Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo

Resumen

Análisis cuantitativo de contenido de la celda dentro del nervio ciático murino es difícil debido a la escasez del tejido. Este protocolo describe un método para la digestión del tejido y la preparación que proporciona suficientes células para el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células inmunitarias de los nervios de los ratones.

Resumen

Residente del nervio las células inmunes en el sistema nervioso periférico (PNS) son esenciales para mantener la integridad neuronal en un nervio sano. Las células inmunes de la PNS son afectadas por lesiones y enfermedad, que afecta a la función del nervio y la capacidad de regeneración. Las células inmunes neuronales comúnmente son analizadas por inmunofluorescencia (IF). Mientras que si es esencial para determinar la ubicación de las células inmunes en el nervio, si es solamente semicuantitativa y el método se limita al número de marcadores que se pueden analizar simultáneamente y el grado de expresión superficial. En este estudio, citometría de flujo se utilizó para el análisis cuantitativo de la infiltración de leucocitos en los nervios ciáticos o ganglios de raíz dorsal (GRD) de los ratones. Realizó el análisis unicelular con DAPI y varias proteínas se analizaron simultáneamente para la expresión superficie o intracelular. Ambos nervios ciático de un ratón que fueron tratados de acuerdo con este protocolo genera 30.000 eventos nucleados simples ≥. La proporción de leucocitos en los nervios ciáticos, determinados por la expresión de CD45, fue aproximadamente 5% del contenido total de células en el nervio ciático y aproximadamente 5-10% en el DRG. Aunque este protocolo se centra principalmente en la población de células inmunitarias en el PNS, la flexibilidad de la citometría de flujo para medir un número de marcadores simultáneamente significa que las otras poblaciones de células presentes dentro del nervio, tales como las células de Schwann, pericitos , fibroblastos y células endoteliales, pueden también ser analizadas utilizando este método. Por lo tanto, este método proporciona nuevos medios para el estudio de efectos sistémicos en el PNS, como neurotoxicología y modelos genéticos de la neuropatía o enfermedades crónicas como la diabetes.

Introducción

Las células inmunes que entran en el PNS de la circulación, según lo definido por la expresión de CD45 y CD11b, ayudan a mantener la integridad del nervio y desempeñar un papel tanto en regeneración y degeneración¹. Macrófagos (definidos por la expresión de CD68 en ratón) pueden ser sesgados hacia un fenotipo inflamatorio, expresando más MHC de clase II y CD86 en la superficie (M1), o hacia un fenotipo antiinflamatorio, expresando más CD206 intracelular (M2)² . Sesgo del fenotipo macrófago es un proceso dinámico que regula a través de Akt señalización³, reflejando las diferentes tareas de macrófagos en la defensa contra patógenos (M1) y el papel en la regeneración de los tejidos (M2). Regeneración de un nervio lesionado primero requiere la fagocitosis de la ruina del myelin por macrófagos en el nervio^4,5y antiinflamatorios (CD68⁺CD206⁺) M2 macrófagos se han demostrado para promover la extensión del axón en el PNS⁶. Reduce reclutamiento o macrófagos en el PNS, o deteriorada capacidad de fagocitosis puede resultar en deterioro de la regeneración y mantenimiento de la integridad del nervio. Inflamatorios macrófagos M1, expresan MHC de clase II, son menos capaces de la fagocitosis de macrófagos M2, y la inflamación neuronal está implicada en la patogenia de varias enfermedades de neurodegenerative⁷.

Los cambios que ocurren al nervio residente sistema inmune como consecuencia del daño pueden ser cuantitativos, que se manifiesta en la pérdida de CD45⁺ leucocitos (o aumento de la infiltración de CD45⁺ leucocitos en la inflamación de casos), o cualitativos, tales como cambio de fenotipo de macrófago de M2 a M1 fenotipo. Las células inmunes de la PNS tradicionalmente se han analizado mediante si, utilizando las secciones congeladas o material parafina-encajado⁸. IF es necesario para determinar la localización de las células de interés. Sin embargo, cuantificación usando si a menudo se basa en el recuento de un número relativamente pequeño de células en una sección estrecha del tejido, hacer cuantificación fiable y vulnerable a sesgo de selección. Para la identificación de subconjuntos específicos de las células inmunes, la detección simultánea de marcadores intracelulares o extracelulares se requiere, mientras que la determinación del fenotipo macrófago requiere al menos al menos dos marcadores, específicamente CD206 y MHC clase II. Más comúnmente microscopios disponibles son limitados a los canales de al menos dos colores, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE), la caracterización de los subconjuntos específicos de células inmunes por IF puede ser restrictivo e incompleto, que requiere la necesidad de tener varias diapositivas, derivado de la misma área de interés, que son manchados y analizados en paralelo. Este aspecto requiere mucho tiempo, por lo tanto no necesario se presta para el análisis de conjuntos de muestras grandes. Además, como la mayoría de los marcadores de interés son extracelular, la detección de tejido, que tampoco ha sido incrustado en parafina o cryoconserved, puede ser problemática debido a la interrupción de la integridad de la membrana y el enmascaramiento de los epitopos, así como la pérdida de los antígenos de interés por el uso de solventes como acetona y metanol⁹.

En cambio, flujo cytometry, que mide óptica y características de fluorescencia de células en suspensión su paso a través de un haz de luz, proporciona un medio más práctico y completo para el análisis de las poblaciones celulares. Citometría de flujo, en lugar de producir una imagen digital del tejido, proporciona una cuantificación automatizada de parámetros establecidos, que incluyen el tamaño relativo de la célula y el índice reflexivo, conocido como la dispersión hacia delante (FSC), complejidad interna granularidad o lado-scatter (SSC) y la intensidad de fluorescencia relativa, proporcionando que la célula ha sido marcada con un fluoróforo adecuado, como un anticuerpo conjugado. Un citómetro de flujo típica consta de dos láseres refrigerados por aire; un láser de argón produce luz azul a 488 nm y un láser de helio-neón produce luz a 633 nm. Esta combinación permite la detección y la medida, al mismo tiempo, de al menos cinco objetivos en la superficie o dentro del compartimiento intracelular. Citómetros de flujo más avanzado pueden consistir en múltiples láseres, que permiten la detección de hasta ocho diferentes fluorocromos a la vez, proporcionar que las longitudes de onda de emisión de pico de los fluorocromos seleccionados no se superponen significativamente.

Para el análisis por citometría de flujo, el tejido de interés debe primero ser enzimático digerido, generalmente con colagenasa, para generar una suspensión unicelular. El análisis de los nervios ciáticos murinos anteriormente ha sido difícil debido a la pequeña cantidad de tejido Obtenido de cada ratón. Además, el alto contenido de grasa de la mielina alrededor de los axones dificulta la recuperación de la célula y produce grandes cantidades de desechos. El método descrito en este documento para la digestión y preparación del nervio ciático fue adaptado por el protocolo de aislamiento de las células de Schwann de Barrette et al. ⁷y tiene como objetivo aislar suficientes células de los nervios de los ratones para el análisis de citometría de flujo, con el fin de reducir la variación entre ratones. Usando DAPI para la identificación de las células en la síntesis de tejido crudo evita la necesidad de eliminar los desechos del axón, que comúnmente conduce a la pérdida de la célula. Lavar varias veces con un SIDA almacenador intermediario rico en detergente en la liberación de células atrapados dentro de los restos de grasa, aumentando así el rendimiento. Digestión de ambos nervios ciático cuerpo entero de un solo ratón según este protocolo genera ≥30, 000 eventos nucleados simples y por lo menos 3 veces ese número fue obtenido del DRG. La proporción de CD45⁺ leucocitos fue de aproximadamente el 5% del contenido total de la célula en la recopilación del nervio ciático y aproximadamente 5-10% en la recopilación de la DRG. La mayoría de la CD45⁺ las células en el nervio ciático expresaron los marcadores de macrófagos CD68 y CD206.

Protocolo

Ratones C57BL/6 de tipo salvaje (varones; 10-12 semanas) fueron mantenidos en ciclo de luz/oscuridad de 12 h estándar y se proporcionaron acceso gratuito a dieta chow estándar y agua. Todos los experimentos con animales se llevó a cabo de acuerdo a las pautas pertinentes el local de cuidado Animal y uso Comité y aprobados por el cuidado de animales locales y uso a la autoridad regional en Karlsruhe, Alemania (G216/10).

1. perfusión del ratón

1. Sacrificio el ratón (C57BL/6; Machos; 10-12semanas) con CO₂ o de acuerdo con las regulaciones locales.
   Nota: Sangrado retro-orbital puede realizarse para obtener control de leucocitos, utilizando tubos de 1,5 mL de EDTA-revestida. Este método de sangrado sólo es eficaz inmediatamente después del sacrificio. Lavado de cavidad peritoneal, posterior (LCP) puede realizarse para obtener control de macrófagos, con PBS precalentada a 37 ° C para evitar el frío aglutinación de la sangre, que puede dificultar la perfusión.
2. Desinfectar el ratón rociando la piel en el abdomen liberalmente con etanol al 70% v/v y repetidamente limpiándola con un pañuelo con una gasa de algodón. Usando las tijeras embotadas, corte la piel del abdomen por una incisión longitudinal.
3. Exponer la cavidad pleural, primero haciendo una incisión en el diafragma usando tijeras curvas, romos y luego extender la incisión a lo largo de toda la longitud de la caja torácica. Hacer un corte similar en el lado contralateral hasta el esternón puede ser cuidadosamente levantado lejos.
4. Con una visión clara del corazón y los vasos principales, inserte una mariposa 23¾ medidor de aguja, conectada a una jeringa de 50 mL llena con PBS helado, en la cámara izquierda del corazón.
5. Hacer una incisión en la aurícula derecha del corazón con unas tijeras de iris para crear tan grande de una toma de corriente como sea posible sin dañar la aorta descendente y entonces presione suavemente la jeringa para empujar a través de aproximadamente 30 mL de PBS. El exudado debe funcionar claro. La limpieza del hígado o los riñones puede utilizarse como un indicador de una buena perfusión.

2. disección del nervio ciático y GRD

Nota: Para la disección de los nervios ciático, la piel anterior es el gluteus maximus es eliminado y el ratón coloca lado ventral hacia abajo mientras que se extiende las extremidades inferiores.

1. Bilateral disecar los nervios ciáticos todo separando el tejido muscular del muslo dorsal superior y seguimiento del nervio a lo largo de la columna vertebral. Cortar el nervio donde sale de la columna vertebral e inmediatamente arriba de la rodilla en el otro extremo.
   Nota: Evitar manipulación excesiva del nervio como aplastamiento o tracción con el fórceps.
2. Con unas pinzas, transfiera los nervios suprimido, aproximadamente 2 cm por nervio, para un tubo de 1,5 mL que contiene 1 mL de PBS helado y tienda en el hielo.
   Nota: El nervio puede guardarse una noche en el hielo.
   Nota: Para la disección de la DRG, usando pinzas y un bisturí, separar la piel del tejido blando subyacente desprendiendo suavemente la piel posterior al exponer las regiones cervicales, torácicas y lumbares espinales. Retire el cabezal de corte en la base del cráneo con un blunt tijeras.
3. Corte las costillas paralelas con y cerca de la columna vertebral a ambos lados, antes de extraer las vísceras a la parte anterior de la columna vertebral. Corte los fémures y quite la columna vertebral por un corte en el nivel de los fémures transversal. Usando las tijeras de iris, corte cualquier músculo, grasa y otros tejidos blandos de la columna vertebral.
4. La columna vertebral con el lado dorsal hacia arriba y abrirlo, comenzando en el extremo caudal, deslizando una punta de las tijeras en el canal vertebral en la posición 3:00 y el hueso cortado. Repita el procedimiento en la posición 9:00.
   Nota: Es importante cortar exactamente en el centro para evitar dañar el DRG.
5. Repetir el corte de un lado a otro hasta que se alcanza el extremo rostral y la médula espinal está expuesta completamente. Usando un microscopio de disección, quitar la médula espinal para exponer los nervios espinales, que pueden utilizarse para localizar el GRD dentro de la columna vertebral.
6. Retire el DRGs lumbares tirando suavemente de la raíz dorsal para tirar el DRG en los canales vertebrales, luego recorte los nervios y tejido conectivo con tijeras de iris para quitar la GRD.
   Nota: Es posible restringir la colección a la DRG L4-L6, que están contribuyendo en el nervio ciático.
7. Con fórceps, transferir los DRGs a un tubo de 1,5 mL que contenga aproximadamente 1 mL de PBS helado y almacenar en hielo.
   Nota: El nervio puede guardarse una noche en el hielo.

3. digestión de nervio ciático y GRD

1. Preparar los medios de digestión (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, colagenasa tipo 4 de 1,6 mg/mL) con 100 μg/mL de desoxirribonucleasa y tienda en el hielo.
   Nota: La cantidad de medio de digestión requerida por ratón (nervios ciático + DRGs) es de 1 mL. Una vez preparado, alícuotas de los medios de digestión pueden ser almacenados a-20 ° C.
2. Transferencia de los nervios ciáticos y GRD de un ratón en tubos separados 1,5 mL conteniendo 500 μl de medio de digestión. Para los nervios ciáticos, cortar el material en 15-20 pedazos con unas tijeras de muelle y luego incubar las suspensiones de tejido en un incubador de agitación a 37 ° C por 20 min con agitación suave (≤ 450 rpm).
3. Triturate repetidamente la suspensión de células a través de la pipeta de 1.000 μl a disociar mecánicamente los tejidos incompletamente digeridos.
   Nota: Si la suspensión es difícil de valorar, luego corte la punta con tijeras para crear un extremo romo. Incubar la suspensión de tejido a 37 ° C por 20 min con agitación suave (≤ 450 rpm).
4. Repita la trituración por medio de una pipeta de 1.000 μl e incubar un más 10 min a 37 ° C con agitación suave (≤ 450 rpm).
5. Preparar el tampón FACS (PBS suplementado con 10% FCS y 1 mM EDTA) y almacenar en hielo. Enjuagar y remojar una pantalla de acero inoxidable con una malla de 140 μm con tampón FACS de 60 x 15 mm placa de Petri en el hielo.
   Nota: Los filtros de pantalla de Nylon deben evitarse ya que conduce a una pérdida significativa en el rendimiento de las células nucleadas.
6. Varias veces pasar las suspensiones de tejidos a través del filtro de pantalla 140 μm, se celebra en la caja Petri, con pinzas embotadas, en hielo. Recoger la suspensión de células de la placa de Petri y transferirlo a un tubo de 1,5 mL nuevo almacenado en hielo.
7. Presione cualquier tejido digerida que permanece en el filtro a través de trituración repetida con una pipeta de 1000 μl. Enjuague el filtro de la pantalla dos veces con 500 μl de tampón FACS y recoger la suspensión de células que resulta en la caja Petri para combinar con la suspensión de células de paso 3.6.
   Nota: Si el citómetro de flujo utilizado es sensible a la suciedad, la suspensión de células de paso 3.7 puede pasar a través de un filtro de pantalla 70 μm; sin embargo, esto puede conducir a una pérdida en el rendimiento de las células nucleadas.
8. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón FACS. Repita este paso de lavado una vez.
9. Resuspender el precipitado de células en 150-350 μl de tampón FACS, dependiendo del número de manchas que son requeridos (150 μL FACS tampón por panel de tinción).

4. coloración del nervio ciático y GRD con etiquetados fluorescente anticuerpos para citometría de flujo

1. Transfiera 100 μl del nervio ciático o suspensión de la célula DRG en una forma de V en una placa de 96 pozos en el hielo.
   Nota: Células con tinción solo son necesarias para todos los anticuerpos utilizados ya que proporcionan los controles necesarios para que configurar la citometría de flujo con respecto a photomultiplier tubo (PMT) ganancias de tensión y compensación, así como para ayudar a distinguir específicos de fijación no específica. Debido al limitado material directamente en el nervio ciático y GRD, leucocitos de la sangre y los macrófagos de la LCP (pasos 1.1-1.2) se pueden utilizar los controles solo manchado, la mancha de que deberían realizarse en paralelo con la tinción de la ciática nervio y GRD.
2. Piscina las restantes células suspensiones (aproximadamente 50 μL por muestra) de los nervios ciáticos o muestras DRG, para servir como un control sin manchas.
3. Centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante invirtiendo la placa en un recipiente y aplicando un movimiento fuerte de la muñeca y golpee suavemente seco sobre toallas de papel.
4. Para la tinción de la superficie, cada uno de los pellets de células resuspender en 20 μl de tampón FACS que contiene los anticuerpos de interés (A647 CD45 PerCP/CD11b-Cy5.5 y MHC clase II-biotina) e incubar, protegidos de la luz, en el hielo durante 30 minutos.
   Nota: (1) la dilución óptima del anticuerpo debe ser determinado antes de usar mediante la realización de una serie de diluciones de acuerdo con información de producto del fabricante; (2) inespecífica los stainings puede reducirse por la incubación con el bloque de la Fc en este paso, según las instrucciones del fabricante; y (3) isotipo control stainings generalmente no son necesarios al utilizar anticuerpos primarios directamente conjugados con un fluoróforo o cuando los antígenos de interés producen poblaciones distintas.
5. Agregar 130 μl de tampón FACS a cada pocillo y centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante como descrito previamente (paso 4.3) y lavar el pellet celular dos veces con 150 μL de tampón FACS.
   Nota: Si utiliza un anticuerpo primario no conjugado o un anticuerpo primario conjugado con biotina, un reactivo secundario apropiado, conjugado con un fluoróforo, puede añadirse en este punto y se repiten los pasos de 4.4-4.5. En el caso de este protocolo, estreptavidina-PE/Cy7 o estreptavidina-PerCP fue utilizado para detectar MHC clase II en combinación con CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, o en combinación con CD68-APC y F4/80-PE/Cy7, respectivamente.
6. Para la fijación, después el último paso de lavado, Resuspender el pellet celular en 100 μl de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7.4). Incubar la placa de hielo durante 10 minutos y luego centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante como se describió anteriormente (paso 4.3) y lavar el pellet celular una vez con 150 μL de tampón FACS.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada como guantes y gafas, etcetera.
   Nota: Resuspender el pellet celular en 150 μL de tampón FACS y almacén protegido de la luz, a 4° C hasta por dos días. Si no tinción intracelular es necesario, proceda al paso 4.11 después de centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
7. Para la tinción intracelular, Resuspender el pellet celular en 150 μL de detergente buffer+0.5% de FACS e incubar a temperatura ambiente, protegido de la luz 15 minutos centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante como se describió anteriormente (paso 4.3) y lavar el precipitado de células una vez con 150 μL de tampón FACS + 0.5% de detergente. Resuspender el precipitado de células en 20 μl de detergente buffer+0.5% de FACS que contiene los anticuerpos de interés (CD68-APC, PE CD206) e incubar, protegidos de la luz, a temperatura ambiente durante 30 minutos.
8. Agregar 130 μl de detergente buffer+0.5% de FACS a cada pocillo y centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante como descrito previamente (paso 4.3) y los pellets de células dos veces con 150 μL de tampón FACS + 0.5% de detergente de lavado.
   Nota: Si utiliza un anticuerpo primario no conjugado o un anticuerpo primario conjugado con biotina, un reactivo secundario apropiado, conjugado con un fluoróforo, puede añadirse en este momento y repitieron pasos 4.9-4.10.
9. Resuspender el pellet celular en 150 μL de tampón FACS + 0.5% de detergente y tienda, protegido de la luz, a 4 ° C hasta por dos días.
10. Resuspender el pellet celular con 150 μL de tampón FACS + 0.5% de detergente con DAPI de 5 μg/mL e incubar 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante como se describió anteriormente (paso 4.3).
11. Resuspender el pellet celular en 150 μL de PBS y transfiéralo a un tubo de FACs debidamente etiquetado. Almacenar a temperatura ambiente, protegido de la luz, hasta que esté listo para el análisis.
    Nota: Después resuspension en PBS, las células deben analizarse dentro de las horas, ya que el DAPI se disocia lentamente de la DNA, conduciendo a una pérdida de señal.

5. configuración de citometría de flujo y funcionamiento de las muestras

1. Asegúrese de que está equipado el citómetro de flujo con los láseres adecuados o filtro establece para medir los fluoróforos utilizado para teñir las células. Esto puede ser determinado en la configuración predeterminada de citometría en el sistema. En el caso de este protocolo, las células se analizaron con un citómetro de flujo equipado con tres láseres (405 nm, 488 nm y 633 nm) que permite la detección de ≤ 5 fluoróforos.
2. Seleccionar los canales adecuados para la detección de los fluoróforos de interés. Todas las señales fluorescentes se detectan mejor con amplificación logarítmica.
3. Seleccione un caudal apropiado para las muestras. Este parámetro puede variar dependiendo del sistema utilizado y debe determinarse empíricamente. En el caso de este protocolo, un caudal de mediana a alta (35-60 μL/min) fue utilizado para prevenir la obstrucción de la aguja.
4. Seleccione el número total de eventos/células para ser recogidos por muestra. El número mínimo de eventos debe ser 1.000.000.
5. Crear diagramas de dispersión bajo una hoja de cálculo global de la SSC A versus FSC-A, así como para cada fluoróforo de interés versus FCS-A. Crear una vista estadístico que muestra el número de eventos y la intensidad fluorescente media (MFI) de los fluoróforos seleccionadas.
6. Ajustar la tensión de los canales A de FSC y SSC-A, tal que las células más pequeñas encajan en el inferior izquierdo 10% de la trama de la dispersión. Determinar la fluorescencia del fondo y mínimo de la muestra de la fluorescencia de los controles sin manchas de los nervios ciáticos o DRGs. determinar la puerta de los padres (P1) basada en la dispersión parcela de DAPI sólo controles de tinción.
   Nota: Esto no es una puerta de colección, debido en parte a la naturaleza heterogénea de la población de DAPI + en el PNS.
7. Usando la dispersión FSC parcelas para cada uno de los fluoróforos de interés, ajustar las tensiones para que las células del control sin manchas caen en el barrio más bajo de sus parcelas de dispersión correspondiente. Luego se crean puertas por encima de esta región para definir aquellas células que son positivos para cada uno de los respectivos marcadores/fluoróforos. Funcionamiento del control solo manchado (paso 4.1) confirma la colocación de una puerta.
   Nota: Compensación por superposición de espectros de emisión se realiza en este punto o aplicado retrospectivamente con el software de análisis apropiado.
8. Una vez que el citómetro de flujo se ha establecido, como se describe, se pueden ejecutar las muestras.
9. Después de la carrera, se puede desechar el material de muestra restante y los archivos FCS pueden exportarse para su posterior análisis.

Resultados

Suspensiones celulares de cuerpo entero de los nervios ciático y los principales GRD fueron preparados, según el protocolo, a partir de seis ratones sanos de C57BL/6 y divididos en tres alícuotas iguales para la tinción. Contador de tinción con DAPI, que tiñe el ADN, permite la detección de una población de la célula (figura 1A–B, panel superior). Lavar el DAPI, antes del análisis por citometría de flujo, disminu...

Discusión

Nervios ciáticos contienen una gran proporción de lípidos como el colesterol, debido a su contenido de mielina alrededor de los axones. Puesto que las propiedades de los lípidos cambian con la temperatura, pueden obtenerse resultados distintos a diferentes temperaturas. Para garantizar la preservación de la célula, todas las medidas en el presente Protocolo después de la digestión fueron realizadas en hielo. Mientras que la consistencia se recomienda por la reproducibilidad de los resultados, es posible aumentar ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)	Thermo	31885023	The source of this material is not important
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated	Sigma-Aldrich	F4135
Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Antibody against MHC class II, biotinylated	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Antibody against CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Antibody against CD68-APC	Biolegend	137007	Clone FA/11
Antibody against CD206-PE	Biolegend	141706	Clone C068C2
Antibody against F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark
Cell dissociation sieve - tissue grinder kit	Sigma-Aldrich	CD1
V-Shaped, 96-well plates	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences