürüme oranı değişiklikleri de değişiklikleri bir transkript iki farklı devletler7,8ifade düzeyde katkıda bulunabilir. Yayılması ve sendika arasında geçiş değişiklikleri birden çok mikroRNA'lar9düzeyleri ile ilişkili olduğunu bizim önceki bulgular dayanarak, biz de değişiklikleri fark transkript çürümesi bir katkı olup sordu karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde gen ekspresyonu.

Transkript istikrar izlemek için transkript genom genelinde karşı sakin hücreleri Proliferasyona çürüme oranı belirlenir. Bunu başarmak için yeni transkripsiyon bir inhibitörü tanıtımı ve hangi zaman içinde bireysel transkript kayboldu oranı izleme karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde çürüme oranları izlenir. Bu yaklaşımın avantajı yeni transkript sentezini inhibe tarafından genel gen ekspresyonu, sade bir şekilde izlemek yöntemleri ile karşılaştırıldığında, biz bu Tutanaklar ayrı ayrı hangi onlar are kurundan çürüme oranı belirlemek mümkün olmasını, olur transkripsiyonu.

ActD tedavi yeni transkripsiyonu inhibe ve transkript çürüme hızı birden çok önceki çalışmalarda başarıyla uygulandı. ActD pro-inflamatuar sitokinlerin5ile tedavi sonucu transkript bolca RNA istikrar değişiklikleri önemini incelemek için kullanılmıştır. Benzer bir yaklaşım da farklı kas fenotip10evlat edinmek gibi farklılaştırılmış C2C12 hücreleri karşı Proliferasyona transkript çürüme oranı farklılıkları incelemek için kullanılmıştır. Başka bir örnek olarak, küresel mRNA yarı-hayat da pluripotent tespit edildi ve11farklı fare embriyonik kök hücreleri. Bu örneklerde, mRNA decay transkript bereket düzenleyen ve farklı hücre Birleşik hücrelere geçiş için önemli olduğu gösterilmiştir.

Aşağıda açıklanan yöntemleri uygulayarak, biz fibroblastlar Proliferasyona ve durgun Birleşik12karşılaştırırken transkript çürüme oranları yaklaşık 500 genlerdeki değişikliklerin keşfetti. Özellikle, keşfettiğimiz hücreler sendika için geçiş ne zaman downregulated deneniyor hücrelerdeki olduğunu, mikroRNA miR-29hedeflerini stabilize. Biz burada Proliferasyona ve durgun hücrelerdeki çürüme oranları belirlemek için kullanılan yöntemleri açıklar. Bu yöntemi hızla çürüyen genler hakkında bilgi aranan zaman küresel mRNA decay oranları iki ayrı benzer koşullar içinde karşılaştırmak için yararlıdır. İki boyutlu üç boyutlu kültürler içinde hücre kültür koşulların transkript çürüme, örneğin, üzerinde etkisi gibi diğer soruları gidermek de kullanılabilir. Çürüme oranları microarrays veya RNA-Seq. alternatif olarak, gerçek zamanlı qPCR gibi yöntemler ile kararlı genom çapında olabilir veya Kuzey kurutma çürüme oranları gen gen veya izoformu izoformu olarak belirlemek için kullanılabilir. Bu oranları daha sonra izlenen her gen half-life hesaplamak ve iki koşullarında farklı çürüme oranları ile genlerin tanımlamak için kullanılabilir.

Protokol

Tüm deneyler açıklanan Princeton Üniversitesi ve University of California, Los Angeles, kurumsal inceleme kurulları tarafından kabul edildi.

1. ActD zamanlı Kurs için Proliferasyona ve iletişim inhibe fibroblastlar hazırlayın

Not: Bu protokol ile dört timepoints bir timecourse kullanır. Bir deney farklı doku kültürü levha toplayarak timepoint üç biyolojik olarak bağımsız örnekleri toplanabilir veya deneme birden çok kez farklı hücre kültürleri ile tekrar edilebilir. Deneyim, bir 10 cm (çap) doku kültürü çanak (bir tabak) analiz için yeterli RNA sağlar. Gerekirse, birden fazla doku kültürü yemekleri her timepoint, hücre sayısını artırmak her örnek için havuza. Buna ek olarak, aynı deneyi gerçekten bağımsız biyolojik çoğaltır gibi farklı bireyler izole fibroblastlar ile gerçekleştirilebilir.

  1. Transkript çürüme analiz için hücreleri Proliferasyona ve durgun kültürleri kurmak. İletişim inhibe hücreleri temas inhibe gelmektedir iken Proliferasyona hücreler için üç günde hücreleri bölün.
    1. İlgili kişi inhibe hücreler için orta 2 günde 7 gün için değiştirin. 2 gün önce iletişim inhibe fibroblastlar koleksiyonu için hazır Proliferasyona hücreleri bölün. Bir hücre kültür düzeni örneği şekil 1' de gösterilen. Bu bölümdeki kalan adımları oluşturma ve hücreleri bölme için detaylı bir protokol sağlar.
  2. Birincil dermal fibroblastlar göre kurulan iletişim kuralları13yenidoğan cilt üzerinden ayırma. Geçit fibroblastlar içerebilen bir homojen nüfus sağlamak için.
    Not: Fibroblastlar dondurulmuş ve çözülmüş, gerekirse.
  3. Çözülme veya fibroblastlar, gerekirse replate. Doku kültürü kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2steril koşullarda % 10 serum ile DMEM içinde fibroblastlar büyümek. 10'dan az pasajlar için yetiştirilen olmuştur fibroblastlar kullanın. Fibroblastlar-meli var olmak < % 80 birleşmesi Proliferasyona ve durgun nüfus yapmak için hücreleri bölme gün.
  4. Bir doku kültürü tabak birden çok kalıplara bölmek için PBS, tripsin ve serum 20 dk 37 ° C su banyosunda ile orta prewarm.
  5. Aspire edin veya bir damlalıklı her doku kültürü plaka kaplanarak hücrelerle orta kaldırmak için kullanın.
  6. Üzerine her plaka (150 mm plaka, 5 mL 100 mm plaka için çözüm de, bir de 6 iyi plaka için 2 mL için çözüm 10 mL) ve bir de 12 iyi plaka için 1 mL damlalıklı sıcak PBS.
  7. Aspire edin veya damlalıklı PBS her doku kültürü plaka kaldırmak için.
  8. Yavaşça damlalıklı 1 x tripsin-EDTA her plaka (8 mL 150 mm tabağı, 3 mL 100 mm plaka, bir de 6 iyi plaka için 2 mL ve 1 mL 12 iyi plaka bir kuyu için çözüm çözeltisi) üzerine.
    : Not 1 x steril 10 sulandrarak tarafından tripsin-EDTA tripsin-EDTA steril PBS içinde x. Son 1 x çözüm % 0.05 tripsin ve %0.02 EDTA olmalıdır.
  9. Tripsin 5 min için hücreler kuluçkaya.
  10. Plaka hücrelerden çıkarmak için plaka hafifçe dokunun.
  11. Damlalıklı hücreleri tek hücre süspansiyon resuspend.
  12. Tripsin çözüm hücrelerde DMEM aynı hacmi % 10 serum (8 mL 150 mm tabağı, 3 mL 100 mm tabağı, 2 mL 6 iyi plaka bir kuyu için çözüm çözeltisi ile içeren bir konik tüp transfer ve bir de bir 12 için 1 mL de plakası).
  13. Spin aşağı hücreleri 4 ° C'de 5 dakika tripsin kaldırmak için 1000 x g de.
  14. Uygun hacmi orta ve sayısı hücrelerde hücre konsantrasyonu belirlemek için hemacytometer ile resuspend.
  15. 5 x 10 Proliferasyona için 100 mm doku kültürü plaka başına5 hücre ve hücre iletişim inhibe tohum.
  16. Bu yöntemi kullanarak, analiz (şekil 1) için gerekli Proliferasyona ve iletişim inhibe örnekleri kurmak.

2. ActD zamanlı Kurs

  1. ActD hisse senedi konsantrasyonu 1 mg/mL (ActD, steril PBS kullanım 950 µL ve steril DMSO 50 µL için 1 mg) resuspend.
    Not: ActD donmuş hisse senedi çözümleri-20 ° C'de bir aydır kararlı olmalıdır Seyreltik çözüm atılır ve daha fazla kullanmak için saklanan değil.
  2. ActD prewarmed orta uygun birime Ekle tüm biyolojik Çoğalt hücre kültürü bu Tabaklar için 0, 120, 240 ve 480 dk timepoints (Şekil 2) için ayarlanmış. ActD orta mL başına 15 µg bir konsantrasyon ekleyin. İyice karıştırın, eski orta Aspire edin ve orta ActD içeren hücrelere ekleme.
    1. 1 mg/mL stok için 15 µL eklemek ActD için Beher ml'de orta, örneğin, orta 100 mm tabağı, 10 mL için eklemek 150 µL ActD.
  3. Sıfır timepoint örnek toplamak, yavaşça ActD orta ve damlalıklı kapalı Aspire için PBS hücreleri prewarmed. Damlalıklı çözüm 150 mm tabağı, çözüm için 100 mm plaka, bir de 6 iyi plaka için 2 mL ve bir de 12 iyi plaka için 1 mL 5 mL 10 mL.
  4. Yavaşça Aspire edin veya damlalıklı PBS kapalı.
    Not: Tüm adımları RNA izolasyon içeren RNase ücretsiz su, RNase free microcentrifuge tüpler ve RNase free Pipetler ile yapılmalıdır. Eldiven giyilir ve RNA ile çalışırken sık sık değişti.
  5. Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm (4 x 105 4 x 107 hücrelere 1 mL/10-cm tabak) doku kültürü plakasına ekleyin.
    Not: Hücreleri lysing ve RNA, DNA ve protein birbirinden ayıran ise RNA kalitesini korur bir monophasic çözüm fenol-guanidin isothiocyanate çözümdür.
    Dikkat: Fenol ve guanidin isothiocyanate aşındırıcı. Uygun koruma kullanın.
  6. Damlalıklı fenol guanidin isothiocyanate çözüm hücreli karışımı homojen bir karışım yapmak birkaç kez yukarı ve aşağı.
    Not: Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm lysate gecede 4 ° C'de veya -20 ° C'de için bir yıl kadar saklanabilir.
  7. Adımları 2.3-2,6 açıklanan yöntemi kullanarak uygun süreyi geçtikten sonra her zaman noktası toplamak.

3. Lysate fenol-guanidin Isothiocyanate çözümden toplam RNA izolasyonu

  1. Örnekleri, oda sıcaklığında RNA-protein kompleksleri tam çözünme sağlamak 5 min için kuluçkaya.
    Not: Adım fenol-guanidin isothiocyanate çözüm protokolünün oda sıcaklığında aksi belirtilmedikçe gerçekleştirilebilir.
  2. Kullanılan metodoloji ile tespit edilebilir spike kontrol transkript tanıtmak.
Bu denetimleri içine her örnek, bir bilinen miktar ve konsantrasyon tanıtmak.
Not: Harici RNA denetim Konsorsiyumu (ERCC) spike kontrol mix '14 özellikle spike denetimdir RNA-devamı için tasarlanmıştır Ayrıca Kuzey lekesi veya gerçek zamanlı qPCR için kullanılabilir. Mikroarray teknolojileri için özel olarak tasarlanmış spike içinde de kullanılabilir (bakınız Tablo reçetesi) denetimleridir.
  • Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm karışımı bir pipet ile 2.0 mL microcentrifuge tüp aktarın. Fenol-guanidin isothiocyanate çözüm karışımı için her 1 mL kullanılan fenol-guanidin isothiocyanate çözeltisi 0.2 mL kloroform ekleyin (örneğin, 0.3 mL kloroform 1,5 mL fenol-guanidin isothiocyanate çözüm karışıma ekleyin).
  • Microcentrifuge tüp 15 için şiddetle sallamayın s ve kloroform-fenol-guanidin isothiocyanate karışımı 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  • 4 ° C'de 20 dakikadır örnekleri 12.000 x g de spin
    Not: ilk tur sonra örnek 3 katmanlara - kırmızı organik katman alt, beyaz/pembe Interphase orta ve üst (şekil 3) açık sulu bir katmanda ayrı olmalıdır.
  • Sulu katman bir micropipette kullanarak bir yeni 2.0 mL microcentrifuge tüp için transfer.
    Not: Bu işlem sırasında Interphase rahatsız etmek dikkat et. Bazı sulu kesir bırakmak iyidir. Ayrıca bazı Interphase dahil olarak interfaz katmanların dahil etmek için katman RNA DNA ile kontamine daha sulu kesir kısmını terk etmek iyidir. Eğer fenol-guanidin isothiocyanate çözüm/kloroform karışımı 1,8 mL sulu katman ilk birimin, yani yaklaşık 0.9 mL yaklaşık olacak.
  • Interphase ve organik kesirler atmak.
  • 2-propanol eşit bir hacmi sulu kesir ekleyin ve tüp 10 kez tersine çevirin. Özellikle verim 10'dan az6 hücre toplanan çünkü düşük olması bekleniyor, en çok 1 µL glikojen örneği, 20 µL başına 20 mg/mL sulu çözüm ekleyin.
    Not: Bu sonraki spin adımlar sonra izlemek kolay bir yoğun, katı Pelet sonuçlanır.
  • Örnekleri, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  • 4 ° C'de 20 dakikadır örnekleri 12.000 x g de spin Emin, bu tur sonunda, RNA tüpün dibinde beyaz bir Pelet kurmaya çöktürülmüş.
  • Bir pipet ile kaldırmak ve beyaz RNA Pelet bozmamaya özen alarak süpernatant atın.
    Not: el düzenlenen gevşek damlalıklı bahşiş aşırı etanol kaldırmak için kullanılabilir. RNA Pelet rahatsız ama değil atılır, araştırmacı spin tekrar ve tekrar süpernatant kaldırın. Bu tüm yordamı yineleyin için Dedektif gerektirir gibi Pelet atma önlemek.
  • % 75 etanol ve % 25 nükleaz ücretsiz su çözeltisi hazırlamak. 1 mL % 75 etanol fenol-guanidin isothiocyanate çözüm reaktif Pelet yıkamak için 1 mL başına ekleyin.
  • Örnekleri 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin
  • Süpernatant çoğunu kaldırdıktan sonra bir damlalıklı hala Pelet rahatsız etmek Bakımı sırasında mümkün olduğu kadar etanol kaldırmak için kullanın.
    Not: RNA Pelet Bu adımda daha az kompakt ve hareket eğilimi. Bu noktada RNA kaybetmemek için Pelet ele alırken çok dikkat.
  • Örnekleri 12.000 x g tüm aşırı etanol cips için oda sıcaklığında 2 min için spin.
  • Tüm aşırı etanol Pelet bozmamaya dikkat çekici bir micropipette kullanarak tüm tüpünden kaldırın.
  • 5 min için Kuru RNA Pelet hava girsin.
  • RNA Pelet 50 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin ve Pelet nükleaz ücretsiz su resuspend.
  • 1 µL örnekleriyle tedavi Dnaz (2 adet/DNA kaldırıp Dnaz ve katyonlar (bkz. Tablo reçetesi) devre dışı bırakabilirsiniz için µL).
  • RNA örnekleri 2.0 mL microcentrifuge tüpler-80 ° C'de depolayın

    • 4. analiz transkript bereket

    1. RNA ölçmek ve RNA bir Spektrofotometre kullanarak saflık için atın.
      Not: 260 Absorbans oranı nm için 280 nm yaklaşık 2.0 RNA için olmalıdır.
    2. RNA % 1'özel jel veya bozulma ölçüde görselleştirmek için eşdeğer bir teknoloji ile analiz.
      Not: İki 18S temsil eden bantları temizleyin ve 28S rRNA açıkça görülebilir (şekil 4) olmalıdır. Bu grup görünür değilse, RNA bozulmuş. Sorun çekim ipuçları RNA bozulması için tartışmaya sağlanır.
    3. Monitör transkript bolluk içinde RNA'ın toplanan aliquots kullanarak microarrays15, RNA-Seq16, gerçek zamanlı qPCR17çivili içinde iç standart ile karşılaştırıldığında veya Kuzey18engelliyor.
      1. Bereket her transkript bir çivili denetimi bilinen bereket ile karşılaştırıldığında her zaman noktasında için belirleyin.
        Not: microarrays için Floresans yoğunluklarda değerleri olacaktır. Kuzey lekesi için röntgen film bands sayısal. Gerçek zamanlı qPCR için transkript bereket 2- σσCT yöntemi19ile bilinen standartları yasland belirlenebilir. RNA-Seq için normalleştirilmiş değerleri FPKM veya eşlenen milyon okuma başına exon kilobaz başına parça olarak belirlenebilir. İzoformu özgü çürüme oranları için RNA-Seq veri DEXSeq20gibi izoformu farkında yöntemlerini kullanarak analiz edilebilir. İzoformu özgü çürüme oranları en iyi RNA-devamı ile belirlenir Eğer onlar Mikroarray verilerle tespit edilecek, sonra verileri bir gen gen olarak yerine bir prob prob olarak çözümlenmesi gerekir. Çözümleyici bilgi sınırlı sayıda probları, üzerinden yorumlarken dikkatli olmanız gerekir. Örneğin, belirli bir izoformu hakkında bilgilendirici 5 veya daha az probları olabilir. Bu durumda, analist sonuçların güvenilir olması bu sondalar davranışını yeterince tutarlı olup olmadığını belirlemek gerekir.
    4. C-Myc ve yavaş yavaş çürüyen bir gen GAPDH o transkript çürüme oranları doğru bir şekilde tespit edildi güven kazanmak için gibi gibi hızla çürüyen genler analiz etmek için toplanan örneklerinde izole RNA17 üzerinde gerçek zamanlı qPCR gerçekleştirin.
      Not: daha fazla onay için izoformu özel gerçek zamanlı qPCR sondalar olabilir geliştirilen ve belirli izoformlarının bolluk saat21izlemek için kullanılır.

    5.Çürüme oranı sabit belirlenmesi

    1. Her timepoint için günlüğü-her transkript (gene özgü veya izoformu özgü) için bolluk değerleri dönüştürme.
      Not: Günlük-dönüşüm değerleri üstel çürüme eğrileri ile doğrusal çürüme model22uygun satırları dönüştürecektir.
    2. Bir doğrusal çürüme modeli her transkript (gene özgü veya izoformu özgü) ifade profile uyuyor. Böyle bir model için f(t) formülüdür = C - r * t. Bu denklemdeki C bir transkript başlangıç miktarını temsil eden bir sabittir, r hızı ise t zaman deneme başından beri. Bu denklemden çürüme oranı r*ln(10) olarak belirlemek (başvuru11bakınız).
      Not: MaSigPro regresyon dayalı yaklaşım önemli gen ifade profil saat ders veri23farklılıkları algılamak için tasarlanmış bir yazılım paketidir. Örnek kod ve maSigPro için sonuçlar elde edilebilir vasıl: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
    3. Log-doğrusal çürüme modeli sığacak şekilde başarısız genlerin filtre. Bu ANOVA F-test ile gerçekleştirilebilir.
      Not: F sınaması varyasyon tanımlanan F-istatistik dayalı örnekleri içinde değişim bölü örnek ortalamaları arasındaki. Doğrusal step-up Benjamini ve Hochberg yanlış bulma yordamı24uygulayarak birden fazla karşılaştırmalar için p değerleri düzeltin. Q 0,05 F-sınaması ile daha büyük değer için log-doğrusal çürüme modeli sığacak şekilde başarısız gen bir kesim kullanılabilir.
    4. Tutanaklar bir kategorik hücre döngüsü koşul ve saat arasında önemli bir etkileşimde terimi ile belirlemek için bir ANOVA F sınaması gerçekleştirmek (yanlış bulma oranı, FDR < 0,05).

    Sonuçlar

    Transkript çürüme oranları Proliferasyona ve iletişim inhibe birincil insan fibroblast Mikroarray analizleri sonuçlarını daha önce üzerinde bir 8 saatlik ders12bildirdin. Genler ile Proliferasyona ve iletişim inhibe fibroblastlar karşılaştırma transkript istikrar önemli bir değişiklik listesi ek tablo 1' de sağlanır. Floresans yoğunluklarda zaman sıfır ve ActD tedavisinden sonra bir saat ders üzerinde sağlanır. Genler list...

    Tartışmalar

    Sendika mitogens veya serum geri çekilmesi, hücre adezyon ve iletişim inhibisyon eksikliği de dahil olmak üzere dış sinyalleri tarafından indüklenen. Temas inhibisyonu, sendika, inducing için birden fazla olası yönteminden birini hücreleri hücre hücre kişiye yanıt proliferatif Hücre döngüsünde çıkmak çok örümceklerle korunmuş bir süreçtir. Temas inhibisyonu sendika ikna etmek için bir yöntem örneği olarak üzerinde odaklanabilir. Önceki çalışmalarda hücre-hücre iletişim mikroRNA Bi...

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

    Teşekkürler

    HAC Milton E. Cassel bilgin Rita Allen Vakfı (http://www.ritaallenfoundation.org) yapıldı. Bu eser mükemmellik hibe P50 GM071508 Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri Merkezi'nden HAC (Özel Dedektif David Botstein), ilaç Vakfı Hibe 2007RSGl9572, Ulusal Bilim Vakfı Hibe OCI-1047879 David Ağustos hibe tarafından finanse edildi, Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri R01 GM081686, Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri R01 GM0866465, Eli & Edythe geniş merkezi rejeneratif tıp & kök hücre araştırmaları, Iris Cantor kadın Sağlık Merkezi/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124 ve lösemi Lenfoma Derneği. Bu yayında bildirilen Araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P50CA092131 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. HAC Eli bir üyesidir & Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi & kök hücre araştırmaları, UCLA moleküler biyoloji Enstitüsü ve UCLA Biyoinformatik bölümler arası programı.

    Malzemeler

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C
    Equipment for running agarose gels
    Sterile tissue culture plates and conical tubes
    Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-118
    Fetal bovine serumVWR35-010-CV
    Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture
    Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis
    Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples
    RNaseZapInvitrogenAM9780For decontaminating work surfaces from RNase
    2.0 ml eppendorf tubes
    Trypsin-EDTA  Solution 10XMillipore Sigma9002-07-07
    Sterile PBSLife Technologies14190-250
    TrizolThermo Fisher Scientific15596018
    Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mginhibits transcription
    Sterile DMSOFisher Scientific31-761-00MLsolvent for actinomycin D
    ChloroformThermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc product
    IsopropanolFisher ScientificBP2618500molecular biology grade
    EthanolFisher ScientificBP28184molecular biology grade
    RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)Thermo Fisher ScientificR0551carrier for RNA precipitation
    TURBO DNA-free KitThermo Fisher ScientificAM1907removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,  inactivates DNA and removes divalent cations
    AgaroseThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc product
    Loading dye for RNA gelThermo Fisher ScientificR0641suitable even for denaturing electrophoresis
    Millenium RNA markersThermo Fisher ScientificAM7150RNA ladder
    One-color RNA Spike-in KitAgilent Technology5188-5282Example spike-in control for Agient microarray analysis
    Tris baseFisher ScientificBP152-1molecular biology grade, for TAE buffer
    Glacial acetic acidFisher ScientificA38-500for TAE buffer
    EDTAFisher ScientificBP120-500electrophoresis grade, for gels
    Ethidium bromideMillipore SigmaE7637for molecular biology
    External RNA Controls Consortium RNA Spike-in MixThermo Fisher Scientific4456740Spike-in control for RNA Seq
    TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)IlluminaRS-122-2101for RNA Seq
    96-well 0.3 ml PCR plateThermo Fisher ScientificAB-0600for real-time qPCR
    Microseal B adhesive sealsBio-RadMSB1001for real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free Reagent ReservoirsVWR89094-662for real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free Eight tube strips and capsThermo Fisher ScientificAM12230for real-time qPCR
    SuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010for real-time qPCR
    AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880for real-time qPCR

    Referanslar

    1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
    2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
    3. Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
    4. Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
    5. Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
    6. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
    7. Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
    8. Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
    9. Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
    10. Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
    11. Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
    12. Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
    13. Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
    14. Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
    15. Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
    16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
    17. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
    18. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
    19. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
    20. Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
    21. Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
    22. Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
    23. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
    24. Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
    25. Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
    26. Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
    27. Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
    28. Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
    29. Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
    30. Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
    31. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
    32. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
    33. Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
    34. Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).

    Yeniden Basımlar ve İzinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

    Izin talebi

    Daha Fazla Makale Keşfet

    Genetiksay 131transkript r mesendikafibroblastlartemas inhibisyonuhalf lifeactinomycin DmiR 29

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Bize Ulaşın

    KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

    JoVE HABER BÜLTENLERİ

    Araştırma

    Eğitim

    Yazarlar

    Kütüphaneciler

    JoVE Hakkında

    Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır