Métodos para pupa períodos de prueba y medición de pigmentación de ala de Drosophila guttifera

Resumen

Se describen los protocolos de presentar períodos de pupas y medición de la pigmentación de ala de Drosophila guttifera . Puesta en escena y cuantificación de pigmentación proporcionan una base sólida para el estudio de los mecanismos del desarrollo de rasgos adultos y permiten la comparación interespecífica de desarrollo rasgo.

Resumen

Diversificada especies de Drosophila (mosca de la fruta) proporcionan oportunidades para el estudio de mecanismos de desarrollo y los cambios genéticos responsables de cambios evolutivos. En particular, la etapa adulta es una rica fuente de caracteres morfológicos para la comparación interespecífica, incluyendo ala pigmentación comparación. Para estudiar las diferencias del desarrollo entre especies, observación detallada y adecuada puesta en escena se requiere para la comparación exacta. Aquí describimos protocolos de puesta en escena de períodos pupas y cuantificación de la pigmentación de ala en una lunares mosca de la fruta Drosophila guttifera. En primer lugar, describimos el método de observación morfológica detallada y definición de etapas de pupal basadas en morfologías. Este método incluye una técnica para quitar del pupario, que es la carcaza externa quitinosa de la pupa, para permitir la observación detallada de la morfología pupal. En segundo lugar, describimos el método para medir la duración de etapas pupas definidas. Finalmente, describimos el método para la cuantificación de la pigmentación ala basada en análisis de imágenes mediante imágenes digitales y el software ImageJ. Con estos métodos, podemos establecer una base sólida para comparar procesos de desarrollo de rasgos adultos durante etapas de pupal.

Introducción

Algunos de los rasgos morfológicos de Drosophila se diversifican entre especies^1,2,3,4,5. Podemos abordar la cuestión de la diversidad morfológica cómo surge mediante la comparación de los mecanismos de generación de estas morfologías. Ejemplos de tales morfologías son tricomas larvarias, peines sexuales para adultos, aparato genital externo, pigmentación abdominal y ala pigmentación^{6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15}. para estudiar las diferencias morfológicas entre los adultos, observación y análisis de las etapas de pupas son importantes, porque el destino de rasgos adultos se determina en las últimas etapas larvales y morfogénesis posterior procede durante el período de pupa.

En estudios de Biología del desarrollo de Drosophila melanogaster, 'horas APF' (horas después de la formación pupal) es el método común para indicar una etapa pupal¹⁶. Este sistema emplea tiempo absoluto después de la formación pupal y es muy conveniente para los experimentos de la rutina. Sin embargo, velocidad de desarrollo puede diferir entre pupas, puede verse afectada por pequeñas diferencias genéticas, epigenéticas o microambiental, y por lo tanto, con el mismo tiempo absoluto después de la formación pupal no garantiza que las pupas son al mismo etapa de desarrollo. En muchos casos, son preferibles para comparar a varios individuos etapas definidas por características morfológicas. Sobre todo, una comparación entre especies requiere precisa puesta en escena y la comparación entre correspondientes (homólogos).

Bainbridge y Bownes¹⁷ reconoce 20 etapas de pupal (P1 a P15(ii)) basado en las características morfológicas de pupas de Drosophila melanogaster . Esta puesta en escena es el sistema más ampliamente utilizado de la puesta en escena del desarrollo morfológico¹⁸. En un estudio anterior, se realizó estadificación pupal de Drosophila guttifera para establecer una base para ala pigmentación estudios¹⁹. D. guttifera tiene un patrón de lunares negros en sus alas y es una de las especies modelo de ala pigmentación formación²⁰. Aunque nos referimos a los criterios morfológicos descritos en el Bainbridge y 'Bownes investigación¹⁷, directamente midiendo duraciones de etapa observaciones serie¹⁹, en lugar de utilizar Bainbridge y 'Bownes estimación de las duraciones de la fase de de frecuencia observada. Aquí describimos el método de puesta en escena pupal y medición de duración de etapas de pupal de Drosophila en Fukutomi et al¹⁹.

Para estudiar el mecanismo del desarrollo de la pigmentación de ala, que necesitamos saber cuando en estadios de pupas o adulto se produce la pigmentación. Fukutomi et al. ¹⁹ había cuantificado densidades ópticas (ODs) de la pigmentación durante etapas de pupas y adulto por análisis de imágenes de imágenes de ala. La pigmentación de las alas de Drosophila se piensa para ser causado por la acumulación de melanina negra²¹. Para la cuantificación de Sao, se utilizaron imágenes de escala de grises y ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)²² . Para reconocer y cuantificar la pigmentación específica de lugar (ΔOD), restamos el OD fuera de un lugar de la do dentro de un lugar. Para hacer este método reproducible y objetiva, se deben determinar los lugares de medición de OD con venas de las alas como puntos de referencia. En este artículo, describimos en detalle este método de cuantificación de la pigmentación de ala de Drosophila guttifera.

Protocolo

1. acción de volar

1. Uso de Drosophila guttifera para todos de los siguientes protocolos.
2. Utilizar frascos de plástico (diámetro 25 mm x alto 96 mm) y celulosa (diámetro 23 mm x altura 26 mm) para el mantenimiento de stock. Utilizar un alimento de harina de maíz/azúcar/levadura/agar estándar y siga una publicación describió tres otras recetas alternativas para esta especie².
   Nota: D. guttifera (número común 15130-1971.10) es proporcionado por el centro de acción de especies de Drosophila de la Universidad de California, San Diego. Aunque guttifera D. pertenece a la immigrans-tripunctata radiación, que está lejanamente relacionada con D. melanogaster dentro el género²³, tiene muchas propiedades biológicas en común con D. melanogaster . Por consiguiente, este protocolo se puede aplicar para muchas especies de Drosophila , aunque algunas especies requieren alimentos específicos o consejos técnicos a mantener².

2. observación de pupa y la definición de etapas de pupal

Nota: La pupa para la observación se toma de la población de mosca mantenida con un 12:12 h luz/oscuridad ciclo a 25 ° C. Bainbridge y Bownes¹⁷ describe un riesgo bajo de pupas de D. melanogaster en movimiento desde el lugar original de pupación en un pedazo de papel húmedo (supervivencia del 97% de pupas movidos 946). Pupas de D. guttifera pueden ser preparados por esencialmente el mismo método.

1. Lugar de adultos sanos de Drosophila en alimentos frescos (harina/azúcar/levadura/agar alimentos) en un frasco de plástico (diámetro 25 mm x alto 96 mm) y poner huevos. Espere 7 días para obtener fines 3 estadios.
2. Coloque 1 mL de harina/azúcar/levadura/agar alimentos en cada microtubo de 1.5 mL. Hacer 3 agujeros de alfiler con separación de 2 mm en los párpados de microtubos penetrando con un alfiler para permitir la respiración.
3. Centrifugar microtubos con comida para los 7 s en una microcentrífuga mini (860 x g).
4. Invertir y aprovechar los frascos para eliminar a todos los adultos de la cubeta.
5. Verter 5-10 mL de ddH₂O (o agua de ósmosis) en el frasco.
6. Vierta las larvas con agua en un plato de Petri de plástico (diámetro de 90 mm x altura 15 mm). Identificar estadios 3 finales por su tamaño de cuerpo grande (3-4 mm de longitud).
7. Mueva suavemente finales 3er instar larvas con pinzas en los microtubos con alimentos (10 larvas / microtubos). Incúbelos durante la noche a 25 ° C.
8. Mover la pupa recién formada sobre un trozo de papel de seda que ha sido humedecido por ddH₂O y colocar en una placa de Petri de plástico (diámetro 35 mm x alto 10 mm).
9. Coloque la placa de Petri en una cámara húmeda (contiene 10 mL de ddH₂O en la parte inferior) y espere hasta que las pupas se convierten a la etapa deseada.
10. Pupas en un pedazo húmedo de papel de seda se mueven en una placa de Petri de plástico (diámetro 60 mm x altura 15 mm).
    Nota: La definición de etapas en su mayoría es posible basada en las etapas de D. melanogaster¹⁷. Por lo general, el período pupal de Drosophila puede categorizarse en P1 - P15(ii), aunque algunas modificaciones de la definición de etapa serían necesarios dependiendo de la especie utilizada. Si es posible, eliminar el pupario permite la observación precisa y detallada. Ver detalles a continuación (paso 3).
11. Observar pupas bajo un microscopio estéreo. Tomar fotografías con una cámara digital acoplada al microscopio estéreo.

3. eliminación de la mosca

Nota: Pupas de Drosophila están cubiertos por una estructura llamada pupario. Un insecto de Muscomorpha (moscas) no arrojar su cutícula larval en pupación; en cambio, se endurece la cutícula después apolysis y utiliza como una cubierta protectora de la pupa, la mosca²⁴. Una pupa que residen dentro de un pupario tiene una verdadera cutícula pupal, que es muy suave y frágil. Antes apolysis ocurre alrededor P4(ii), epitelios y pupario están conectados juntos, y por lo tanto la eliminación del pupario sin daño es muy difícil. Después de P5, quitando el pupario es laborioso, pero útil para la observación morfológica y definición de etapas de pupal. El proceso se lleva a cabo como sigue.

1. Pegue un pedazo de cinta de doble cara en un pedazo de toalla de papel.
2. Coloque una pupa en el lado ventral de la cinta de doble cara arriba (figura 1A).
3. Localizar el espacio entre la parte anterior del pupario y la pupa interna. Agarre y quitar la mosca alrededor de este vacío mediante fórceps y exponer el lado anterior de la cabeza de la pupa.
4. Inserte la punta de unas pinzas moviendo paralelo al eje antero-posterior. Levante la punta de las pinzas para romper localmente del pupario. Repita esta acción hasta que la rotura alcanza la parte posterior del pupario. Asegurar que una brecha se forma también entre el pupario y piernas pupas y romper el lado ventral del pupario y minimizar el daño a la pupa interno (figura 1B).
5. Después de romper el pupario tanto como sea posible, sacar la pupa con un pincel fino (#5/0) (figura 1).
6. Coloque la pupa en un pedazo de papel de seda que ha sido humedecido con ddH₂O y colocar en una placa de Petri de plástico (diámetro 60 mm x altura 15 mm). Tomar fotografías tan pronto como sea posible porque la pupa expuesta es vulnerable y fácilmente llega a ser seca.
   Nota: Pupas sin un pupario no son adecuados para medir la duración de los períodos de pupas (paso 4), debido a estrés (por ejemplo, desecación) y daño físico podrían interferir con el normal desarrollo.

4. medir las duraciones de las etapas de pupal

1. Preparar pupas para medir duración de etapas de pupal tal como se describe en el paso 2. Recoger el pupas de 1-2, 2-3 y 3-4 días después de la formación pupal (20 pupas). Dar los números de identificación individual (1-60) a pupas para identificación. Continuar recogiendo recién formado pupas durante los pasos siguientes, para obtener 20 pupas jóvenes más. Dar los números de identificación individual (61-80) a las pupas recién formadas. Coloque una pupa en un pedazo de ddH₂humedecido O pañuelo de papel en un pozo (3,9 cm²) de una placa de cultivo celular 12-bien (pupa/1 pozo, placa de pupas 12). Llene el espacio entre bien de placas con ddH₂O para mantener la humedad, poner las tapas en y colocar las placas en 25 ° C, condiciones de iluminación constante (24:0 h luz/oscuridad).
   Nota: Pupas sin un pupario no son adecuados para medir la duración de períodos de pupas. No retire el pupario.
2. Observar las características morfológicas incluyendo color de la carrocería, las cerdas, los túbulos de Malpighi y cuerpo amarillo de pupas de todos, una vez cada 30 minutos y registro observan etapas (P1 - P15(ii), basado en referencias^17,19) en una hoja de recuento.
3. Continuar la grabación en cuatro días consecutivos (96 h) por un cambio rotativo de tres (o más) personas.
4. Contar números de registros de cada etapa particular y les promedio (promedio cuenta de observaciones / pupas). Luego multiplicarlas por 0.5 (h), dando por resultado la longitud estimada de etapas (h).

5. medición de intensidad de manchas negras sobre un ala

Nota: La intensidad de manchas negras sobre un ala pupa o adulto se puede cuantificar midiendo la densidad óptica (OD). Un filtro de cristal con ODs conocidos (densidad escalonada del filtro) se utiliza para calibración²⁵, por lo que se puede calcular el OD de un área particular de una imagen digital de un ala. Se miden la do en un lugar y el OD fuera de la mancha, y este último se restará del primero para obtener la intensidad de la mancha (ΔOD). Aquí, describimos el método de disección, medición y cálculo de ΔOD. Este procedimiento se puede hacer después del paso 2, independiente del paso 3 y paso 4. Una vez que uno ha realizado el paso 2 y comprende todas las etapas pupas, directamente puede iniciar o repetir paso 5.

1. Preparación de imagen
   1. Preparar una nueva pupa de una etapa focal como se describe en el paso 2. Quite la parte anterior de un pupario con fórceps. Sacar la pupa con unas pinzas y colocar en tampón fosfato salino (PBS, tabla 2) en una placa de Petri de plástico (diámetro 35 mm x alto 10 mm).
   2. Cortar la articulación basal de un ala (articulación basal es la parte proximal estrecha del ala). Como el ala está plegado, colóquelo en un plato de Petri de plástico (diámetro 35 mm x alto 10 mm) con ddH₂O para extenderlo por la presión osmótica (la mariposa se desarrolla por sí mismo).
   3. Recoger nuevamente eclosed adultos una vez cada 10 minutos de un frasco de stock. Anestesiar una mosca con CO₂ usando un CO₂ anestesia, anestesia para confirmar inmovilidad y cortar la articulación basal de un ala.
   4. Lugar 10 μl de PBS en un portaobjetos de vidrio, colocar allí el ala y cubrir con un cubreobjetos (18 x 18 mm).
   5. Encender la luz del microscopio estéreo. Programar la luz para estar al máximo nivel. Establecer el objetivo 11.5 X. Ajuste el diafragma al ser el estado más abierto. Encender la cámara. Ajustar la cámara para ser (ISO: 100, modo SHQ 3136 x 2352 píxeles, velocidad de obturación: 1/20 s). Se centran en la muestra moviendo la perilla de enfoque del microscopio.
   6. Presione el botón disparador de la unidad de control remoto para tomar una imagen. Tomar 3 imágenes por ala, cada uno de los cuales debe estar centrado en una sensillum de campaniformes, vena punto o posterior vena longitudinal, colocación de la parte distal del ala en el lado izquierdo y la parte anterior del ala en la parte superior.
2. Calibración
   1. Tomar imágenes de 9 partes de un filtro de densidad escalonada con la misma configuración de cámara para obtener la imagen de ala.
   2. Iniciar el ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)²².
   3. Haga clic en archivo de | Abierto | y seleccione una de las imágenes del filtro densidad escalonada.
   4. Haga clic en imagen | Tipo | 8 bits | para convertir la imagen a una imagen de 8 bits.
   5. Haga clic en Editar | Selección | Especificar | y columna Oval y centrado . Escribir 100 (píxeles) en la columna de anchura , 100 (píxeles) en la columna de altura , de 1568 en columna X coordinar y 1176 en columna Y coordinar . Haga clic en Aceptar.
   6. Haga clic en analizar | Medida |. El "valor medio de gris" de las áreas se mide.
   7. 5.2.3 repetición. a 5.2.6. para los 8 restantes imágenes.
   8. Haga clic en analizar | Calibre y seleccione Rodbard²⁵ en función de columna y escriba el siguiente número en la columna derecha en el medio (0.04, 0,336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408; estos números dependen de la densidad de la caminó la densidad del filtro).
   9. Verificar calibración Global de columna y haga clic en Aceptar.
      Nota: Al realizar este procedimiento, "significa valor gris" se convierte en "densidad óptica (OD)" utilizando la función de Rodbard. Después de este paso, se puede calcular densidad óptica de un particular área seleccionada en el software ImageJ.
3. Elegir zona de mediciones
   Nota: Puntos son típicamente asociados con puntos de referencia, como sensilla campaniformes, consejos de vena longitudinal y crossveins. Estos y otros puntos de interés en un ala se pueden utilizar para elegir la región de las mediciones. Aquí, un ejemplo enD. guttifera(Figura 2) se describe.
   1. Definición del punto A, punto de sensillum campaniformes.
      1. Abra una imagen en la que un punto de sensillum campaniformes es en el centro de la imagen. Haga clic en imagen | Tipo | 8 bits | para convertir la imagen a una imagen de 8 bits.
      2. Haga clic en rectángulo en el Área de selección de herramientas y dibuje un rectángulo. Establece el vértice superior izquierdo del rectángulo para que se adjunta a la línea posterior de la tercera vena longitudinal y más distal desde un punto de sensillum campaniformes. Ajustar el lado derecho del rectángulo que se encuentra a la derecha de lo campaniformes sensillum punto.
      3. Haga clic en Editar | Selección | Añadir a gerente de |. Compruebe la columna Mostrar todo .
      4. Haga clic en herramienta de ángulo en la Línea de herramientas de selección. Dibujar la primera línea en la línea posterior de la tercera vena longitudinal. Fijar los extremos izquierdos de la línea en el vértice del rectángulo dibujado en el paso 1. Trazar la segunda línea en el lado superior del rectángulo. Presione la tecla "m" para medir el ángulo entre las dos líneas dibujadas en este paso. Haga clic en la ventana de la imagen en la pantalla de la computadora.
      5. Haga clic en Editar | Selección | Añadir a gerente de |.
      6. Haga clic en rectángulo en el Área de selección de herramientas y dibuje un rectángulo de aproximadamente 1/9 del tamaño de la ventana de imagen. Haga clic en Editar | Selección | Gire |. Escriba el signo menos grados del ángulo medido en el paso 5.3.1.4. en ángulo de columna y haga clic en OK para rotar el rectángulo dibujado en este paso.
      7. Mover el rectángulo dibujado en el paso 5.3.1.6. utilizando las teclas de flecha. Establecer el punto final de la línea posterior de la segunda vena longitudinal en el lado izquierdo del rectángulo y el lado inferior del rectángulo conectado a la línea posterior de la tercera vena longitudinal. Confirmar que se dibuja una línea perpendicular desde el punto final de la segunda vena longitudinal a la línea posterior de la tercera vena longitudinal en este procedimiento. Definen a los pies de la línea perpendicular como punto A (figura 2A).
      8. Grabar la coordenada x y la coordenada y del punto A, indicado debajo de las Herramientas de selección de área al colocar el cursor en el punto A.
   2. Definición de la letra B, punto de punta longitudinal de la vena
      1. Abra una imagen en la que un lugar de punta de vena longitudinal es en el centro de la imagen. Haga clic en imagen | Tipo | 8-bit | para convertir la imagen a una imagen de 8 bits.
      2. Repita el mismo procedimiento descrito en el paso 5.3.1. (Definición del punto A, campaniformes sensillum spot) para encontrar un punto en la imagen.
      3. Haga clic en Editar | Selección | Añadir a gerente de |.
      4. Haga clic en rectángulo en el Área de selección de herramientas y dibuje un rectángulo. Encuentra el vértice superior izquierdo del rectángulo en el punto final de la línea posterior de la tercera vena longitudinal.
      5. Haga clic en Editar | Selección | Añadir a gerente de |.
      6. Haga clic en herramienta de ángulo en la Línea de herramientas de selección. Dibujar la primera línea para conectar el punto A y el punto final de la línea posterior de la tercera vena longitudinal. Definir esta línea como línea A. dibujar la segunda línea en el lado superior del rectángulo dibujado en el paso 5.3.2.4. La tecla "m" para medir el ángulo entre las dos líneas.
      7. Haga clic en Editar | Selección | Añadir a gerente de |.
      8. Haga clic en rectángulo en el Área de selección de herramientas y dibuje un rectángulo de aproximadamente 1/9 del tamaño de la ventana de imagen. Haga clic en Editar | Selección | Gire |. Escriba el signo menos grados del ángulo medido en el paso 5.3.2.6. en ángulo de columna y haga clic en OK para rotar el rectángulo dibujado en este paso. Mover el rectángulo usando las teclas de flecha. Fijar la parte superior del rectángulo que está conectado a la línea A y el punto final de la línea anterior de la cuarta vena longitudinal por lo que es en el lado izquierdo del rectángulo.
      9. Haga clic en Editar | Selección | Añadir a gerente de |.
      10. Haga clic en rectángulo en el Área de selección de herramientas y dibuje un rectángulo de aproximadamente 1/9 del tamaño de la ventana de imagen. Haga clic en Editar | Selección | Gire |. Escriba el signo menos grados del ángulo medido en el paso 6 en la columna de ángulo y haga clic en OK para rotar el rectángulo dibujado en este paso. Mover el rectángulo usando las teclas de flecha. Establecer el vértice inferior izquierdo del rectángulo que está en el vértice superior izquierdo del rectángulo dibujado en el paso 5.3.2.8., resultando en la obtención de la línea perpendicular desde el punto de final de la línea anterior de la cuarta vena longitudinal a la línea A. definir el punto de intersección de la perpendicular y la línea posterior de la tercera vena longitudinal como punto B (figura 2B).
      11. Grabar la coordenada x y la coordenada y del punto B, indicado debajo de las Herramientas de selección de área al colocar el cursor en el punto B.
   3. Definición del punto C, punto posterior de la vena
      1. Abra una imagen en la que un punto posterior de la vena está en el centro de la imagen. Haga clic en imagen | Tipo | 8-bit | para convertir la imagen a una imagen de 8 bits.
      2. Punto C se define como el punto más posterior de la línea anterior de la cuarta vena longitudinal en la zona de intersección de la vena posterior y la cuarta vena longitudinal (figura 2).
      3. Grabar la coordenada x y la coordenada y del punto C, indicado debajo de las Herramientas de selección de área al colocar el cursor en el punto C.
   4. Definición de punto D, área de control
      1. Abra una imagen en la que un punto de sensillum campaniformes es en el centro de la imagen. Haga clic en imagen | Tipo | 8 bits | para convertir la imagen a una imagen de 8 bits.
      2. Haga clic derecho en Línea herramientas de selección y dibuje una línea conectando el punto final de la línea anterior de la segunda vena longitudinal y el punto final de la línea posterior de la cuarta vena longitudinal. Definir punto D como el punto de intersección de esta línea y la línea posterior de la tercera vena longitudinal (Figura 2D).
      3. Grabar la coordenada x y la coordenada y del punto D, indicado debajo de las Herramientas de selección de área al colocar el cursor en el punto D.
4. Mediciones de
   1. Abra una de las imágenes de puntos del ala (para medición de punto A, abre la imagen con un punto en el centro). Haga clic en imagen | Tipo | 8 bits | para convertir la imagen a una imagen de 8 bits.
   2. Haga clic en rectángulo en el Área de selección de herramientas y dibujar un rectángulo de aproximadamente 1/9 tamaño de la ventana de imagen.
   3. Haga clic en Editar | Selección | Especificar |. Compruebe la columna Oval y centrado . Escribe 100 (píxeles) en altura y anchura de columnas, escriba las coordenadas x del punto A (o punto B o C del punto) y D en la columna X coordinar y escribir la y coordenadas del punto A (punto B o punto C) y D en la columna Y coordinar . Haga clic en Aceptar.
   4. Haga clic en analizar | Medida |. Si ya se ha terminado la calibración descrita en 5.2, Sao figuran en la columna media .
   5. Calcular ΔODs restando OD del punto D de ODs de puntos A, B y C.
      Nota: Punto D está en una parte transparente de la hoja y no incluye pigmentación y por lo tanto es conveniente para un control de fondo.

Resultados

El período pupal de D. guttifera se divide en 17 etapas (P1 - P15(ii); imágenes de representante de tres etapas (P1, P5 - 6, P10) se muestran la figura 3y 17 todas las etapas se ilustran en la figura 4). Aunque Bainbridge y Bownes¹⁷ reconocidas 20 etapas en D. melanogaster, algunas de estas etapas pueden no aplicarse a D. guttifera. El orden de los dos eventos del desarrollo, l...

Discusión

Describimos aquí los protocolos para la definición de etapas de pupal, eliminación del pupario de observación detallada, duración de etapas de pupal de medición medición de la intensidad de manchas negras sobre un ala en D. guttifera. Estos protocolos pueden ser aplicados para muchos Drosophila y relacionados con mosca de especies, especialmente con la pigmentación de la mariposa.

Profunda observación y descripción de los eventos del desarrollo más detallados permi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article
Plastic vial	Hightech	MKC-30	Plastic vial, for fly stock maintenance
Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials	Fisher Scientific	AS-271	Cellulose plug, for fly stock maintenance
White soft sugar	Mitsui Sugar	J-500g	White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Corn flour	Nippon Flour Mills	F	Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Corn grits - C	Nippon Flour Mills	GC	Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Agar powder	Matsuki Kanten Sangyo	No.602	Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Dry beer yeast	Asahi Food & Healthcare	Y2A	Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Butyl p-hydroxybenzoate	Nacalai Tesque	06327-02	Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Ethanol	Wako	057-00456	Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Flat bottom microtube	Ina Optica	CF-0150	1.5 mL microtube, for collecting pupae
CAPSULEFUGE	Tomy	PMC-060	Mini microcentrifuge, for collecting pupae
Sterilized Schale NB	Sansei Medical	01-013	Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm)
Serum tube rack	Iwaki	9796-050	Used as a moist chamber, for observation of pupa
Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish	Corning	353001	Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm)
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)
Push-pin	Kokuyo	51233709	Push-pin, for making pinholes on the microtube lid
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope, for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera, for imaging
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape, for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps, for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush, for removing puparium
Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate	Merck	665-180	12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods
NaCl	Wako	191-01665	NaCl, for PBS
KCl	Nacalai Tesque	285-14	KCl, for PBS
Na2HPO4·12H2O	Wako	196-02835	Na2HPO4·12H2O, for PBS
KH2PO4	Nacalai Tesque	28721-55	KH2PO4, for PBS
Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0	Edmund Optics	64-384	Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement
ImageJ software	NIH	1.8.0-101	ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov)
FINE FROST glass slide	Matsunami Glass Ind	FF-001	Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing
Square microscope cover glass 18 x 18	Matsunami Glass Ind	C018181	Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing