Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

Resumen

Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.

Resumen

El uso de desorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas (MALDI MSI) la proyección de imagen se expandió rápidamente, ya que esta técnica analiza una serie de biomoléculas de las drogas y los lípidos a N-glycans. Aunque existen diversas técnicas de preparación de muestras, detección de péptidos del formaldehído conservada los tejidos sigue siendo uno de los retos más difíciles para este tipo de análisis de espectrometría de masa. Por esta razón, hemos creado y optimizado una robusta metodología que conserva la información espacial contenida en la muestra, mientras que el mayor número de péptidos ionizables. También hemos destinado para lograrlo de una manera simple y rentable, eliminando así posibles error de sesgo o preparación, que puede ocurrir cuando utiliza instrumentación. El resultado final es un protocolo reproducible y de bajo costo.

Introducción

Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI MSI) la proyección de imagen ha sido empleada como una técnica de imagen basado en dos décadas^1,2, análisis de una gama de biomoléculas, incluyendo: lípidos³, péptidos^{2 ,4}, proteínas^2,5, metabolitos^6,7, N-glycans⁸y moléculas sintéticas como drogas terapéuticas^9,10. El número de publicaciones que demuestran la utilidad de esta técnica ha crecido significativamente durante la última década^6,11,12,13. Ciertas moléculas tales como lípidos, son relativamente fáciles de analizar mediante MALDI MSI, que se ionizan fácilmente debido a su naturaleza química y por lo tanto requieren poca preparación previa³. Sin embargo, para alcanzar las metas más difíciles tales como péptidos, los pasos necesarios para ionizar con eficacia estas moléculas son amplia y generalmente complicados¹⁴. Actualmente existen muy pocas publicaciones que apuntan a la dirección o demuestran reproducibilidad en las metodologías que se emplean para preparar el tejido para esta técnica visual única¹⁵. Por esta razón, hemos compilado las observaciones e implementadas optimizaciones en una única, fácil de implementar, metodología que no debería requerir poca o ninguna modificación, para el análisis de péptidos de un formaldehído reticulado tejido fuente¹⁴.

En este manuscrito, hemos descrito una metodología reproducible validada y bajo costo para la detección y asignación espacial de péptidos, generados a partir de formalina-fijos congelado (FFF) y secciones de tejido de formalina-fijo de parafina-encajadas (FFPE). Esta metodología no requiere ni confiar en cualquier instrumentación especializada³. En concreto, abordar los aspectos de la preparación de la muestra especializada necesario analizar péptidos; pasos como antígeno recuperación¹⁶ y recubrimiento de la matriz. Nuestro protocolo también utiliza equipo barato y reactivos, lo cual esta metodología accesible a una comunidad más amplia que de lo contrario sería incapaz de permitirse la alternativa aparato robótico¹⁷.

El razonamiento detrás de desarrollar un método de preparación manual de las muestras fue doble: en primer lugar, el uso de un sublimator crea una capa homogénea y consistente de cristales matriz ~ 1 μm de longitud¹⁸, algo inalcanzable con la pulverización más comunes técnicas. En segundo lugar, el conjunto relativamente pequeño los costos: el costo total del aparato de medida fue < AUD $1500. Observamos, en términos de rentabilidad, que el precio por muestra es mucho más barato cuando no hay ninguna maquinaria robotizada. El uso de la sublimación se ha divulgado previamente, sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, metodologías paso a paso que describen este proceso y preparación de muestras no han sido registrados ni descrito en la literatura.

Este protocolo está diseñado para ayudar a los investigadores que tienen acceso a un espectrómetro de masas MALDI y que están determinados en la generación de información espacial en relación con una bio-molécula de interés¹⁹. En esencia, MALDI MSI es una forma de histológico de detección no depende de los anticuerpos o las manchas de².

Protocolo

PRECAUCIÓN: Todas las precauciones de seguridad se deben seguir al realizar este procedimiento, incluyendo el uso de equipos de protección personal (EPP) (por ejemplo, batas de laboratorio, guantes de nitrilo, gafas de seguridad, etc.)

1. preparación de reactivos y equipos

1. Preparación de soluciones
   1. Para preparar 500 mL de líquido de Carnoy, mezcle 100% etanol (EtOH), cloroformo y ácido acético glacial en un 6:3:1 cociente de v/v/v en un frasco limpio de Schott.
   2. Para hacer líquido nitrocelulosa (NC), disolver la membrana NC (comúnmente utilizada en el borrar occidental) en acetona limpia, por agitación suave, a una concentración final de 40 mg/mL.
2. Preparación de portaobjetos recubierto NC
   1. Uso una técnica similar a la utilizada para la preparación de sangre frotis para que examen histológico²⁰ preparar NC revestido diapositivas.
   2. Pipeta de 40 μl de líquido NC en un borde de un portaobjetos de microscopio conductor indio óxido de estaño (ITO). Con un portaobjetos de vidrio ordinario, arrastre NC bajo tensión superficial a través de la diapositiva para crear una capa de película delgada incluso.
   3. Permita que la NC se seque a temperatura ambiente durante 20 s y entonces almacenar hasta que sea necesario a temperatura ambiente. Almacenamiento de muestras en estas condiciones puede ser indefinida siempre y cuando los tejidos se mantienen y libre de polvo.
      Nota: Este método de preparación es mejor conocido como "película delgada" y va a producir una capa uniforme que depende de la viscosidad de la NC, así como su falta de tensión de superficie se nivele automáticamente en la diapositiva. El único cuidado que debe tomarse al preparar las diapositivas no está moviendo demasiado rápido, que va a crear vetas de NC en lugar de una cobertura completa.
      PRECAUCIÓN: Como líquido NC se seca muy rápidamente, es esencial trabajar rápidamente para evitar que se sequen la solución antes de que se ha extendido correctamente. También se debe tener cuidado al manipular NC en su estado líquido, ya que es un compuesto altamente energético y no debe tocar una fuente de ignición para evitar explosión incendiaria. NC también sufre transiciones endotérmicas al secarse y puede causar quemaduras frío si entra en contacto prolongado con la piel o las manos enguantadas. Para minimizar los riesgos asociados, sólo pequeñas cantidades deben estar preparadas en cada momento (< 1 mL se recomienda). Una vez seco es estable a temperatura ambiente. Sin embargo, la NC puede permanecer explosivo cuando está presente en grandes cantidades.
3. Creación de cámaras de vapor personalizado
   1. Cortar un trozo de papel secante grueso con un par de tijeras lo suficientemente grandes como para caber en la parte inferior de la mitad de un plato de petri de plástico estándar (94 mm de diámetro y 3 mm de espesor).
   2. Cortar el papel, dejando una tira rectangular en el centro, el mismo tamaño que un portaobjetos de microscopio, dejando suficiente exceso de modo que el papel mantendrá su posición en el plato de Petri (figura 1 complementaria).

2. preparación de las secciones de tejido

1. De tejido FFPE²¹.
   1. Seleccione la sección a 12 μm de grosor en un banco estándar montado para Microtomo y flotador montaje en el NC previamente recubierto ITO diapositivas y bloque de tejido deseado.
   2. Sumerja el portaobjetos en xileno fresca para quitar la parafina residual por 2 min y repetir la operación una segunda vez.
      Nota: Si el bloque de parafina es especialmente dominante o el tejido es relativamente pequeño comparada con el bloque de parafina, las muestras se pueden calentar a 60 ° C para derretir lejos la mayoría antes de lavar, lavadora en xileno.
   3. Lavar las muestras deparaffinized sumergiendo los portaobjetos en una serie gradual de solventes: 70% v/v agua/EtOH, 100% EtOH, de Carnoy líquido, 100% EtOH, agua ultra pura y 100% EtOH. La duración de cada inmersión debe ser de 30 s, excepto en líquido de Carnoy, que debe durar 2 minutos.
      PRECAUCIÓN: Líquido de Carnoy y xileno deben almacenados y utilizados en una campana de humos, ya que son altamente tóxicos si se inhala.
2. Tejido formalina-fijo congelados (FFF)
   Nota: Las muestras deben ya congelarse, adecuadamente según el tipo de muestra.
   1. Equilibrar el bloque de tejido a la temperatura de funcionamiento del micrótomo para 20 minutos²².
      Nota: Temperatura de equilibrio depende del tipo de tejido.
   2. Deslice la sección el tejido usando un micrótomo a 12 μm y deshielo de montaje las secciones en un NC preparado recubiertos de ITO.
   3. Almacenar las diapositivas en un desecador de vacío sobre la mesa en la oscuridad.
      Nota: Las muestras pueden almacenarse durante varias semanas en estas condiciones.
   4. Lavar las muestras en una serie gradual de solventes como para tejido FFPE (2.1.3).
      Nota: No hay un paso de deparaffinisation de xileno como la muestra no está incorporada.

3. metileno reticulación hidrólisis

1. Cargue los portaobjetos de la muestra (FFF o FFPE) en una caja de plástico deslizante que se llena en la parte superior con 20 mmol tris-HCl (pH 8.8). Sellar la caja y colocarlo en un baño de agua, que contiene 500 mL de agua, permitiendo que la caja tocar la parte inferior. Luego calentar durante 15 min a 120 ° C en una olla a presión que puede alcanzar una presión de 70 kPa.
2. Eliminar las diapositivas, déjelos enfriar y deje secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

4. tejido digestión

1. Una vez hidrolizado, untar las muestras con 10 μl de solución de tripsina (1 mg/mL) en agua ultra pura, por Pipetear 10 μl de la solución sobre el borde de la sección del tejido y luego, utilizando la misma punta de pipeta, arrastrar la gota en toda la superficie del tejido bajo la superficie tensión.
   Nota: Evite rayar la superficie del tejido con la punta de la pipeta y sobre la que se separa la enzima más allá de las fronteras de los bordes de tejido.
2. Permita que las muestras se sequen a temperatura ambiente.
3. Una vez seco, montar las muestras dentro de la parte superior de la cámara de vapor previamente construidas (tejido hacia abajo) con cinta de autoclave en cualquier borde de la diapositiva (suplementario Figura 2).
4. Pipetear 600 μl de una solución que contiene una mezcla de 1:1 v/v 100% acetonitrilo y 50 mM de bicarbonato de amonio con cuidado sobre el dedo de papel secante en la parte inferior de la caja Petri hasta que el dedo parece uniformemente húmedo.
5. Coloque la mitad superior de la cámara de vapor en el fondo la mitad, asegurando el dedo y muestra la diapositiva de la papel alinear perfectamente y sellar la cámara alrededor de su Ecuador con la película de parafina.
6. Dejar la muestra durante la noche en una incubadora de 37 ° C para permitir la digestión completa.

5. matriz capa a través de la sublimación

1. Una vez digerido, pesa el portaobjetos de la muestra en un equilibrio microanalíticos de 5 dígitos.
2. Monte la corredera en el dedo del enfriamiento del aparato de la sublimación y fijarlo con cinta de cobre, de la misma manera como se describe para la cámara de vapor (figura 3 complementaria).
   Nota: Para asegurarse de que el carro se pone en contacto uniformemente por el dedo de enfriamiento, una capa de cinta de cobre se coloca en la parte inferior del dedo a nivel de la superficie de enfriamiento. Esto asegura que la diapositiva se enfría uniformemente que conduce a incluso la deposición de la matriz.
3. Colocar 300 mg de la matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) en un plato de petri de vidrio en la parte inferior de la cámara y extensión uniformemente para crear una fina capa de cristales de la matriz.
4. Montar el sublimator y asegure las dos mitades con la pinza de la herradura. Suspender la unidad montada de 15-20 cm por encima de un baño de arena, precalentado a 220 ° C, colocando en un anillo de metal conectado a un soporte de retorta.
5. Conecte la cámara al vacío, para activar el vacío y permite que se estabilice hasta ~ 25 mTorr durante 5 minutos.
6. Pack el dedo enfriamiento en la parte superior con hielo y añadir 50 mL de agua. Permita que el aparato que conformarse con un 5 minutos más antes de proceder.
7. Baje la cámara sobre la superficie de la arena, asegurando que la arena completamente en contacto con la parte inferior de la cámara y lo dejas por 45 minutos crear un recubrimiento ideal de 0,22 mg/cm²
   PRECAUCIÓN: Debe tenerse cuidado al manejar material de vidrio al alto vacío, como daños en el aparato, mientras que los evacuados, puede resultar en una falla catastrófica de la cámara de vidrio.
8. Después de 45 minutos, saque la cámara del baño arena levantando el anillo metálico y la cámara de ventilación.
   Nota: Una vez que la cámara se ha eliminado, la diapositiva debe eliminarse muy rápidamente como agua en el aire empezará a condensarse en el dedo y muestra diapositiva de congelación.
9. Quitar la corredera y pésalo para asegurar el recubrimiento deseado se ha logrado.
   Nota: Si capa insuficiente se ha logrado, simplemente Repita el proceso de la sublimación de la diapositiva hasta conseguir el espesor de capa deseado.

6. recristalización

1. Una vez sublimado, Monte la corredera de la muestra dentro de la tapa de la cámara de vapor previamente construida, como se describe anteriormente (tejido hacia abajo).
2. Pipetear 600 μl de una solución que contiene una mezcla de 1:1 (v/v) de 100% acetonitrilo y 0.1% v/v de ácido trifluoroacético en agua con cuidado sobre el papel secante en la parte inferior de la caja Petri para asegurar un recubrimiento uniforme.
3. Montar la cámara, asegurando la diapositiva de la ficha y microscopio de papel alinear perfectamente y dejar en una incubadora de 37 ° C durante 1 hora.
   PRECAUCIÓN: No selle el compartimiento.
   Nota: Una vez recristalizado, el color normalmente amarillo de la matriz debe cambia a blanco, mirar menos brillante y aparecen muy uniforme. Esto indica que la recristalización se ha realizado correctamente.
4. La muestra está ahora lista para su análisis.

7. instrumentación

1. Analizar la diapositiva en un escáner de superficie plana para crear una imagen digital.
2. Cargar la muestra en el espectrómetro de masas y luego analizar utilizando la plataforma de software apropiado.
3. Analizar las muestras en el modo reflectron de ion positivo con una gama total de 3.500 750 Da, con una resolución de punto que es aplicable al resultado deseado. En la mayoría de los casos, 20-50 μm trama ancho es suficiente, sin embargo tan poco como 10 μm pueden ser usados¹⁵.
   PRECAUCIÓN: Láseres UV MALDI son una fuente de radiaciones ionizantes y no deben ser vistos directamente. Asegúrese de que el láser está dentro de instrumento de protección antes de la operación.

Resultados

Si se siguen correctamente, este protocolo produce imágenes que representan claramente la morfología gruesa del tejido sin cualquier arañazos u otras deformaciones (figura 1). La validación ideal para una preparación de la ejecución correcta de la muestra, es la capacidad de distinguir diferentes estructuras físicas cambiando la molécula ser visto (figura 2).

Es...

Discusión

Este protocolo fue diseñado para maximizar la generación de especies moleculares ionizables eliminando deslocalización de analitos. Los factores clave incluyen usando el mismo principio primordial al aplicar la matriz, digerir la muestra o recristalización después de la sublimación²⁴; es decir, que una incluso deposición de vapor, de matriz o de lo contrario, debe ser creado y mantenido. Pipeteo lavados solvente para recristalización y la digestión, uniformemente por debajo de la muestra,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryo Microtome	Leica	CM3050	For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides	Bruker	8237001	For preparation and section of tissue.
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker	Kambrook	KPR620BSS	For preparation and section of tissue.
Sublimator	Chem Glass	NA	For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made
Sand bath	NA	NA	For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS70165100	For sublimation procedure.
Vacuum Pump	NA	NA	For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer
Cold trap	Chem Glass	CG-4510-02	For sublimation procedure.
Hot Plate	John Morris	EW-15956-32.	For sublimation procedure.
Plastic petri dish	Sigma Aldrich	Z717223	For sublimation procedure.
37 °C incubator	NA	NA	For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old
Blotting paper	Sigma Aldrich	P7796	For sublimation procedure.
Nitrocellulose	Sigma Aldrich	N8395	For washing of slides.
Acetone	Sigma Aldrich	650501	For washing of slides.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	For washing of slides.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	For washing of slides.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol
Chloroform	Sigma Aldrich	C2432	For washing of slides.
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	ARK2183	For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate	Sigma Aldrich	A6141	For proteolytic cleavage.
Trypsin	Sigma Aldrich	T0303	For proteolytic cleavage.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	For recrystallisation.
Acetonitrile	Sigma Aldrich	1.00029	For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	For recrystallisation.