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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Abstract

Cella-autonome funzioni neuronali dei geni possono essere rivelate causando perdita o guadagno di funzione di un gene in una popolazione di piccola e sparsa di neuroni. Per effettuare questa operazione richiede la generazione di un mosaico in cui i neuroni con perdita o guadagno di funzione di un gene sono circondati da tessuto geneticamente imperturbato. Qui, uniamo il sistema di ricombinazione di Cre-lox con elettroporazione nell'utero al fine di generare tessuto cerebrale mosaico che può essere utilizzato per studiare la funzione delle cellule-autonoma dei geni nei neuroni. Costrutti del DNA (disponibili nei repository), che codifica per un'etichetta fluorescente e la Cre ricombinasi, vengono introdotti nello sviluppo di neuroni corticali contenenti geni affiancati con siti loxP nei cervelli degli embrioni del mouse utilizzando in utero elettroporazione. Inoltre, descriviamo vari adattamenti per il metodo di elettroporazione nell'utero che aumentano la sopravvivenza e la riproducibilità. Questo metodo coinvolge anche stabilire un titolo per ricombinazione Cre-mediata in una rada o densa popolazione di neuroni. Preparati istologici del tessuto cerebrale con etichetta non richiedono (ma può essere adattati a) immunohistochemistry. I costrutti utilizzati garantiscono che fluorescente etichettati neuroni trasportare il gene per la ricombinasi Cre. Preparati istologici consentono analisi morfologica dei neuroni confocale imaging delle pergole dentritici ed axonal e spine dendritiche. Perché perdita o guadagno di funzione è realizzato in tessuto di tipo sparse mosaico, questo metodo consente lo studio delle necessità delle cellule autonome e la sufficienza della gene prodotti in vivo.

Introduzione

Generando un mosaico genetico è un classico paradigma sperimentale per comprendere la funzione di un gene di interesse. Per determinare se un gene è necessario per un fenotipo cellulare, l'approccio più semplice è causando una perdita di funzione del gene in tutto l'organismo (ad es. ad eliminazione diretta). Tuttavia, per determinare se un gene è necessaria in particolare in un determinato tipo di cellula, knockout del gene in tutto l'organismo non è un approccio valido. Al contrario, è necessario un metodo che causerà la perdita di funzione di un gene in una determinata cella mentre è circondato da tessuto wildtype (cioè geneticamente imperturbata) — in altre parole, creare mosaico tessuto. Se la cellula mutante Mostra un fenotipo mutante, ma non di cellule wildtype circostanti, le funzioni del gene in maniera autonoma delle cellule. L'analisi del tessuto del mosaico, in cui le cellule mutanti sono circondate da tessuto wildtype, è ideale per la comprensione delle cellule autonome funzioni dei geni, in particolare nel cervello dove i neuroni e cellule gliali formano una vasta rete interconnessa di tessuto.

Diverse forme di tessuto cerebrale mosaico hanno fornito modelli potenti per indagare le funzioni delle cellule-autonoma di geni. Studi incentrati su trapianto neuronale1, mosaicismo femminile legato al X2,3,4, ed endogeno mosaicism somatico5,6 hanno attirato loro conclusioni basate su mosaico tessuto cerebrale. Eliminazione condizionale di un gene attraverso il sistema di ricombinazione di Cre-lox è un metodo che sfrutta al meglio la grande disponibilità di linee di topi transgenici. In questo metodo, vengono introdotti due siti loxP su entrambi i lati di una necessaria sequenza di un gene (ad esempio di un esone), lasciandola affiancato da siti loxP che entrambi si affacciano nella stessa direzione ("floxed"). Cre ricombinasi accise la sequenza tra i siti loxP7. Ricombinazione cre-mediata può essere ottenuta da incrocio floxed topi a un'altra linea di mouse che esprimono Cre ricombinasi insieme con un marcatore fluorescente in un sottogruppo di cellule ("Cre reporter linea"). Questo è stato dimostrato in una varietà di modi per scoprire le funzioni di un gene in sottoinsiemi di cellule, quali i neuroni eccitatori o astrociti8. Linee di cre reporter possono esprimere CreERT2 per consentire la ricombinazione Cre-mediata di essere farmaco-inducibile (singoli neuroni etichettatura con knockout inducibile Cre-mediata, o SLICK)9. Un'altra strategia chiamato analisi di mosaico con doppio marker (MADM)10,11, ricombinazione di interchromosomal Cre-mediata consente un omozigote mutante deve essere creato a fianco del tessuto eterozigotico. In questi approcci, una nuova linea di topi deve essere prodotta ogni volta per ogni gene candidato o sottotipo cellulare che viene testato. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere introdotto dopo la nascita tramite ionoforesi12 o tramite vettori virali (ad es. virus adeno-associato13 o lentivirus14 trasporto cellulari sottotipo-specifici promotori). Questa strategia crea etichettatura forte e postnatale. Per indirizzare lo sviluppo di neuroni corticali cerebrali scarsamente e prenatally, una strategia ideale è nell'utero elettroporazione di Cre ricombinasi con un marcatore fluorescente.

Oltre alla ricombinazione di Cre-lox attraverso elettroporazione nell'utero per produrre la combinazione del mosaico del tessuto in vivo, vi presentiamo diversi adattamenti alle procedure da altri protocolli pubblicati15,16, 17,18,19,20,21. Forniamo informazioni per migliorare il successo nel tempo-incinta femmine riproduttrici. Descriviamo anche i nostri due strategie per introdurre l'etichettatura dei neuroni nel tessuto corticale sparse e brillante: una strategia consiste nel titolo i livelli di un singolo costrutto che codifica per la Cre ricombinasi e un marcatore fluorescente22. Un'altra strategia consiste nell'utilizzare il sistema di "Supernova", progettato specificamente per questi parametri in mente23,24. Inoltre, offriamo miglioramenti sulla produzione coerente microiniezione pipette e semplificazioni per la chirurgia di elettroporazione nell'utero . Infine, abbiamo delineare fasi critiche in una preparazione istologica semplificata che consente l'analisi delle spine dendritiche e pergole dentritici ed axonal, senza ulteriore colorazione o immunohistochemistry.

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Protocollo

Metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) di James Madison University e sono in accordo e in conformità con tutte le pertinenti orientamenti normativi e istituzionali.

1. Mouse set-up

  1. Un giovane della casa (> P60) maschio e femmina omozigote floxed mouse insieme per impostare un allevatore coppia25.
    Nota: Un buon controllo negativo è quello di impostare un paio di ulteriori allevatore di topi selvatici, in quale Cre espressione ricombinasi non causerà un mosaico26.
  2. Consentire la donna a partorire e aumentare la sua prima cucciolata con l'uomo. Tenere il maschio con la femmina per aumentare la sopravvivenza di lettiera. Dopo lo svezzamento la lettiera, per esempio al giorno postnatale (P) 21, separa il maschio e la femmina.
  3. Allevamento di murino
    1. Impostare un tempo accoppiamento tra il maschile e femminile25. Utilizzare segnali visivi per determinare il ciclo di estro della femmina27e controllare per spine vaginali la mattina dopo l'accoppiamento25.
    2. Se viene trovata una spina, separare e pesare la femmina. Contare il giorno come giorno embrionale (E) 0,5.
    3. Continuare a pesare la femmina ogni 3-5 giorni per determinare se è incinta. Le femmine gravide avranno un aumento di 10-20% del peso corporeo 7-10 giorni dopo il concepimento (E0).
      Nota: Questo passaggio conferma la gravidanza prima e in modo più affidabile rispetto a controllo visivo25.
    4. Se la donna non è incinta, ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.3.
  4. Una volta confermata la gravidanza, scegli la data dell'elettroporazione nell'utero . Per impostare come destinazione progenitori neuronali piramidali corticali di strato II/III, eseguire elettroporazione presso E15.5.

2. set-up DNA

  1. Scegliere un singolo DNA costruire quello codici per Cre ricombinasi, nonché un marcatore fluorescente, come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP)28,29. In alternativa, utilizzare il sistema di "Supernova", descritto in dettaglio nel precedente Pubblicazioni23,24. Vedere elenco dei materiali ad esempio costrutti.
  2. Amplificare il DNA construct(s) dal punto 2.1 in e. coli usando tecniche microbiologiche standard30.
  3. Purificare il costrutto di DNA con un kit di purificazione del plasmide privo di endotossina seguendo le istruzioni del produttore. Eluire il costrutto con acqua priva di endotossina.
    Nota: La scelta di un kit di purificazione dell'endotossina-libero sopra un kit di purificazione standard è fondamentale.
  4. Concentrare l'eluato di DNA per 1-3 mg/mL a seconda del desiderato d'etichettatura densità26.
    Nota: Un titolo deve sempre essere stabilito quando si lavora con un nuovo costrutto di DNA, dato che hanno diverse lunghezze e promotori. Prendere in considerazione l'iniezione di un costrutto a diverse concentrazioni differenti e/o importi per valutare l'espressione. Ad esempio, l'iniezione di 1 µ l o 1,5 µ l di 2,0 mg/mL GFP. Cre è in grado di causare Radi (1 µ l) o denso (1,5 µ l) etichettatura dello strato II/III visiva corticale neuroni piramidali26.
  5. Aggiungere 0,4% trypan blu in 1x tamponato fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 in H2O, regolata a pH 7.4 con HCl) 01:10 alla soluzione concentrata del DNA.
  6. Aggiungere 10 x PBS 01:10 la soluzione concentrata di DNA.
  7. Conservare la soluzione di DNA concentrata a 4 ° C. La soluzione può essere conservata a tempo indeterminato.

3. Dispensare set-up

  1. Utilizzando un estrattore capillare di vetro, tirare una pipetta con una lunga punta conica e molto fine (10-15 mm), tipica delle pipette per iniezione di cellule staminali embrionali o trasferimento nucleare31.
    Nota: Per impedire la contaminazione le pipette di detriti, essi devono essere effettuate entro 2 giorni dell'ambulatorio.
    1. Calibrare l'estrattore capillare di vetro eseguendo un test di rampa, seguendo le istruzioni del produttore. Uso il risultante valore di calore per programmare un tirando protocollo utilizzando i seguenti parametri: calore = (valore di prova di rampa + 15), tirare = 30, vel = 120, tempo = 100, pressione = 200. Inserire il capillare di vetro, fissare ai morsetti su estrattore e attivare il protocollo trazione programmato, creando un cono il capillare di vetro.
    2. Assicurarsi che la lunghezza del conica è tra 10-15 mm utilizzando un microscopio ottico composto (per esempio 10 obiettivo X)31.
  2. Indietro rompere la pipetta per formare una punta quadra grezzo a 20-25 µm di diametro.
    1. Centrare un wipe monostrato attività (Vedi elenco dei materiali) oltre un 50 mL Becher e tratto pulire tesi con una mano. Con l'altra mano, afferrare e spingere una pipetta (cono rivolto verso il basso) perpendicolarmente e completamente attraverso il centro della transizione, causando una rottura pulita nel cono31.
      Nota: Spingendo la pipetta completamente attraverso la cancellazione produrrà una punta di diametro di 20-25 µm circa il 70% del tempo.
    2. Confermare al microscopio ottico composto (ad es. obiettivo 20x).
      Attenzione: Indossare occhiali di protezione durante la rottura del vetro.
  3. Calibrare una pipetta da aspirante 1 µ l di 0,4% trypan blu in 1X PBS in un piptte parzialmente riempita, quindi la pipetta con le marcature di 1 µ l di laurea base all'altezza di 1 µ l nella pipetta, usando un pennarello resistente all'alcool punta fine. Utilizzare la pipetta calibrata per laurearsi le pipette di altre prima di eliminarli. Tenere pipette in un supporto di pipetta esente da polvere e altre particelle.

4. nell'Utero elettroporazione

  1. Posto Graefe forcipe, forbici iris, Hartman pinza mosquito, spugne garza di tessuto non tessuto, con punta anello forcipe e capsule di Petri su un vassoio in acciaio inox e avvolgere con carta stagnola. Posizionare il vassoio e 1 L 0,9% soluzione fisiologica (0,9% wt/vol NaCl in acqua) in autoclave. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C e 3,5 kPa per 40 min. rimuovere dall'autoclave e collocare in un'area chirurgica disinfettata.
    Nota: È fondamentale per mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico.
  2. Riscaldare la bottiglia di Salina 1 L in autoclave in un bagno piccolo acqua a 38 ° C per almeno 2 h prima della chirurgia.
  3. Collegare gli elettrodi di tipo pinzette e il pedale al generatore (vedere elenco dei materiali). Seguendo le istruzioni del produttore, impostare il generatore per consegnare cinque 50 ms impulsi di 50 V (con un intervallo di 950 ms) quando attivato mediante il pedale. Disinfettare la pinzetta-tipo di elettrodi e posto sulla zona chirurgica disinfettata.
  4. Fare un cono di naso di anestesia come precedentemente pubblicati32, ma utilizzare l'estremità di un nitrile o dito del guanto di lattice per formare un diaframma che si adatta saldamente sopra l'apertura del cono di naso. Tagliare un buco nel diaframma abbastanza grande per adattarsi sopra il muso del mouse.
  5. Profondamente anestetizzare incinto topi ad E15.5 in una camera di induzione riempita con isoflurano (2-4%) in ossigeno puro che fluisce ad 1 L/min. Dopo ~ 1 min, prova il riflesso di raddrizzamento (delicatamente la camera di induzione di inclinazione e assicurarsi che il mouse non giusto per sé). Pesare il mouse per determinare i dosaggi di analgesia amministrato più successivamente durante l'intervento chirurgico.
  6. Trasferire il mouse l'area chirurgica e amministrare inalato isoflurano (1-2%) in ossigeno puro che fluisce ad 1 L/min attraverso un cono di naso per mantenere il mouse in aereo chirurgica. Utilizzare pinze per testare il riflesso pedale (pizzicare delicatamente la zampa e assicurarsi che il mouse non viene restituito un riflesso) per verificare amputate. Monitorare la frequenza respiratoria e sforzo, cercando di regolare respirazione profonda (~ 70-100 respiri/min), e che le mucose sono colore rosa e umida.
  7. Applicare abbastanza veterinario unguento oftalmico sopra gli occhi per coprirle completamente per protezione contro l'essiccazione durante la procedura.
  8. Flex il disco di metallo attivatore di un sacchetto sigillato pieno di sovrasatura soluzione salina (vedere elenco dei materiali), attivando una cristallizzazione esotermica del sale. Porre 2 salviettine imbevute di attività monostrato in cima il sacchetto e posizionare il mouse sulla busta per mantenere la temperatura corporea.
  9. Massaggiare la crema depilatoria sulla zona addominale con tamponi di cotone fino a pelliccia addominale si dissolve (circa 20-40 s), quindi togliere pelliccia addominale. Pulire accuratamente fuori qualsiasi crema restante residuo e depilatoria con tamponi di cotone e di etanolo 70%. Posizionare un telo chirurgico sterile fenestrato sull'area addominale.
  10. Utilizzando una tecnica asettica, tirare la pelle in alto e lontano dal addome con il forcipe di Graefe e fare un'incisione ventrale del midline ~ 2 cm sulla pelle utilizzando forbici iris, assicurando che il muscolo sottostante non sia tagliato.
    Nota: Un'alternativa accettabile per fare un'incisione con le forbici pinze e iris Graefe consiste nell'utilizzare un bisturi, come precedentemente pubblicato17.
  11. Trovare la linea alba, per visualizzare la linea mediana del rectus abdominis. Sollevare il muscolo ed dall'addome con il forcipe di Graefe e fare un'altra incisione del midline di ~ 2 cm ci con forbici iris, esponendo la cavità addominale (l'utero è traslucido ed embrioni sarà visibili sotto). Assicurarsi che non sia tagliata alla base del tessuto uterino e intestinale. Effettuare l'incisione solo abbastanza grande (in genere ~ 2 cm) per tirare fuori ed esporre l'utero comodamente.
    Nota: Un'alternativa accettabile per fare un'incisione con le forbici pinze e iris Graefe consiste nell'utilizzare un bisturi, come precedentemente pubblicato17.
  12. Utilizzando una punta sterile di 10 µ l della micropipetta, dispensare carprofen (disciolto in soluzione fisiologica 0,9% sterile) a 4 mg/kg nella cavità addominale per analgesia.
  13. Bloccare una pinza mosquito di Hartman sul bordo sinistro dell'incisione di abdominis del rectus. Riposare il forcipe su rovesciata di Petri a sinistra dell'incisione, tenendo la sinistra dell'incisione aperta. Bloccare un'altra pinza mosquito di Hartman sul bordo destro dell'incisione di abdominis del rectus e riposare il forcipe su una rovesciata di Petri a destra dell'incisione, tenendo il lato destro dell'incisione aperta. Posizionare garze spugna intorno alla zona dell'incisione.
  14. Mezzo anello forcipe (senza una vite di finecorsa allegata), tirare l'utero tra qualsiasi due embrioni vicini senza schiacciare o ferire qualsiasi tessuto. Inizia tirando fuori tutti gli embrioni attraverso l'incisione, appoggiandole sopra la garza spugna. Quando si tira fuori l'ultimi embrioni dalla cavità addominale, assicurarsi di non tirare le ovaie o la cervice. Una volta esposto, è fondamentale per mantenere l'utero umido con soluzione salina calda. L'utero contiene in genere tra 5 e 8 embrioni.
    Nota: È possibile aggiungere penicillina e streptomicina al Salina17.
  15. Collegare una pipetta calibrata per l'Assemblea di tubo aspiratore (vedere elenco dei materiali) e iniettare esattamente 1 µ l della soluzione di DNA preparata nel passaggio 2 tramite la parete uterina in un ventricolo laterale di ciascun embrione. Ventricoli laterali appaiono come due patch il telencefalo dorsale dell'embrione (le patch sono più scure del tessuto del telencefalo circostante). È possibile utilizzare il pollice e l'indice durante la microiniezione ed elettroporazione per manipolare gli embrioni, rivelando i ventricoli laterali e permettendo gli embrioni essere spinto delicatamente contro la parete uterina durante l'iniezione. Confermare successo iniezione osservando trypan blu di riempimento del ventricolo laterale.
  16. Posizionare il catodo di pinzette-tipo di elettrodi (Vedi elenco dei materiali) sull'utero, direttamente sopra la corteccia mediale e caudale per indirizzare la corteccia visiva (targeting aree alternative del cervello richiederà posizionamento elettrodo diverso)16, 26. Posto l'anodo sull'utero, appena inferiore e anteriore testa dell'embrione.
  17. Confermare che l'anodo e il catodo stanno toccando l'utero che circonda l'embrione in posizioni appropriate. Con un pedale del piede, innescare la consegna di cinque 50 ms impulsi di 50 V (con un intervallo di 950 ms) attraverso gli elettrodi.
    Nota: Iniettata, caricati negativamente DNA si sposterà verso il catodo e sarà incorporato nella zona ventricolare cellule più vicina al catodo.
  18. Restituire l'utero alla cavità addominale nello stesso orientamento che è stato trovato. Utilizzare soluzione salina per lubrificare l'utero mentre guidandolo manualmente e molto delicatamente, facendo attenzione a non per spostare gli embrioni dalla loro posizione nell'utero.
  19. Chiudere i muscoli addominali con suture assorbibili (vedere elenco dei materiali) usando un semplice punto interrotto, legando le estremità con un nodo del chirurgo. Non non clip che le estremità troppo vicino al nodo o il nodo diventerà slacciato.
    Nota: È fondamentale alla sutura dei muscoli addominali tale che i bordi della ferita sono completamente chiuso chiuso, ma senza causare scottatura del muscolo. Nodi devono essere stretti quindi non possono essere slacciate.
  20. Chiudere lo strato della pelle con suture assorbibili (punto di interruzione semplice, nodo del chirurgo, come descritto al punto 4.19). Applicare una piccola quantità di tessuto adesivo per sigillare la ferita. Applicare l'adesivo del tessuto sui nodi per prevenire slacciare. Utilizzare una micropipetta per rimuovere qualsiasi adesivo del tessuto che circonda la ferita che può essere aspirata dalla micropipetta.
  21. Abbassare i livelli di isoflurano a 0,5-1,5%. Una volta che l'adesivo del tessuto è a secco (prova toccando guanto ad adesivo), rimuovere da isoflurane e consentire femmina a recuperare da soli in una gabbia calda. Amministrare la buprenorfina per via intraperitoneale a 0,03 mg/kg con una siringa da 1 mL con un 26G, ½" dell'ago.
  22. Continuare a monitorare il mouse fino a quando il mouse è completamente recuperato e comportarsi normalmente (cioè governare, esplorare la gabbia, mangiare o bere). Una volta recuperato, posto femminile torna in gabbia con il maschio.
    Nota: Se tutti i passaggi sono seguiti, il mouse in genere riprendere coscienza entro 2 min e immediatamente iniziare a muoversi per la gabbia, non mostra segni di disagio.
  23. Se il mouse presenta segni di disagio (ad es. curvato postura, le secrezioni della porfirina)33, amministrare carprofen a 0,1 mg/mL nel rifornimento idrico. Se sono presenti diversi segni di disagio, o se il malessere persiste per più di 4 h malgrado la gestione di carprofen, immediatamente eutanasia il mouse con la somministrazione di un'iniezione letale intraperitoneale di ketamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg)- cocktail di acepromazina (1,85 mg/kg) utilizzando una siringa da 1 mL con un 26 G, ½" ago e seguire con una forma secondaria approvata di eutanasia33.
  24. Per aumentare la sopravvivenza degli embrioni individulamente dopo la nascita, è necessario tenere la gabbia in una zona tranquilla che tiene ambiente privo di rumori e vibrazioni. Arricchire l'ambiente con igloo plastica, materiali di nidificazione e integratori alimentari come semi di girasole (Vedi elenco dei materiali). Non spostare o disturbare la gabbia, specialmente durante i primi 3 giorni dopo il parto.

5. istologico preparazione per microscopia a fluorescenza

Nota: Questo protocollo di istologia è ottimizzato per la preparazione del tessuto da animali oltre giorno postnatale (P) 13 anni di età che erano individulamente in utero. Per preparare il tessuto da più giovani animali postnatali (P0-P13), si consiglia di seguire tutti i passaggi (tra cui perfusione perfusione), anche se il cervello deve essere incorporato nell'agar prima di preparare sezioni (passo 5,9). Tessuto può anche essere preparato dagli embrioni entro 1-2 giorni dopo l'elettroporazione, utilizzando i metodi descritti precedentemente18,20.

  1. Preparare la soluzione di paraformaldeide (PFA).
    Nota: È fondamentale per preparare fresco PFA, entro un giorno dell'esperimento.
    Attenzione: Paraformaldeide è tossico e deve essere gestito in una cappa aspirante con opportuni dispositivi di protezione personali.
    1. Per fare 50 mL di 4% PFA, 40 mL di acqua di calore a 60 ° C. Aggiungere 2 g PFA continuando a mescolare con barra di vetro asta o agitazione. Aggiungere 10 µ l di NaOH 10 M ogni 2 min fino a PFA si scioglie.
    2. Aggiungere 5 mL di PBS 1x 10 e portare la soluzione ad un volume finale di 50 mL con acqua.
    3. Dopo aver portato soluzione a 50 mL, regolare il pH a 7,4 come necessario con una soluzione di HCl. Consenti di 10 M per raffreddare e conservare a 4 ° C.
  2. Eutanasia del mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg) - con una siringa da 1 mL con un 26G, ½" ago acepromazina (1,85 mg/kg) cocktail. Via irrorare 10 o 20 mL ghiacciata 1X PBS, seguita da 25 o 40 mL preparati, ghiacciata 4% PFA17. Utilizzare volumi inferiori per giovani postnatale (P0-P13) topi e maggiori volumi per più vecchi topi (P14 e sopra).
  3. Immediatamente dopo l'aspersione, decapita la carcassa del mouse fra l'osso occipitale e la vertebra C1 con grandi forbici e staccarsi e scartare la maggior parte della pelle che circonda il cranio utilizzando forbici iris, particolarmente della pelle occipitale, parietale e frontale circostante ossa. Mantenere intatto il cranio e il cervello.
  4. Posizionare il cranio e il cervello in 10 mL 4% PFA in una provetta conica da 50 mL per 24 h a 4 ° C per post-Difficoltà tessuto. Quindi aggiungere 30 mL di PBS 1x tubo conico per diluire la soluzione all'1% PFA per conservazione a 4 ° C.
    Nota: Utilizzare un tubo conico separato per ogni cranio e il cervello post-fissato. Non Incubare il cervello in 1% PFA per più di 2 settimane, o fluorescenza inizierà a svanire.
  5. Posto il cervello e cranio su una superficie piana con salviette attività inumiditi con 1x PBS monostrato. Utilizzare un paio di pinzette (vedere elenco dei materiali) per rimuovere qualsiasi residuo della pelle o membrana che circonda il cranio.
  6. Con una pinzetta, prima rimuovere l'osso occipitale, quindi rimuovere con cautela le ossa parietali, spostando le pinzette fuori e lontano dalla superficie del cervello. Rimuovere con cautela le meningi per evitare danni alla corteccia.
  7. Sul retro delle pinzette a cuneo sotto il cervello lungo il cranio di recidere ogni nervi cranici e rimuovere il cervello.
  8. Per giovani postnatale (P0-P13) cervelli
    1. Fare 25 mL di agar di 4% di riscaldamento 25 mL di PBS 1X a 80 ° C. Mescolare e sciogliere 1 g di agar con una barra di vetro asta o agitazione).
    2. Soluzione fredda a 35 ° C, pur continuando a mescolare. Mettere il cervello in un piccolo contenitore (ad esempio il tappo di una provetta conica da 50 mL) e versare la soluzione di agar sul cervello. Consentire l'agar indurire.
  9. Fare un taglio corona manualmente utilizzando una lama di rasoio tagliente attraverso il cervello, circa 0,5 mm rostrale di bregma. Fare un altro taglio corona attraverso il cervello circa 0,5 mm caudale alla corteccia visiva. Posizionare un pool di colla del cianoacrilato con lo stesso diametro estremità rostrale del cervello sul centro del disco di preparato microtomo vibrante. Posizionare l'estremità rostrale del cervello sopra la piscina di colla, assicurando che l'intera superficie rostrale del tessuto è associata al disco di preparato con colla.
  10. Montare il tampone sul microtomo a vibrazione e fissarlo con leva di bloccaggio incorporato. Inserire la lama nel portalama e montare portalama sul microtomo con vite di bloccaggio incorporato di vibrazione. Fissare il disco di preparato con il cervello sul tampone utilizzando il dispositivo di bloccaggio incorporato. Impostazione della velocità impostata a 5.70 (= 0.285 mm/s) e impostazione della frequenza di 5,33 (53,3 Hz).
  11. Riempire la camera sopra il livello del cervello con PBS 1X e abbassare la lama in PBS. Cominciare a prendere 100 µm sezioni coronali attraverso il tessuto.
  12. Se non che richiedono un'ulteriore elaborazione, ad esempio 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) macchiatura nucleare o immunohistochemistry.
    1. Utilizzare un pennello punta fine per trasferire sezioni direttamente dal microtomo vibra su un vetrino da microscopio, raccordo 4-6 sezioni in ogni diapositiva.
    2. Consentire le sezioni asciugare wicking lontano soluzione con un pennello punta fine, tale che le fette di cervello non deriva non più sulle diapositive.
    3. Quindi, mettere una goccia di liquido di montaggio (vedere elenco dei materiali) su ogni sezione della diapositiva.
    4. Delicatamente adagiarvi un vetrino coprioggetto 24 x 50 mm, non assicurando che 1) bolle d'aria forma sulle sezioni, 2) le sezioni non si muovono, e 3) il montante completamente copre l'area tra la diapositiva e il vetrino coprioggetti. Consentire il montante curare per almeno 24-48 h.
  13. A macchiare i nuclei con DAPI per esame istologico delle lamine corticali
    1. Utilizzare un pennello punta fine per trasferire ogni sezione in una soluzione contenente 10 µ g/mL DAPI (vedere elenco dei materiali) diluito in PBS 1x da soluzione madre (20 mg/mL DAPI in acqua).
    2. Incubare in soluzione DAPI per 5 min a temperatura ambiente, quindi utilizzare un pennello punta fine per trasferimento sezione da soluzione DAPI a 1X PBS e incubare in PBS 1X per 5 min a temperatura ambiente. Trasferimento sezione due volte più di PBS 1X fresco per 5 minuti ciascuno. Quindi, utilizzando un pennello punta fine, trasferimento la sezione su un vetrino da microscopio, seguire i passi 5.11.2-5.11.4 e procedere con il passaggio 5.13.
  14. Scaldare una piastra Petri vetro contenente Valap (parti uguali vaselina, lanolina e paraffina) su un piatto caldo a un calore moderato fino a quando completamente sciolto. Guarnizione esposti bordi di diapositive spazzolando il fuso Valap.
  15. Per ispezionare la fluorescenza nel tessuto, utilizzare un microscopio ottico o microscopio confocale (vedere elenco dei materiali) e un set di filtri adeguati per la visualizzazione il fluoroforo (ad es. DAPI: eccitazione 325-375 nm, emissione 435-485 nm; GFP: eccitazione 450-490 nm, emissione 500-550 nm)17. Immagini confocal possono essere preso con basso - (4 X, apertura numerica, NA = 0.20), medium-(20 X, NA = 0,75) e ad alta potenza (60 X, NA = 1.40) obiettivi.

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Risultati

Il singolo costrutto GFP. CRE (vedere elenco dei materiali) era individulamente presso E15.5 e visualizzati a P14. A seconda della concentrazione del costrutto e il volume di iniezione, un risultato rado o denso può essere ottenuto22,26. Ad esempio, l'iniezione di 1 µ l di 2 mg/mL GFP. Cre risultati in una distribuzione sparsa delle cellule con etichettate, alcuni dei quali possono essere luminoso (Figura 1A...

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Discussione

Qui, presentiamo la combinazione dell'elettroporazione in utero con Cre ricombinasi nei topi floxed per generare tessuto cerebrale mosaico. Un vantaggio di questo approccio è che una nuova linea di mouse non ha bisogno di essere generata ogni volta un diverso sottotipo cellulare deve essere mirata: elettroporazione in utero può essere utilizzato per indirizzare i neuroni eccitatori, neuroni inibitori o glia a seconda del periodo e la posizione di elettroporazione15,<...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il generoso sostegno della James Madison University Dipartimento di biologia e la microscopia luce James Madison University e Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele per consigli utili per quanto riguarda la preparazione di tessuti postnatale giovane, e d. ssa Justin W. Brown e Corey L. Cleland per generoso coordinamento dei materiali chirurgici e spazio. Questa ricerca è stata finanziata in parte da una sovvenzione di ricerca collaborativa da 4-VA, una partnership di collaborazione per far progredire il Commonwealth della Virginia (G.S.V.) e da un Virginia Accademia di scienza piccolo progetto Research Grant (G.S.V.). Supporto è stato generosamente fornito da una dotazione di Betty Jo amorevole Butler 58 per borsa di ricerca dello studente non laureato (a K.M.B.), una borsa di ricerca di estate di Farrell (a K.M.B.), un James Madison University secondo secolo Scholarship (a K.M.B.), un James Madison University Centennial borsa di studio (C.J.H.), una James Madison University Lucy Robinson cerca 30 Memorial Scholarship (a Z.L.H.) e a James Madison University College di Scienze e matematica facoltà assistenza Grant (a G.S.V.).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6J miceThe Jackson Laboratory#000664See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vectorAddGene#20781See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent gradeSigmaT6146-5GSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kgVWRBDH9286-2.5KGSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 gVWR#97061-566See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichS0876-100GSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichP5379-100GSee "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mLFisher ScientificA144-500See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette PullerSutter InstrumentP-97See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filamentSutter InstrumentFT330BSee "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5"PhenixLW-8148See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 TeethWorld Precision Instruments#14140See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-packWorld Precision Instruments#503708-12See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-packWorld Precision Instruments#503728-12See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-plyMedrepexpress#2204-cSee "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm IDWorld Precision Instruments#503203See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EASee "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHASee "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mmBTX#45-0489See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot PedalBTX#45-0211See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 GeneratorBTX#45-0052See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction BoxHarvard Apparatus#72-6468See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointmentHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS)VWR#95059-640See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive FormulaVeet#062200809951See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)Phenix Research ProductsTSP-10LKITSee "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettesSigma-AldrichA5177See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue AdhesiveMedrepexpressVG3See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mLSigma-AldrichZ551546-100EASee "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.Sigma-AldrichZ192392-100EASee "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting MaterialAncareNES3600See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, SterileBio-ServS5137See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97%Alfa AesarA11313See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tipsWorld Precision Instruments#501976See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powderAlfa Aesar#10752See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 bladeStanley Tools#11-515See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mmLeica#14046327404See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assemblyLeica#1404630132See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor BladesPersonnaBP9020See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder SLeica#14046230131See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush SetAmazonB0089KU6XESee "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus SlidesElectron Microscopy Services#71869-11See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 mlThermofisherP36970See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1Phenix Research ProductsMS1415-10See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma-AldrichD9542See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright MicroscopeOlympusBX51WISee "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal MicroscopeNikonTE2000/C2siSee "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20NikonCFI Plan Apo Lambda 4XSee "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75NikonCFI Plan Apo Lambda 20XSee "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40NikonCFI Plan Apo VC 60X OilSee "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")

Riferimenti

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