Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Résumé

Ce protocole décrit une méthode fiable et reproductible pour la préparation axée sur la sublimation du formol fixé tissu destiné à la spectrométrie de masse d’imagerie.

Résumé

L’utilisation de désorption-ionisation laser assistée par matrice, spectrométrie de masse (MALDI MSI) d’imagerie a rapidement élargi, car cette technique analyse une foule de biomolécules de médicaments et de lipides à N-glycans. Bien qu’il existent de différentes techniques de préparation d’échantillon, détection des peptides de formaldéhyde préservé des tissus reste l’un des défis plus difficiles pour ce type d’analyse par spectrométrie de masse. Pour cette raison, nous avons créé et optimisé une méthodologie robuste qui conserve les informations spatiales contenues dans l’échantillon, tout en suscitant le plus grand nombre de peptides ionisables. Nous avons visait également à atteindre cet objectif de manière simple et rentable, éliminant ainsi l’erreur potentielle de partialité ou de la préparation, qui peut se produire lorsque l’utilisation automatisée instrumentation. Le résultat final est un protocole reproductible et peu coûteux.

Introduction

Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI) d’imagerie a été employée comme technique d’image basé pendant deux décennies^1,2, analyser une gamme de biomolécules, y compris : lipides³, peptides^{2 ,4}, protéines^2,5, métabolites^6,7, N-glycans⁸et des molécules synthétiques tels que les médicaments thérapeutiques^9,10. Le nombre de publications démontrant l’utilité de cette technique ont fortement augmenté au cours de la dernière décennie^6,11,12,13. Certaines molécules, comme les lipides, sont relativement faciles à analyser par MALDI MSI, comme ils ionisent facilement en raison de leur nature chimique et nécessitent peu de préparation à l’avance³. Toutefois, pour des cibles plus difficiles comme les peptides, les étapes requises pour ioniser efficacement ces molécules sont vastes et généralement compliqué¹⁴. Il y a actuellement très peu de publications qui visent à répondre ou à démontrent la reproductibilité dans les méthodologies utilisées pour préparer les tissus à cette technique visuelle unique¹⁵. Pour cette raison, nous avons compilé les observations et mises en oeuvre des optimisations en un seul, facile à implémenter, méthodologie ne nécessite peu ou aucun modifications, pour l’analyse des peptides d’un formaldéhyde que réticulé tissu source¹⁴.

Dans ce manuscrit, nous avons décrit une méthodologie reproductible validée, à faible coût pour la détection et la cartographie spatiale des peptides, produit des surgelés fixés au formol (FFF) et fixés au formol des sections de tissu (FFIP) inclus en paraffine. Cette méthodologie ne nécessitent ni s’appuyer sur une instrumentation spécialisée³. Plus précisément, nous abordons les nombreux aspects de la préparation de l’échantillon spécialisées nécessaire pour analyser les peptides ; étapes comme antigène récupération¹⁶ et revêtement de matrice. Notre protocole utilise aussi peu coûteux matériel et réactifs, ce qui rend cette méthode accessible à toute une communauté qui autrement seraient incapable de payer l' autre appareils robotisés¹⁷.

Le raisonnement qui sous-tend l’élaboration d’une méthode de préparation d’échantillon manuel comportait deux volets : Premièrement, l’utilisation d’un sublimator crée un revêtement uniforme et homogène des cristaux de matrice qui sont environ 1 µm de longueur¹⁸, quelque chose d’irréalisables avec arrosage plus fréquent techniques. Deuxièmement, l’ensemble relativement faible des coûts : le coût total de l’appareil de mesure était < 1500 $ AUD. Nous notons, en termes de rapport coût-efficacité, que le prix par exemple est beaucoup moins cher quand il n’y a aucun mécanisme robotique impliqué. L’utilisation de sublimation a été signalée précédemment, cependant, au meilleur de nos connaissances, des méthodes pas à pas qui décrivent ce processus et préparation des échantillons n’ont pas été signalés ni décrits dans la littérature.

Ce protocole vise à aider les chercheurs qui ont accès à un spectromètre de masse MALDI et qui ont l’intention sur le développement de l’information spatiale en relation avec une bio-molécule d’intérêt¹⁹. En substance, MALDI MSI est une forme de histologique préalable qui ne s’appuie pas sur les anticorps ou taches².

Protocole

ATTENTION : Toutes les précautions de sécurité en vigueur devraient suivre lors de l’exécution de cette procédure, y compris l’utilisation d’équipement de protection individuelle approprié (PPE) (p. ex., les sarraus de laboratoire, gants en nitrile, lunettes de sécurité, etc.)

1. préparation des réactifs et du matériel

1. Préparation des solutions
   1. Pour préparer 500 mL de liquide de Carnoy, mélanger 100 % éthanol (EtOH), le chloroforme et acide acétique glacial dans un 6 : rapport de 3:1 v/v/v dans une bouteille propre Schott.
   2. Pour rendre liquide nitrocellulose (NC), dissoudre membrane NC (couramment utilisé en western blot) dans de l’acétone pur, par agitation douce, à une concentration finale de 40 mg/mL.
2. Préparation de diapositives NC enduit
   1. Utilisation d’une technique similaire à celle utilisée pour la préparation du sang frottis pour examen histologique²⁰ préparer NC enduit diapositives.
   2. Distribuer 40 µL de liquide NC sur une arête d’une lame de microscope d’oxyde d’étain (ITO) conducteur d’indium. À l’aide d’une lame de microscope de verre ordinaire, faites glisser la NC sous tension superficielle sur la diapositive pour créer un revêtement mince même.
   3. Permettre la NC sécher à température ambiante pendant 20 s et puis magasin jusqu'à ce que nécessaire à la température ambiante. Conservation des échantillons en vertu de ces conditions peut être indéfinie, pourvu que les tissus sont maintenues et exempt de poussière.
      Remarque : Cette méthode de préparation est mieux connu sous le nom de « couches minces » et va produire un revêtement uniform qui dépend de la viscosité de la NC ainsi que son manque de tension superficielle s’autoniveler sur la diapositive. Les soins seul qu’il faut alors préparer les diapositives pas bouge trop vite, ce qui créeront des stries de NC plutôt que d’une couverture complète.
      ATTENTION : Comme liquide NC sèche très vite, il est essentiel de travailler rapidement pour éviter la solution de séchage avant il a été correctement étalé. Aussi être prudent lorsque manipulation NC à l’état liquide, telle qu’elle est un composé hautement énergétique et ne doit pas toucher une source d’inflammation pour prévenir l’explosion incendiaire. NC subit aussi une transition endothermique lorsque séchage et peut causer des brûlures de froids si autorisés à entrer en contact prolongé avec la peau ou les mains gantées. Afin de minimiser tous risques, que de faibles quantités doivent être préparées à chaque fois (< 1 mL est recommandé). Une fois sec, il est stable à température ambiante. Cependant, NC peut rester explosif lorsqu’il est présent en grande quantité.
3. Création des chambres de vapeur personnalisé
   1. Couper un morceau de papier buvard épais avec une paire de ciseaux assez grand pour s’adapter à la partie inférieure la moitié d’un plat de Pétri plastique standard (94 mm de diamètre et 3 mm d’épaisseur).
   2. Couper le papier, en laissant une bande rectangulaire dans le centre, la même taille qu’une lame de microscope, laissant assez de surplus pour que le document conserve sa position dans la boîte de Pétri (supplémentaire Figure 1).

2. préparation des coupes de tissus

1. FFIP tissu²¹.
   1. Sélectionnez le bloc de tissu désiré et la section à 12 µm d’épaisseur dans un banc standard monté microtome et flotteur monture sur la NC pré-enrobé ITO diapositives.
   2. Plonger les lames dans le xylène douce pour enlever la paraffine résiduelle pendant 2 min et répéter l’opération une seconde fois.
      Remarque : Si le bloc de paraffine est particulièrement envahissant ou le tissu est relativement faible par rapport au bloc de paraffine, les échantillons peuvent être chauffés à 60 ° C pour faire fondre la majorité loin avant le lavage dans le xylène.
   3. Laver les échantillons déparaffinées en immergeant les lames dans une série graduée de solvant : 70 % v/v EtOH/eau, 100 % EtOH, de Carnoy fluide, 100 % EtOH, eau ultra pure et 100 % EtOH. La durée de chaque immersion devrait être de 30 s, à l’exception de fluide de Carnoy, qui doit durer 2 min.
      ATTENTION : De Carnoy fluide et xylène doivent être stockés et utilisés dans une hotte de laboratoire, car ils sont très toxiques par inhalation.
2. Tissus fixés au formol congelés (FFF)
   Remarque : Les échantillons déjà, doivent être gelés appropriée selon le type d’échantillon.
   1. Equilibrer le bloc de tissu à la température de fonctionnement du microtome pour 20 min²².
      Remarque : La température de l’équilibration est dépendante du type de tissu.
   2. Section le tissu à l’aide d’un microtome à 12 µm et dégel montage les sections sur un NC pré-préparés enduit ITO glisser.
   3. Stocker les diapositives dans un dessiccateur à vide sur le banc dans l’obscurité.
      Remarque : Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines dans ces conditions.
   4. Laver les échantillons en une série de solvant classée comme indiqué pour tissu FFPE (2.1.3).
      Remarque : Il n’est pas nécessaire pour une étape de deparaffinisation de xylène que l’échantillon n’est pas incorporée.

3. méthylène Crosslink hydrolyse

1. Charger les lames de l’échantillon (FFF ou FFIP) dans une boîte en plastique de glissière qui est remplie de 20 mmol tris-HCl (pH 8,8) vers le haut. Scellez la boîte et le placer dans un bain d’eau contenant 500 mL d’eau, ce qui permet de la boîte à toucher le fond. Puis chauffer pendant 15 min à 120 ° C dans une marmite à pression qui peuvent atteindre une pression de 70 kPa.
2. Supprimer les diapositives, laissez-les refroidir et laissez-les sécher à température ambiante pendant 15 minutes.

4. tissu Digestion

1. Une fois hydrolysée, enduire les échantillons avec 10 µL de solution de trypsine (1 mg/mL) dans l’eau ultra pure, par pipetage 10 µL de la solution sur le bord de la partie de tissu et ensuite, en utilisant la même pipette, faites glisser la gouttelette sur toute la surface du tissu sous la surface tension.
   Remarque : Ne pas rayer la surface du tissu avec l’embout de la pipette et de répandre l’enzyme au-delà des frontières des bords des tissus.
2. Laisser les échantillons à sécher à température ambiante.
3. Une fois sec, montez les échantillons à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits (tissus vers le bas) avec ruban autoclave sur chaque bord de la lame (complémentaire Figure 2).
4. Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 v/v de 100 % d’acétonitrile et de 50 mM d’ammonium bicarbonate soigneusement sur le doigt de papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri, jusqu'à ce que le doigt semble être uniformément humide.
5. Placez la moitié supérieure de la chambre de vapeur sur le fond la moitié, s’assurant de la diapositive de doigt et échantillon de papier aligner parfaitement et sceller la chambre autour de son Équateur avec film de paraffine.
6. Laisser l’échantillon du jour au lendemain dans un incubateur à 37 ° C pour permettre une digestion complète.

5. matrice revêtement par Sublimation

1. Une fois digéré, peser la lame échantillon sur un équilibre microanalytiques à 5 chiffres.
2. Monter le glisser sur le doigt de refroidissement de l’appareil de sublimation et fixez-le avec du ruban de cuivre, de la même manière comme pour la chambre de vapeur (supplémentaire Figure 3).
   Remarque : Pour vous assurer que la lame est contactée uniformément par le doigt de refroidissement, une couche de ruban de cuivre est placée sur le fond du doigt refroidissement pour niveler la surface. Cela garantit que la diapositive est uniformément froid qui mène au même dépôt de matrice.
3. Placer 300 mg de matrice de α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) dans un plat de Pétri de verre au fond de la chambre et la propagation uniformément pour créer une fine couche de cristaux de matrice.
4. Assembler le sublimator et fixer les deux moitiés avec le collier de fer à cheval. Suspendre l’appareil assemblé 15-20 cm au-dessus d’un bain de sable, préalablement chauffé à 220 ° C, en le plaçant dans un anneau métallique relié à un statif.
5. Connecter la chambre à la source de vide, engager le vide et laissez-le se stabiliser vers le bas pour ~ 25 mTorr pendant 5 min.
6. Emballez le doigt de refroidissement vers le haut avec de la glace et ajouter 50 mL d’eau. Laissez l’appareil se contenter d’un autre 5 minutes avant de procéder.
7. Abaissez la chambre sur la surface du sable, assurant le sable entre complètement en contact avec le fond de la chambre et laissez-le pendant 45 min créer un revêtement idéal de 0,22 mg/cm²
   ATTENTION : Il faut quand manutention verrerie à vide poussé, comme des dommages à l’appareil, alors que les évacués, peut entraîner une défaillance catastrophique de la chambre de verre.
8. Après 45 min, enlevez la chambre depuis le bain de sable en soulevant la bague métallique et aérer la chambre.
   Remarque : Une fois que la chambre a été vidée, la lame doit être enlevée très rapidement que l’eau dans l’air commence à se condenser sur la diapositive de doigt et échantillon de gel.
9. Retirer la glissière et pesez-le afin d’assurer le revêtement désiré a été atteint.
   Remarque : Si le revêtement insuffisant ont été réalisé, répétez simplement le processus de sublimation pour la diapositive jusqu'à ce que l’épaisseur du revêtement désiré a été atteint.

6. recristallisation

1. Une fois sublimée, monter la lame de l’échantillon à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits, comme antérieure décrite (tissus vers le bas).
2. Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 (v/v) de 100 % d’acétonitrile et de 0,1 % v/v d’acide trifluoroacétique dans l’eau avec précaution sur le papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri pour assurer une couche uniforme.
3. Assembler la chambre, assurant la glissière de microscope et onglet papier aligner parfaitement et laisser dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
   ATTENTION : Ne pas assurer l’étanchéité la chambre.
   Remarque : Une fois recristallisée, la teinte jaune normalement de la matrice devrait changer en blanc, regarder moins brillante et apparaissent très même. Ceci indique que recristallisation a été effectuée correctement.
4. L’échantillon est maintenant prêt pour l’analyse.

7. instrumentation

1. Scan de la lame dans un scanner à plat pour créer une image numérique.
2. Charger l’échantillon dans le spectromètre de masse et à analyser à l’aide de la plate-forme de logiciels appropriés.
3. Analyse des échantillons en mode réflectron ion positif avec une gamme de masses de 750-3 500 Da, avec une résolution spot qui s’applique au résultat souhaité. Dans la plupart des cas, 20 à 50 µm raster largeur est suffisante, mais aussi peu que 10 µm peut être utilisé¹⁵.
   ATTENTION : Les lasers UV MALDI sont une source de rayonnement ionisant et ne doivent pas être lus directement. Veiller à ce que le laser est contenu au sein de l’instrument blindage avant l’opération.

Résultats

Si suivies correctement, ce protocole produit des images qui représentent clairement la morphologie générale du tissu sans les égratignures ou autres déformations (Figure 1). La validation idéale pour une préparation de l’échantillon correctement exécutée, est la capacité de distinguer entre les différentes structures physiques en changeant la molécule étant lus (Figure 2).

Discussion

Ce protocole a été conçu pour maximiser la génération des espèces moléculaires ionisables tout en éliminant les délocalisation d’analytes. Les principaux facteurs impliquent en utilisant le même principe primordial lors de l’application de matrice, digérer l’échantillon ou recristalliser après sublimation²⁴; savoir, qu’un même dépôt de vapeur, de matrice ou autrement, doit être créée et maintenue. Pipetage solvants nettoyants pour recristallisation et digestion, uniform?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryo Microtome	Leica	CM3050	For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides	Bruker	8237001	For preparation and section of tissue.
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker	Kambrook	KPR620BSS	For preparation and section of tissue.
Sublimator	Chem Glass	NA	For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made
Sand bath	NA	NA	For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS70165100	For sublimation procedure.
Vacuum Pump	NA	NA	For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer
Cold trap	Chem Glass	CG-4510-02	For sublimation procedure.
Hot Plate	John Morris	EW-15956-32.	For sublimation procedure.
Plastic petri dish	Sigma Aldrich	Z717223	For sublimation procedure.
37 °C incubator	NA	NA	For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old
Blotting paper	Sigma Aldrich	P7796	For sublimation procedure.
Nitrocellulose	Sigma Aldrich	N8395	For washing of slides.
Acetone	Sigma Aldrich	650501	For washing of slides.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	For washing of slides.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	For washing of slides.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol
Chloroform	Sigma Aldrich	C2432	For washing of slides.
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	ARK2183	For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate	Sigma Aldrich	A6141	For proteolytic cleavage.
Trypsin	Sigma Aldrich	T0303	For proteolytic cleavage.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	For recrystallisation.
Acetonitrile	Sigma Aldrich	1.00029	For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	For recrystallisation.