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Resumen

Funciones célula Autónoma de genes en el cerebro pueden ser estudiadas mediante la inducción de la pérdida o ganan de función en poblaciones dispersas de las células. Aquí, describimos en el útero la electroporación para entregar recombinase de Cre en poblaciones escasas de desarrollo de las neuronas corticales con genes floxed a causar la pérdida de función en vivo.

Resumen

Funciones neuronales células autónomas de genes pueden ser reveladas por una pérdida o ganan de función de un gen en una población pequeña y escasa de neuronas. Para ello requiere generar un mosaico en que las neuronas con la pérdida o ganancia de función de un gen están rodeadas por tejido genéticamente imperturbable. Aquí combinamos el sistema de recombinación del Cre-lox con electroporación en el útero con el fin de generar el tejido de cerebro de mosaico que se puede utilizar para estudiar la función celular Autónoma de genes en las neuronas. Construcciones de ADN (disponibles en repositorios), codificación para una etiqueta fluorescente y recombinase de Cre, se introducen en el desarrollo de las neuronas corticales que contienen genes flanqueados con sitios loxP en los cerebros de embriones de ratón con el útero en electroporación. Asimismo, describen varias adaptaciones para el método de electroporación en el útero que aumentan la supervivencia y reproducción. Este método también implica establecer un título para la recombinación mediada por la Cre en una población densa o escasa de neuronas. Preparaciones histológicas de tejido cerebral marcada no requieren (pero puede ser adaptadas a) immunohistochemistry. Los constructos utilizados garantizan que etiqueta fluorescente las neuronas llevan el gen del recombinase de Cre. Preparaciones histológicas permiten análisis morfológico de neuronas a través de la proyección de imagen confocal de cenadores dendríticas y axonales y espinas dendríticas. Debido a la pérdida o ganancia de función se realiza en tejido mosaico escaso, este método permite el estudio de la célula autónoma necesidad y suficiencia de productos gen en vivo.

Introducción

La generación de un mosaico genético, es un paradigma experimental clásico para entender la función de un gen de interés. Para determinar si un gen es necesario para un fenotipo celular, el enfoque más sencillo está causando una pérdida de función del gen en el organismo (por ejemplo, knockout). Sin embargo, para determinar si un gen se requiere específicamente en un determinado tipo de célula, golpe de gracia del gene en el organismo no es un enfoque válido. En cambio, se requiere un método que causará la pérdida de función de un gen en una célula determinada, mientras que está rodeado por tejido de tipo salvaje (es decir, genéticamente imperturbable), en otras palabras, crear tejido mosaico. Si la célula mutante muestra un fenotipo mutante, pero no las células circundantes de tipo salvaje, las funciones del gene de una manera autónoma de células. Análisis de tejido de mosaico, en el que las células mutantes están rodeadas por tejido de tipo salvaje, es ideal para la comprensión de la célula autónoma funciones de genes, especialmente en el cerebro donde las neuronas y glia forman una vasta red interconectada de tejido.

Varias formas de tejido cerebral de mosaico han proporcionado poderosos modelos para investigar la célula autónoma funciones de genes. Estudios se centraron en el trasplante neuronal1, mosaicism ligadas al cromosoma X femenino2,3,4, y mosaicism somático endógena5,6 han extraído sus conclusiones basados en mosaico tejido cerebral. Supresión condicional de un gen a través del sistema de recombinación del Cre-lox es un método que aprovecha la gran disponibilidad de líneas de ratón transgénico. En este método, se introducen dos loxP sitios a ambos lados de una secuencia necesaria de un gen (como un exón), dejándola flanqueado por sitios loxP que enfrentan a ambos en la misma dirección ("floxed"). Recombinase de CRE accisas la secuencia entre la loxP sitios7. Recombinación mediada por la CRE se logra por los ratones de floxed paso a otra línea de ratón expresan recombinase de Cre junto con un marcador fluorescente en un subconjunto de células ("línea de la reportera de Cre"). Esto se ha demostrado en una variedad de maneras para descubrir las funciones de un gen en subconjuntos de células como neuronas excitatorias o astrocitos8. Líneas de reportero de CRE pueden expresar CreERT2 para permitir la recombinación mediada por la Cre a ser droga-inducible (solo-neurona etiquetado con knockout inducible Cre-mediada, o SLICK)9. En otra estrategia llamada análisis de mosaico con doble marcadores (MADM)10,11, Cre-mediada intercromosomal recombinación permite un mutante homocigótico para crearse junto con tejido heterozigótico. En estos enfoques, una nueva línea de ratones debe ser producido cada vez para cada gen candidato o subtipo celular que se ha probado. Por otra parte, recombinase de Cre puede introducirse postnatal a través de iontoforesis12 o vectores virales (e.g. virus adeno-asociados13 o lentivirus14 llevar celulares específicos de subtipo promotores). Esta estrategia crea fuerte y postnatal de etiquetado. Para desarrollar las neuronas corticales cerebrales escasamente y prenatally, una estrategia ideal es en el útero la electroporación del recombinase de Cre con un marcador fluorescente.

Además de combinar la recombinación del Cre-lox a través de electroporación en el útero para producir mosaico tejido en vivo, introducimos varias adaptaciones a los procedimientos de otros protocolos publicados15,16, 17,18,19,20,21. Proporcionamos información para mejorar el éxito en las mujeres embarazadas en tiempo de cría. También describiremos nuestros dos estrategias para introducir rala y brillante etiqueta de neuronas en el tejido cortical: una estrategia es valorar los niveles de una construcción única codificación recombinase de Cre y un marcador fluorescente22. Otra estrategia es utilizar el sistema de "Supernova", diseñado específicamente con estos parámetros en mente23,24. Además, nos ofrecen mejoras en la producción de microinyección consistente pipetas y simplificaciones a la cirugía en el útero la electroporación. Finalmente, describiremos los pasos críticos en un preparado histológico simplificado que permite el análisis de espinas dendríticas y cenadores dendríticas y axonales, sin más manchas o inmunohistoquímica.

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Protocolo

Métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) de la Universidad James Madison y están de acuerdo y conformidad con todas las directrices pertinentes del reguladoras e institucionales.

1. configuración del ratón

  1. Casa de un joven (> P60) ratón macho y hembra homocigótica floxed para establecer un criador par25.
    Nota: Un buen control negativo consiste en establecer un par adicional de criador de ratones de tipo salvaje, que Cre expresión recombinase no hará un mosaico26.
  2. Permitir a la hembra parir y criar su primera camada con el varón. Mantener el macho con la hembra para aumentar la supervivencia de la camada. Después del destete de la camada, por ejemplo, en el día postnatal (P) 21, separar a la hembra y macho.
  3. Cría de ratón
    1. Establecer un tiempo de acoplamiento entre el femenino y masculino25. Utilice señales visuales para determinar el ciclo estral de la mujer27y busque tapones vaginales por la mañana después de aparearse25.
    2. Si se encuentra un enchufe, separa y pesa la hembra. Contar el día como el día embrionario (E) 0,5.
    3. Sigue pesando la hembra cada 3-5 días para determinar si está embarazada. Las hembras embarazadas tendrá un aumento de 10-20% en el peso corporal 7-10 días después de la concepción (E0).
      Nota: Este paso confirma embarazo antes y más confiable de la inspección visual25.
    4. Si la mujer no está embarazada, repita los pasos del 1.3.1-1.3.3.
  4. Una vez confirmado el embarazo, elegir la fecha de la electroporación en el útero . Para capa II/III cortical piramidal trasplante de precursores neuronales, realizar electroporación en E15.5.

2. configuración de ADN

  1. Elegir un solo ADN construir eso códigos para recombinase de Cre, así como un marcador fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP)28,29. Como alternativa, utilizar el sistema de "Supernova", descrito en detalle en anteriores publicaciones23,24. Ver lista de materiales por ejemplo construye.
  2. Amplificar el ADN construct(s) en el paso 2.1 en e. coli mediante técnicas microbiológicas estándar30.
  3. Purificar el constructo de ADN con un kit de purificación del plásmido libre de endotoxina siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir la estructura con agua libre de endotoxinas.
    Nota: Elegir un kit de purificación libre de endotoxinas sobre un kit de purificación estándar es crítico.
  4. Concentran el eluido de ADN a 1-3 mg/mL dependiendo de densidad etiquetado deseado26.
    Nota: Un título siempre debe establecerse cuando se trabaja con una nueva construcción de ADN, dado que tienen promotores y longitudes diferentes. Considerar la inyección de una construcción en varios diferentes concentraciones o cantidades para evaluar expresión. Por ejemplo, inyección de 1 μl o 1,5 μl de 2.0 mg/mL GFP. CRE es capaz de provocar escaso (1 μl) o denso (1,5 μl) de la capa II/III de las neuronas piramidales corticales visuales26.
  5. Agregar 0,4% trypan azul en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 H2O, ajustada a pH 7.4 con HCl) 1:10 para la solución concentrada de la DNA.
  6. Añadir 10 x PBS 1:10 a la solución concentrada de la DNA.
  7. Almacenar la solución concentrada de la DNA a 4 ° C. La solución puede almacenarse indefinidamente.

3. pipeta puesta a punto

  1. Utilizando un extractor de capilar de vidrio, tire una pipeta con una muy larga (10-15 mm) forma cónica y muy fina punta, típica de pipetas para la inyección de células madre embrionarias o transferencia nuclear31.
    Nota: Para evitar que los residuos contaminen las pipetas, se debe hacer dentro de 2 días de la cirugía.
    1. Calibre el extractor de capilar de vidrio realizando una prueba de rampa, siguiendo las instrucciones del fabricante. Uso el valor resultante del calor para programar tirando de un protocolo usando los siguientes parámetros: calor = (valor de prueba de rampa + 15), tire = 30, vel = 120, tiempo = 100, presión = 200. Insertar el tubo capilar de vidrio, fijar las abrazaderas en tirador y activar el protocolo tirando programado, creando una conicidad en el capilar de vidrio.
    2. Asegúrese de que la forma cónica es entre 10-15 mm, utilizando un microscopio óptico compuesto (por ejemplo 10 objetivo de X) de31.
  2. Romper nuevamente la pipeta para formar una punta con bordes ásperos para 20-25 μm de diámetro.
    1. Centro de un trapo de tarea single ply (véase lista de materiales) en 50 mL vaso de precipitados y tramo Limpie tensos con una mano. Con la otra mano, sostenga y empuje una pipeta (forma cónica hacia abajo) perpendicular y completamente a través del centro del trapo, causando una ruptura en el taper31.
      Nota: Empujar la pipeta completamente a través de la limpieza producirá una punta de 20-25 μm de diámetro alrededor del 70% del tiempo.
    2. Confirman bajo un microscopio óptico compuesto (por ejemplo, objetivo de 20 x).
      PRECAUCIÓN: Use gafas de protección al romper el vidrio.
  3. Calibrar una pipeta de aspiración 1 μl de tripano 0.4% azul de 1 x PBS en un piptte parcialmente lleno, entonces graduarse la pipeta con marcas de 1 μl basado en la altura de 1 μL en la pipeta, usando un marcador de punta fina resistente al alcohol. Utilice la pipeta calibrada para graduarse las otras pipetas antes de desecharlo. Mantenga las pipetas en un porta pipeta libre de polvo y otras partículas.

4. en el útero de electroporación

  1. Graefe pinza, tijeras de iris, Hartman pinza mosquito, esponjas de Gasa no tejida, pinzas con punta de anillo y platos de Petri en una bandeja de acero inoxidable y envolver con papel de aluminio. Coloque la bandeja y solución salina al de 0.9% 1 L (0.9% wt/vol NaCl en agua) en autoclave. Autoclave a 121 ° C y 3.5 kPa 40 minutos retirar del autoclave y coloque en un área quirúrgico desinfectado.
    Nota: Es crítico para mantener las condiciones estériles durante la cirugía.
  2. Caliente la botella de solución salina 1 L esterilizado en un baño de agua a 38 ° C al menos 2 h antes de la cirugía.
  3. Conectar los electrodos tipo pinza y el pedal al generador (ver lista de materiales). Siguiendo las instrucciones del fabricante, coloque el generador para entregar cinco pulsos de 50 ms de 50 V (con un intervalo de 950 ms) cuando accionado por el pedal. Desinfecte los electrodos tipo pinzas y coloque sobre el área desinfectado.
  4. Hacer un cono de nariz anestesia previamente publicados32, pero utilice el extremo de un dedo de guante de látex o nitrilo para formar un diafragma que se ajusta firmemente sobre la abertura del cono de nariz. Corte un agujero en el diafragma lo suficientemente grande como para caber en el hocico del ratón.
  5. Profundamente anestesiar ratones embarazadas E15.5 en una cámara de inducción con isoflurano (2-4%) en oxígeno puro, que fluye a 1 L/min. Después de ~ 1 min, prueba el reflejo de adrizamiento (suavemente incline la cámara de inducción y asegurarse de que el ratón no correcto sí mismo). Peso del ratón para determinar la dosis de la analgesia administrada más adelante durante la cirugía.
  6. Transferir el ratón a la zona quirúrgica y administrar inhalado isoflurano (1-2%) en oxígeno puro, que fluye a 1 L/min a través de un cono de nariz para mantener el ratón en plano quirúrgico. Utilizar pinzas para poner a prueba el reflejo pedal (pellizcar suavemente la pata y asegurarse de que el ratón no devuelve un reflejo) para verificar la anestesia. Vigilar frecuencia respiratoria y el esfuerzo, buscando regular respiración profunda (~ 70-100 respiraciones/min), y que las membranas mucosas color rosado y húmedo.
  7. Aplique suficiente ungüento oftálmico veterinaria sobre los ojos para cubrirlos completamente para la protección contra la desecación durante el procedimiento.
  8. Flex el disco de metal activador de una bolsa sellada llena de sobresaturado solución de sal (ver lista de materiales), activando una cristalización exotérmica de la sal. Coloque 2 single ply tarea trapos encima de la bolsa y coloque el ratón sobre la bolsa para mantener la temperatura corporal.
  9. Masaje crema depilatoria en la zona abdominal con hisopos de algodón hasta que la piel abdominal disuelva (aproximadamente 20-40 s), después limpie la piel abdominal. Cuidadosamente Limpie cualquier residuo y depilatorio crema de restante con 70% etanol y algodón hisopos. Coloque un paño quirúrgico estéril fenestrado sobre el área abdominal.
  10. Utilizando una técnica aséptica, jale la piel arriba del abdomen con pinzas Graefe y haga una incisión de línea media ventral de ~ 2 cm en la piel con unas tijeras de iris, asegurando que no se corta músculo subyacente.
    Nota: Una alternativa aceptable al hacer una incisión con tijeras pinzas y iris Graefe es utilizar un bisturí, como anteriormente publicado17.
  11. Encontrar la linea alba para visualizar la línea media de los abdominis del músculo recto. Tirar de músculo para arriba y lejos de abdomen con pinzas Graefe y haga otro ~ 2 cm del midline incisión allí con tijeras de iris, exponiendo la cavidad abdominal (el útero está translúcido y embriones serán visibles por debajo). Asegúrese de que la subyacente Tejido uterino e intestinal no se corta. Hacer la incisión sólo lo suficientemente grande (típicamente ~ 2 cm) para sacar y exponer el útero cómodamente.
    Nota: Una alternativa aceptable al hacer una incisión con tijeras pinzas y iris Graefe es utilizar un bisturí, como anteriormente publicado17.
  12. Utilizando una punta de micropipeta estéril de 10 μl, dispensar carprofen (disuelto en solución salina 0.9% estéril) a 4 mg/kg en la cavidad abdominal para la analgesia.
  13. Sujetar una pinza de mosquito de Hartman en el borde izquierdo de la incisión de abdominis del músculo recto. Descansar el fórceps en plato de Petri volcada a la izquierda de la incisión, mantener abierto el lado izquierdo de la incisión. Abrazadera de otra pinza de mosquito de Hartman en el borde derecho de la incisión de abdominis del músculo recto y descansar el fórceps en un plato de Petri volcada a la derecha de la incisión, manteniendo el lado derecho de la incisión abierta. Coloque gasa alrededor del área de la incisión.
  14. Con unas pinzas de anillo (sin un tornillo límite adjunto), tire del útero entre cualquier dos embriones vecinos sin machacar o herida de cualquier tejido. Comience a tirar hacia fuera de todos los embriones a través de la incisión, poniéndolos encima de la gasa esponja. Al sacar los últimos embriones de la cavidad abdominal, asegúrese de no tirar de los ovarios o el cuello uterino. Una vez expuesto, es fundamental para mantener el útero húmedo con solución salina tibia. El útero normalmente contiene entre 5 y 8 embriones.
    Nota: Es posible agregar penicilina y estreptomicina a la salina17.
  15. Conectar una pipeta calibrada a la Asamblea de tubo de aspirador (ver lista de materiales) e inyectar exactamente 1 μl de la solución de ADN preparada en el paso 2 a través de la pared uterina en un ventrículo lateral de cada embrión. Ventrículos laterales aparecen como dos manchas en el telencéfalo dorsal del embrión (los parches son más oscuros que el tejido del telencéfalo). Utilice el pulgar y el índice durante la microinyección y electroporación para manipular los embriones, revelando los ventrículos laterales y permitir que los embriones destinados a ser empujado suavemente contra la pared uterina durante la inyección. Confirman éxito inyección observando trypan azul de llenado del ventrículo lateral.
  16. Colocar el cátodo de electrodos tipo pinza (ver lista de materiales) en el útero, directamente sobre la corteza medial y caudal a la corteza visual (sectores alternativos del cerebro requerirá colocación del electrodo diferentes)16, 26. Colocar el ánodo sobre el útero, sólo inferior y anterior de la cabeza del embrión.
  17. Confirmar que el ánodo y el cátodo son tocar el útero que rodea al embrión en los lugares apropiados. Con un pedal, activador de la entrega de cinco pulsos de 50 ms de 50 V (con un intervalo de 950 ms) a través de los electrodos.
    Nota: La inyección,-cargado negativamente DNA se moverá hacia el cátodo y se incorporarán a las células de la zona ventricular más cercanas al cátodo.
  18. Retorno del útero a la cavidad abdominal en la misma orientación que fue encontrado. Use solución salina para lubricar el útero mientras que guiarla manualmente y muy suavemente, cuidando de no para desplazar de su posición en el útero los embriones.
  19. Cerrar los músculos abdominales con suturas absorbibles (véase lista de materiales) con una simple puntada interrumpida, atar los extremos con un nudo cirujano. Hacer clip no que demasiado cerca de los extremos al nudo o nudo se convertirá en desató.
    Nota: Es crítico para la sutura de los músculos abdominales que los bordes de la herida se cierran completamente cerrados, pero sin causar palidez del músculo. Nudos deben ser apretados para que no se pueden ser desabrochados.
  20. Cerrar la capa de la piel con suturas absorbibles (punto interrumpido simple, nudo de cirujano, como en el paso 4.19). Aplique una pequeña cantidad de adhesivo tisular para sellar la herida. Aplique el adhesivo de tejido en los nudos para evitar que se desenganche. Utilice una micropipeta para quitar cualquier adhesivo de tejido que rodea la herida que puede ser aspirada por la micropipeta.
  21. Reducir los niveles de isoflurano a 0.5-1.5%. Una vez que el adhesivo tisular es seco (prueba de tocar el guante al adhesivo), retirar del isoflurano y dejar mujer recuperar solo en una jaula caliente. Administrar la buprenorfina por vía intraperitoneal a 0,03 mg/kg utilizando una jeringa de 1 mL con una 26G, ½" aguja.
  22. Seguir vigilando el ratón hasta que el ratón es recuperado y comportarse normalmente (es decir, preparación, exploración de jaula, comer o beber). Una vez recuperado, volver a colocar mujeres en jaula con el macho.
    Nota: Si se siguen todos los pasos, el ratón suelen recuperar la conciencia en 2 minutos y comenzar inmediatamente a mover sobre la jaula, sin signos de malestar.
  23. Si el ratón muestra señales de incomodidad (p. ej. encorvada postura, secreciones de porfirina)33, administrar carprofen 0.1 mg/ml en agua. Si se presentan varios signos de incomodidad o malestar persiste por más de 4 h a pesar de administración de carprofeno eutanasia inmediatamente el ratón mediante la administración de una inyección letal intraperitoneal de ketamina - xilacina (48 mg/kg) - (240 mg/kg) Cóctel de acepromazina (1,85 mg/kg) utilizando una jeringa de 1 mL con una 26 G, ½" de la aguja y seguir con una forma secundaria aprobada de eutanasia33.
  24. Para aumentar la supervivencia de embriones de electroporated después del nacimiento, mantener la jaula en un lugar tranquilo, con habitación libre de ruidos y vibraciones. Enriquecer el ambiente con iglús plástico, materiales de anidación y suplementos dietéticos tales como semillas de girasol (ver lista de materiales). No mover ni perturbar la jaula, particularmente durante los 3 primeros días después del parto.

5. preparación histológica para microscopía de fluorescencia

Nota: Este protocolo de histología está optimizado para la preparación de tejidos de animales mayores de día postnatal (P) 13 que fueron electroporated en el útero. Para preparar el tejido de los animales más jóvenes postnatales (P0-P13), se recomienda seguir todos los pasos (incluyendo la perfusión transcardial), aunque el cerebro debe ser embebido en agar antes de la preparación de secciones (paso 5.9). Incluso se puede preparar tejido de embriones dentro de 1-2 días después de la electroporación, utilizando métodos descritos18,20.

  1. Preparar solución de paraformaldehido (PFA).
    Nota: Es imprescindible preparar PFA fresco, dentro de un día del experimento.
    PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico y debe manejarse en una campana de humos con equipo de protección personal.
    1. Para hacer 50 mL 4% PFA, calor 40 mL de agua a 60 ° C. Añadir 2 g PFA removiendo con barra de cristal barra o agitación. Añadir 10 μl de NaOH M 10 cada 2 min hasta que se disuelva el PFA.
    2. Añadir 5 mL de PBS de x 10 y solución a un volumen final de 50 mL con agua.
    3. Después de traer solución a 50 mL, ajustar el pH a 7,4 con 10 M solución de HCl. Deje enfriar y almacenar a 4 ° C.
  2. Eutanasia del ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina - xilacina (48 mg/kg)-(240 mg/kg) utilizando una jeringa de 1 mL con una 26G, ½" aguja de acepromazina (1,85 mg/kg) cocktail. Transcardially perfusión 10 o 20 mL helado 1 x PBS, seguido de 25 o 40 mL recién hecho, helada 4% PFA17. Utilizar volúmenes menores para ratones (P0-P13) postnatales jóvenes y mayores volúmenes para los ratones más viejos (P14 y arriba).
  3. Inmediatamente después de la perfusión, decapita a canal de ratón entre hueso occipital y la vértebra C1 con grandes tijeras y retire y desechar la mayor parte de la piel que rodea el cráneo con unas tijeras de iris, particularmente piel occipital, parietal y frontal circundante huesos. Mantener intacto el cráneo y el cerebro.
  4. Colocar el cráneo y el cerebro en 10 mL 4% PFA en un tubo cónico de 50 mL por 24 h a 4 ° C para fijar los tejidos. Añada 30 mL 1 x PBS a tubo cónico para diluir la solución al 1% PFA para el almacenamiento a 4 ° C.
    Nota: Use un tubo cónico separado para cada cráneo y el cerebro posterior fijación. No incubar el cerebro en el 1% PFA por más de 2 semanas, o fluorescencia comenzará a desvanecerse.
  5. Lugar del cerebro y del cráneo sobre una superficie plana con single ply de toallitas de trabajo impregnados de 1 x PBS. Utilice un par de pinzas (ver lista de materiales) para eliminar cualquier resto piel o membrana que rodea el cráneo.
  6. Con unas pinzas, quite primero el hueso occipital, luego retire con cuidado los huesos parietales, mover la pinza hacia afuera y lejos de la superficie del cerebro. Retire con cuidado cualquier meninges para evitar daños en la corteza.
  7. Cuña de la parte posterior de la pinza en el cerebro a lo largo del cráneo para cortar cualquier nervios craneales y quitar el cerebro.
  8. Para el joven cerebro postnatal de (P0-P13)
    1. Tomar 25 mL de agar al 4% por calentamiento de 25 mL 1 x PBS a 80 ° C. Remover y disolver el agar 1 g con una barra de vidrio varilla o agitación).
    2. Solución enfriar a 35 ° C sin dejar de revolver. Colocar el cerebro en un recipiente pequeño (por ejemplo, la tapa de un tubo cónico de 50 mL) y vierta la solución de agar sobre cerebro. Permiten agar a endurecerse.
  9. Hacer un corte coronal manualmente utilizando una cuchilla de un solo eje a través del cerebro, aproximadamente 0,5 mm de rostral a bregma. Hacer otro corte coronal a través del cerebro aproximadamente 0,5 mm caudal a corteza visual. Colocar una piscina de pegamento de cianocrilato con el mismo diámetro que el extremo rostral del cerebro en el centro del disco de muestra vibrante de micrótomo. Coloque el extremo rostral del cerebro en la parte superior la piscina de la cola, asegurando que toda la superficie rostral del tejido está enlazada al disco muestra con pegamento.
  10. Montaje bandeja de búfer en vibrante micrótomo y asegúrelo con palanca de sujeción incorporada. Inserte la cuchilla en el soporte de cuchilla y Monte portacuchillos en vibrante micrótomo con tornillo de sujeción incorporado. Asegure el disco muestra con cerebro encima de la bandeja del buffer usando el dispositivo de sujeción integrado. Ajuste de velocidad a 5.70 (= 0.285 mm/s) y ajuste de la frecuencia a 5.33 (53,3 Hz).
  11. Llenar la cámara por encima del nivel del cerebro con PBS 1 x y bajar la cuchilla en el PBS. Empezar a tomar secciones coronales de 100 μm a través del tejido.
  12. Si no requieren transformación posterior, tal como 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción nuclear o inmunohistoquímica.
    1. Utilizar un pincel de punta fino para transferir las secciones directamente desde el microtomo vibratorio en un portaobjetos de microscopio, montaje de 4 a 6 secciones en cada diapositiva.
    2. Permiten que las secciones secar por absorción ausente solución con un pincel de punta fino, tal que las rebanadas de cerebro ya no deriva de las diapositivas.
    3. Luego, coloque una gota de mountant (véase lista de materiales) en cada sección de la diapositiva.
    4. Suavemente Coloque un cubreobjetos de 24 x 50 mm en la parte superior, no asegurando que 1) burbujas de aire se forman en las secciones, 2) las secciones no se mueven, y 3) el mountant cubre totalmente el área entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Permiten la mountant curar durante al menos 24-48 h.
  13. Para teñir los núcleos con DAPI para la examinación histológica de las láminas corticales
    1. Utilizar un pincel de punta fino para transferir cada sección en una solución que contiene 10 μg/mL DAPI (véase lista de materiales) diluido en PBS 1 x de solución (20 mg/mL DAPI en agua).
    2. Incubar en la solución DAPI por 5 min a temperatura ambiente, luego use un pincel de punta fino para transferir la sección de solución DAPI a 1 x PBS e incubar en PBS 1 x durante 5 minutos a temperatura ambiente. Traslado a sección dos veces más al fresco 1 x PBS durante 5 minutos. Luego, utilizando un pincel de punta fino, transferencia de la sección sobre un portaobjetos de microscopio, siga pasos 5.11.2-5.11.4 y continúe con el paso 5.13.
  14. Calentar un plato de Petri de vidrio que contiene Valap (partes iguales vaselina, lanolina y parafina) en un plato caliente en un ajuste de calor bajo hasta que derrita completamente. Sello los bordes de diapositivas expuestos por cepillado de Valap fundido.
  15. Para inspeccionar la fluorescencia en el tejido, usar un microscopio óptico o microscopio confocal (véase lista de materiales) y un filtro adecuado para ver el fluoróforo (e.g. DAPI: excitación 325-375 nm, emisión 435-485 nm; GFP: excitación de 450-490 nm, emisión a 500-550 nm)17. Se pueden tomar imágenes confocales con bajo (4 X, apertura numérica, NA = 0.20), medio-(20 X, NA = 0.75) y alta potencia (60 X, NA = 1.40) objetivos.

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Resultados

La sola construcción GFP. CRE (véase lista de materiales) fue electroporated en E15.5 y visualizados en P14. Dependiendo de la concentración de la construcción y el volumen de la inyección, puede obtenerse un resultado escaso o densa22,26. Por ejemplo, la inyección de 1 μl de 2 mg/mL GFP. Resultados CRE en una escasa distribución de las células marcadas, algunas de las cuales pueden ser brillante (fig...

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Discusión

Aquí, presentamos la combinación de la electroporación en el útero con recombinase de Cre en los ratones de floxed para generar el tejido del cerebro de mosaico. Una ventaja de este enfoque es que una nueva línea de mouse no es necesario que se generan cada vez un diferente subtipo celular debe orientarse: electroporación en el útero puede utilizarse para apuntar neuronas excitatorias, las neuronas inhibitorias o glia dependiendo de la época y la ubicación de electroporación1...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo generoso de la James Madison University Departamento de biología y la James Madison University microscopía de luz y centro de la proyección de imagen. Dr. Mark L. Gabriele para consejos útiles con respecto a la preparación de jóvenes tejido postnatal, y DRS. Justin W. Brown y Corey L. Cleland generoso coordinación de espacio y materiales quirúrgicos. Esta investigación fue financiada en parte por una beca de investigación colaborativa 4-VA, una colaboración para el avance de la Commonwealth de Virginia (G.S.V.) y por Virginia Academia de ciencia pequeño proyecto de investigación becado (G.S.V.). Se ha generosamente apoyado por una dotación de Betty Jo Butler amoroso 58 para la beca de investigación de pregrado (a K.M.B.), una beca de investigación de verano de Farrell (para K.M.B.), James Madison University segundo siglo becado (a K.M.B.), un James Beca centenario de la Universidad de Madison (a C.J.H.), una Universidad James Madison búsqueda 30 Lucy Robinson Memorial Scholarship (para Z.L.H.) y una Universidad de James Madison de la ciencia y las matemáticas Facultad ayuda subsidio (G.S.V.).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6J miceThe Jackson Laboratory#000664See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vectorAddGene#20781See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent gradeSigmaT6146-5GSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kgVWRBDH9286-2.5KGSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 gVWR#97061-566See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichS0876-100GSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichP5379-100GSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mLFisher ScientificA144-500See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette PullerSutter InstrumentP-97See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filamentSutter InstrumentFT330BSee "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5"PhenixLW-8148See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 TeethWorld Precision Instruments#14140See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-packWorld Precision Instruments#503708-12See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-packWorld Precision Instruments#503728-12See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-plyMedrepexpress#2204-cSee "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm IDWorld Precision Instruments#503203See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EASee "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHASee "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mmBTX#45-0489See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot PedalBTX#45-0211See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 GeneratorBTX#45-0052See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction BoxHarvard Apparatus#72-6468See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointmentHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS)VWR#95059-640See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive FormulaVeet#062200809951See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)Phenix Research ProductsTSP-10LKITSee "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettesSigma-AldrichA5177See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue AdhesiveMedrepexpressVG3See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mLSigma-AldrichZ551546-100EASee "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.Sigma-AldrichZ192392-100EASee "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting MaterialAncareNES3600See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, SterileBio-ServS5137See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97%Alfa AesarA11313See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tipsWorld Precision Instruments#501976See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powderAlfa Aesar#10752See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 bladeStanley Tools#11-515See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mmLeica#14046327404See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assemblyLeica#1404630132See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor BladesPersonnaBP9020See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder SLeica#14046230131See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush SetAmazonB0089KU6XESee "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus SlidesElectron Microscopy Services#71869-11See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 mlThermofisherP36970See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1Phenix Research ProductsMS1415-10See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma-AldrichD9542See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright MicroscopeOlympusBX51WISee "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal MicroscopeNikonTE2000/C2siSee "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20NikonCFI Plan Apo Lambda 4XSee "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75NikonCFI Plan Apo Lambda 20XSee "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40NikonCFI Plan Apo VC 60X OilSee "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")

Referencias

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