単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

要約

マウスの坐骨神経内のセルのコンテンツの定量的解析は組織の欠乏のために困難です。このプロトコルでは、組織の消化と個々 のマウスの神経から免疫細胞のフローサイトメトリー解析のため十分な細胞を提供する準備のためのメソッドについて説明します。

要約

末梢神経系 (PNS) で神経居住者免疫細胞が正常な神経で神経細胞の整合性を維持するため不可欠です。PNS の免疫細胞は怪我と病気、神経機能と再生能力に影響を受けます。神経免疫細胞は、蛍光抗体法 (IF) によって分析される一般的。一方、神経の免疫細胞の場所を決定する場合に不可欠な半定量的なだけあり、メソッドが同時に分析することができるマーカーの数および発現の程度に限定。この研究では、cytometry 流れは坐骨神経や個々 のマウスの後根罹 (Drg) に白血球浸潤の定量的解析に使われました。DAPI を使用して単一細胞分析を行った、いくつかのタンパク質は表面または細胞内のいずれかの式を同時に行った。このプロトコルに従って扱われた 1 つのマウスからの両方の坐骨神経には、≥ 30,000 単一核イベントが生成されます。坐骨神経の全セルの内容の 5%、DRG の約 5-10%、CD45 の表現によって決定される坐骨神経の白血球の割合は約だった。フローサイトメトリー マーカーの数を同時に測定するための柔軟性は、シュワン細胞、血管など、神経の中に存在他の細胞集団が、このプロトコルは PNS 内免疫細胞の人口に主に焦点を当てて、します。、、線維芽細胞と血管内皮細胞も分析できますこのメソッドを使用します。このメソッドは、したがって全身に及ぼす神経毒性学など神経障害や糖尿病などの慢性疾患の遺伝学的モデル、PNS の勉強の新しい手段を提供します。

概要

免疫細胞、循環から PNS を入力する CD45 と CD11b、式によって定義されている神経の整合性を維持し、再生と変性の¹の両方の役割を果たすに役立ちます。大食細胞 (マウス CD68 の発現によって定義された) より MHC の発現、炎症性表現型に向かって傾斜することができますクラス II および CD86 (M1)、表面にまたは抗炎症表現に向かってより多くの細胞内の CD206 を表現する (M2)².大食細胞の表現型の傾斜は、動的なプロセスを通して Akt シグナル³、(M1) 病原体に対する防御の大食細胞と組織再生 (M2) の役割のさまざまなタスクを反映した規制です。損傷した神経の再生は最初神経^4、5、および抗炎症におけるマクロファージによって髄鞘の残骸の貪食能を必要とする (CD68⁺CD206⁺) M2 マクロファージにおける軸索伸長を促進するために示されている、PNS⁶。募集または大食細胞を抑える、PNS や貪食障害能力障害再生と神経の恒常性を維持。MHC クラス II を表現する炎症性の M1 マクロファージは M2 マクロファージの貪食性ほどの能力であり、神経の炎症、いくつか神経変性疾患⁷の病因に関与しています。

神経住民免疫系の損傷の結果として発生する変更は定量的、CD45 の損失けんしょう、⁺白血球 (CD45 の浸潤を増加または⁺ケースの炎症で白血球)、や定性的なようM2 から M1 型マクロファージ表現型の変更します。PNS の免疫細胞は、凍結切片またはパラフィン包埋材料⁸を使用して場合によって伝統的に分析されています。もし興味のセルの局在を決定するために必要です。ただし、多くの場合数量を使用して信頼性と選択バイアスに対する脆弱性定量化を作る組織の狭いセクションのセルの比較的小さい数を数えてに依存します。大食細胞の表現型の定量が必要です少なくとも少なくとも 2 つのマーカー、特に CD206 と MHC ながら免疫細胞の特定のサブセットの識別のため細胞外および細胞内のマーカーの同時検出が必要です、クラス II です。場合によって免疫細胞の特定のサブセットの特性が制限し、不完全な要求をすることができます最もよく利用できる顕微鏡は少なくとも 2 色チャネル、かに (FITC)、フィコエ リスリン (PE) などに限られています。複数のスライドを持つ必要性は、染色し、並行分析関心の同じ領域から派生します。したがってこの時間がかかるのしない必要が大規模なサンプル セットの分析にそれ自身を貸します。さらに、興味のマーカーのほとんどが細胞外、パラフィンまたは cryoconserved にも埋め込まれています、組織で検出は膜の完全性の破壊とエピトープのマスキングと同様の損失のため問題が発生することができます。アセトン ・ メタノール⁹などの溶剤の使用からの興味の抗原。

対照的に、フローサイトメトリー、光を測定して単一細胞懸濁液中の蛍光特性、光のビームを通過する細胞集団の解析のためのより実用的で包括的な手段を提供します。組織のデジタル画像を生成するのではなく、フローサイトメトリー、セルの相対的なサイズおよび前方散乱 (FSC)、粒度/内部の複雑さと呼ばれる反射のインデックスを含めるパラメーターの設定の自動定量評価を提供していますか側方散乱 (SSC) と相対蛍光強度、セルは、共役抗体などの適切な蛍光でラベル付けされていますを提供します。典型的な流れの cytometer から成っている 2 つ、空冷レーザー;アルゴン レーザーは 488 で青い光を作り出す nm とヘリウム ネオン レーザーは 633 で光を生成する nm。この組み合わせは表面や細胞内コンパートメント内の少なくとも 5 つの目標の同時に、により検出と測定。高度な流れの cytometers は選択した螢のピーク発光波長が大きく重複しないを提供すること、一度に最大 8 つの異なる蛍光色素の検出を可能にする複数のレーザーで構成できます。

フローサイトメトリーによる解析、興味の組織する必要があります最初酵素によって消化される一般的にはコラゲナーゼ、単一細胞懸濁液を生成します。以前のマウスの坐骨神経の解析は、各マウスから得られた組織量が少ないため、難しかったです。さらに、軸索を髄鞘の高脂肪の内容細胞回復を阻害して大量の破片が生成されます。坐骨神経の準備と消化のためにここに記載されているメソッドは、バレッタらのシュワン細胞の隔離のプロトコルから適応されました。⁷、およびマウスの間の変動を減らすために十分な流れフローサイトメトリー解析のための個々 のマウスの神経細胞を分離することを目的。生組織ダイジェストで単一のセルの識別の DAPI を使用してよくセル損失につながる軸索の残骸を削除する必要性を回避できます。収量を増加脂肪の残骸内細胞のリリースで洗剤の豊富なバッファー エイズで数回洗浄に閉じ込められました。このプロトコルに従って単一のマウスから両方のフルレングスの坐骨神経の消化が ≥30、000 の単一核イベントを生成し、少なくとも 3 倍の数は、DRG から取得されました。CD45 の割合⁺白血球坐骨神経ダイジェスト約の合計セル コンテンツの約 5% であったDRG ダイジェストの 5-10%。CD45 の大半⁺坐骨神経細胞大食細胞マーカー、CD68 と CD206 を表明しました。

プロトコル

野生型 c57bl/6 マウス (男性; 10-12 週) 標準的な 12 時間明暗サイクルで保たれ、標準的な食事ダイエットと水への無料アクセスを提供していた。すべての動物実験が関連するガイドラインに基づきローカル動物のケアおよび使用委員会によって行われ、カールスルーエ、ドイツ (G216/10) 地域の権限でローカル動物のケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. マウスの灌流

1. 犠牲マウス (C57BL/6;男性;10 12weeks) CO₂を使用してまたはローカル規則に従って。
   注: レトロ軌道出血は、EDTA コーティング 1.5 mL チューブを用いた制御白血球を取得する実行できます。この方法で出血は、犠牲の直後にのみ効率的です。さらに、腹膜腔洗浄 (PCL) は、制御のマクロファージ、37 ° C で血流を妨げる可能性があります血の冷たい凝集を避けるために事前に加熱された PBS を使用してを取得する実行できます。
2. 70 %v/v エタノールと自由に腹部の毛皮を噴霧し、繰り返しを綿ガーゼでティッシュで拭くしてマウスを消毒します。縦切開で腹部の皮膚を切開、鋏は使いよう 】 を使用します。
3. 曲線、鈍のはさみを使用して、胸郭の全体の長さに沿って切開を拡張し、横隔膜切開、胸腔内を公開します。離れて慎重に胸骨を解除ことができますまで側に同じような切口を作る。
4. 心臓や大血管のクリアな視界、蝶 23 ゲージの針、50 mL シリンジに接続して挿入は、心臓の左室に氷冷 PBS でいっぱい。
5. 下行大動脈を損傷することがなく、できるだけコンセントの同様に大きい作成するアイリスはさみを使用して心臓の右心房に切開を行い約を介してプッシュする注射器をゆっくり低下させる30 mL の PBS。滲出液は、明確な実行必要があります。肝臓や腎臓のクリアは、良い血流の指標として使用できます。

2. 坐骨神経および後根神経節の郭清

注: 坐骨神経の解剖、臀筋大殿が削除されると、マウスは、上記の皮膚下に位置腹側下肢を伸ばしながら。

1. 両側背側大腿から筋肉組織を分離することによって全体の坐骨神経を解剖し、脊柱に沿って神経をフォロー アップ。脊柱から、すぐにもう一方の端で膝の上が終了する神経をカットします。
   注: は、破砕や鉗子で引っ張るなど神経の過剰な処理を避けてください。
2. 鉗子を使用して摘出受ける、氷冷 PBS と氷上店の 1 mL を含む 1.5 mL チューブへの神経あたり約 2 cm を転送します。
   注: 神経は、氷で夜通し保存することができます。
   注: 使用鉗子、メス、後根神経節の郭清のため、子宮頸、胸部、腰椎の脊髄地域を公開する残りの背部皮膚をそっと剥がして下層軟部組織から皮膚をデタッチします。鈍はさみのペアを使用して頭蓋骨の根元の切断によって頭部を取除き。
3. 脊柱の前方側に接続、内臓をデタッチする前と、両側に脊柱に近い平行リブをカットします。大腿骨をカットし、カットに対する大腿骨のレベルで横で脊柱を削除します。アイリスのはさみを使用するは、筋肉、脂肪、および背骨から他の軟部組織に切り取る。
4. 脊柱を背側を上に置き、3 位置で切り取られる骨脊柱管にはさみの先端を押し込んで、尾側から始まる、それを開くにします。9 位置に手順を繰り返します。
   注: それは DRG の損傷を避けるために正確にカットすることが重要です。
5. サイド ・ ツー ・ サイドからの切断を繰り返して吻側の端に達するし、脊髄を完全に公開します。解剖顕微鏡を用いた、脊髄脊椎内 Drg を検索する使用ことができる脊髄神経を公開するを削除します。
6. アイリス ハサミ、Drg を削除する神経および結合組織をクリッピング、脊柱管に DRG を引っ張って後根に優しく揺さぶることにより腰椎の drg コードを削除します。
   注: それは坐骨神経に貢献する L4 L6 DRG にコレクションを制限することが可能です。
7. 鉗子を使用して、約 1 mL の氷冷 PBS を含む 1.5 mL チューブに、Drg を転送および氷の上保存します。
   注: 神経は、氷で夜通し保存することができます。

3. 坐骨神経および後根神経節の消化

1. デオキシリボヌクレアーゼ、氷の上の店の 100 μ g/mL を添加した消化メディア (DMEM、10 mM HEPES、5 mg/mL BSA、1.6 mg/mL コラゲナーゼ型 4) を準備します。
   注: マウス (坐骨神経 + DRGs) ごとに必要な消化中の量は 1 mL です。-20 ° C で消化メディアの因数を格納できる準備が整うと、
2. 500 μ L の消化メディアを含む独立した 1.5 mL チューブに 1 つのマウスから坐骨神経や drg コードを転送します。坐骨神経のため、材料を刻んで春はさみを使用してください 15-20 個セットと穏やかな攪拌 (≤ 450 rpm) と 20 分のための 37 ° C で揺れインキュベーターで組織懸濁液をインキュベーションしています。
3. 任意の不完全な消化組織を機械的に分離する 1,000 μ L ピペット チップを介して細胞懸濁液を繰り返しカップ刻んだ。
   注: 懸濁液を滴定しなさいにくい場合、ピペットの先端を平滑末端を作成するハサミでカットします。穏やかな攪拌 (≤ 450 rpm) で 20 分の 37 ° C の組織懸濁液を孵化させなさい。
4. 1,000 μ L ピペット チップを製粉を繰り返し、穏やかな撹拌 (≤ 450 rpm) で 37 ° C でさらに 10 分間インキュベートします。
5. FACS バッファー (10 %fcs と 1 mM EDTA を添加した PBS) を準備し、氷の上保存します。リンス、FACS バッファー 140 μ m のメッシュ サイズ ステンレス製画面に漬 60 × 15 mm シャーレ氷の上。
   注: それは有核細胞の収量の大幅な損失につながる、ナイロン スクリーン フィルターは避けてください。
6. 氷上鈍い鉗子が付いて、シャーレで開催されるように 140 μ m スクリーン フィルターを繰り返し組織懸濁液を通過します。ペトリ皿から細胞懸濁液を収集し、氷の上に格納されている新しい 1.5 mL チューブに転送。
7. 繰り返される製粉 1,000 μ L ピペット チップでを介してフィルターに残っている任意の不完全な消化組織をプッシュします。FACS バッファーの 500 μ L で 2 回画面フィルターを洗浄し、ペトリ皿ステップ 3.6 から細胞懸濁液とを組み合わせることで結果として得られる細胞懸濁液を収集します。
   注: 使用される流れの cytometer が破片に敏感の場合ステップ 3.7 から細胞懸濁液通過できるか 70 μ m スクリーン フィルター;ただし、これは有核細胞の収量の損失につながる可能性があります。
8. 4 ° C で 5 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心分離します。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。この洗浄工程をもう一度繰り返します。
9. 必要な (150 μ L FACS バッファー染色パネルごと) にある染色の数によって、FACS バッファーの 150 350 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。

4. フローサイトメトリー用坐骨神経と蛍光に分類された抗体に DRG の染色

1. 氷の上 96 ウェル プレートで V 字に坐骨神経の後根神経節細胞懸濁液 100 μ L を転送します。
   注: 単一染色性細胞、彼らは区別から特定する光電子増倍管 (PMT) 電圧ゲインと同様、補償に関してフローサイトメトリーを設定するために必要なコントロールを提供するように使用されるすべての抗体のために必要です非特異的結合。坐骨神経および DRGs からの限られた材料のため血の白血球と単一染色コントロール、染色として使用できます (手順 1.1 1.2) PCL からマクロファージを坐骨の染色と並行して実行する必要がありますのDrg の神経.
2. 残りのプールは細胞懸濁液 (1 サンプルあたり約 50 μ L) 坐骨神経または DRG サンプル、無染色のコントロールとして機能するからです。
3. 4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心分離します。ビンをプレートを反転し、手首の鋭い映画に適用上澄みを廃棄し、軽くペーパー タオルで乾燥。
4. 表面汚損のため (MHC クラス II-ビオチン、CD11b-PerCP/Cy5.5 CD45 A647) 興味の抗体を含む FACS バッファーの 20 μ L で各細胞ペレットを再懸濁します、インキュベート、30 分間氷の上の光から保護します。
   注: (1) 最適な抗体の希釈は、製造元の製品情報によると希釈系列を実行して使用する前に決定をする必要があります。(2) 非特異的染色は、製造元の指示に従ってこの段階で Fc ブロックと孵化によって減らすことが(3) のアイソタイプ コントロール染色一般的に必要はありません直接共役、fluorophore とおよび/または興味の菌株が異なる集団を生成するときの一次抗体を使用する場合。
5. 各ウェルに FACS バッファーの 130 μ L を追加し、4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心前述の (ステップ 4.3) と FACS バッファーの 150 μ L で 2 回細胞ペレットを洗浄、上澄みを廃棄します。
   注: 非一次抗体またはビオチン標識一次抗体を使用する場合、この時点、fluorophore に活用される適切な二次試薬を追加できます、4.4 4.5 の手順が繰り返されます。このプロトコルの場合は、ストレプトアビジン-PE/Cy7 またはストレプトアビジン PerCP が MHC クラス II CD68 APC と F4/80-PE/Cy7 との組み合わせ、CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 との組み合わせでそれぞれ検出する使用されました。
6. 最後の洗浄工程後の固定は、100 μ L の PBS (pH 7.4) で 4% パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを再懸濁します。10 分間氷の上プレートをインキュベートし、4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離前述 (ステップ 4.3) として上澄みを廃棄し、FACS バッファーの 150 μ L で一度細胞ペレットを洗浄します。
   注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護手袋、眼鏡などを着用してください。
   注: は、FACS バッファーと 2 日前まで 4 ° C で、光から保護されたストアの 150 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。細胞内染色する必要がない場合は、4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心分離後ステップ 4.11 に進みます
7. 細胞内染色の FACS buffer+0.5% 洗剤の 150 μ L で細胞ペレットを再懸濁し、15 分 4 ° C で 5 分間遠心する 400 x g でプレートの光から保護、室温でインキュベート前述 (ステップ 4.3) として上澄みを廃棄し、FACS バッファー + 0.5% 洗剤の 150 μ L で一度細胞ペレットを洗浄します。名所 (CD68 APC、CD206 PE) 抗体を含む FACS buffer+0.5% 洗剤の 20 μ L で細胞ペレットを再懸濁します、インキュベート、30 分間室温で、光から保護されています。
8. 各ウェルに FACS buffer+0.5% 洗剤 130 μ L を追加し、4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心前述の (ステップ 4.3) と FACS バッファー + 0.5% 洗剤の 150 μ L で 2 回細胞ペレットを洗浄、上澄みを廃棄します。
   メモ: 非一次抗体またはビオチン標識一次抗体を使用する場合、適切な二次の試薬、蛍光体に共役を追加できますこの時点と 4.9 4.10 の手順を繰り返します。
9. 2 日前まで 4 ° C で、光から保護 FACS バッファー + 0.5% 洗剤とストアの 150 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。
10. 150 μ L FACS バッファー + 0.5% 洗剤 5 μ G/ml DAPI を添加した細胞ペレットを再懸濁します、光から保護、室温で 5 分間インキュベートします。4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心分離します。前述したように清 (ステップ 4.3) を破棄します。
11. 150 μ L の PBS とラベルの FACs チューブへの転送では、細胞ペレットを再懸濁します。分析のための準備ができるまで、光から保護、室温で保存します。
    注: PBS に再懸濁後、細胞を分析し、時間、以内、DAPI がゆっくりと信号の損失につながる DNA から分離してしまうので。

5 フローサイトメトリーおよびサンプルの実行のセットアップ

1. 確実に流れの cytometer は適切なレーザーを装備、使用細胞を染色する蛍光物質を測定するフィルターを設定します。これは、システムの既定の cytometer 構成下で決定できます。このプロトコルの場合セルを行った 3 つのレーザーを搭載したフローサイト (405 nm、488 nm、および 633 nm) 5 フルオロ ≤ の検出を可能にします。
2. 興味の蛍光物質の検出のための適切なチャネルを選択します。すべての蛍光シグナルは最高対数増幅検出されます。
3. サンプルの適切な流量を選択します。このパラメーターは、使用しているシステムによって異なることが、経験的に定められるべきであります。このプロトコルの場合 MED は-HI (35-60 μ L/分) の流量は針の目詰まりを防ぐために使用されました。
4. サンプルごとに収集するイベント/セルの合計数を選択します。イベントの最小数は、1,000,000 をする必要があります。
5. 対 SSC A のグローバル ワークシート下散布プロットを作成する FSC の FCS A. 対利息の各 fluorophore の同様イベントおよび選択した fluorophores の平均蛍光強度 (MFI) の数を表示する統計ビューを作成します。
6. 最小の細胞が散布の低い左 10% に収まるようには、SSC、FSC A チャンネルの電圧を設定します。背景の蛍光性と坐骨神経または DRGs。 散布に基づいて親 (P1) ゲートを決定するから無染色のコントロールから最小サンプル蛍光 DAPI 専用からプロットを決定するコントロールの汚損。
   注: これはありませんコレクション ゲートのため一部、PNS の DAPI + 人口の異種の性質に。
7. 興味の fluorophores の各プロット FSC 散布図を使用して、無染色のコントロールのセルは、それぞれ散布の低い四半期の中で落ちるように、電圧を調整します。ゲートごとにそれぞれマーカー/fluorophores の肯定的なそれらのセルを定義するこの地域上に作成されます。ゲートの配置は、単一染色コントロール (手順 4.1) の実行によって確認されます。
   注: 発光スペクトルを重複する補償することができますこの時点で実行または適切な分析ソフトウェアを遡及的に適用されます。
8. 流れの cytometer は、説明されているように、設定されている、サンプルを実行できます。
9. 実行後残りのサンプル材料を破棄し、さらに分析の FCS ファイルはエクスポートできます。

結果

フルレングスの坐骨神経すべての主要な後根神経節から細胞を懸濁液六つの健康的な c57bl/6 マウスからプロトコルに従って準備、汚損のための 3 つの等しい因数に分かれています。DNA を汚す DAPI 染色カウンターは、単一細胞集団 (図 1 a-B、上部のパネル) の検出が可能です。洗浄、フローサイトメトリーによる解析の前?...

ディスカッション

坐骨神経には、軸索の周りのミエリンのコンテンツのためのコレステロールなどの脂質の大部分が含まれています。以来、脂質の特性は温度によって変化、異なる温度で異なる結果を得られるかもしれない。、細胞を保護するには、氷の上消化後このプロトコルのすべてのステップを行った。結果の再現性のために、整合性を推奨しながら 3.6、3.7 室温での手順を実行して歩留まりを増加す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)	Thermo	31885023	The source of this material is not important
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated	Sigma-Aldrich	F4135
Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Antibody against MHC class II, biotinylated	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Antibody against CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Antibody against CD68-APC	Biolegend	137007	Clone FA/11
Antibody against CD206-PE	Biolegend	141706	Clone C068C2
Antibody against F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark
Cell dissociation sieve - tissue grinder kit	Sigma-Aldrich	CD1
V-Shaped, 96-well plates	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences