Méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de Pigmentation de l’aile de Drosophila guttifera

Résumé

Protocoles pour la stadification des périodes nymphales et mesure de la pigmentation de la voilure de Drosophila guttifera sont décrits. Mise en scène et la quantification de la pigmentation fournissent une base solide pour l’étude des mécanismes de développement des traits adultes et permettent la comparaison interspécifique de développement de caractère.

Résumé

Diversifié d’espèces de drosophile (mouche) offrent des possibilités d’étudier les mécanismes du développement et des modifications génétiques responsables des changements évolutifs. En particulier, le stade adulte est une source riche des traits morphologiques pour comparaison interspécifique, y compris la comparaison de pigmentation aile. Afin d’étudier les différences de développement entre les espèces, observation détaillée et mise en scène appropriée sont nécessaires pour comparaison précise. Nous décrivons ici les protocoles de mise en scène des périodes nymphales et quantification de la pigmentation chez un pois drosophile, Drosophila guttiferaaile. Tout d’abord, nous décrivons la méthode d’observation morphologique détaillée et définition des stades nymphales issu des morphologies. Cette méthode comprend une technique pour enlever le puparium, qui est le cas de chitineux externe de la chrysalide, pour permettre l’observation détaillée des morphologies pupes. En second lieu, nous décrivons la méthode pour mesurer la durée des stades nymphales définis. Enfin, nous décrivons la méthode pour la quantification de la pigmentation Escadre basée sur l’analyse d’images à l’aide d’images numériques et logiciels ImageJ. Avec ces méthodes, nous pouvons établir une base solide pour la comparaison des processus de développement des traits adultes stades nymphales.

Introduction

Certains des traits morphologiques de la drosophile sont diversifié en fonction des espèces^1,2,3,4,5. Nous pouvons aborder la question de la diversité morphologique comment se pose en comparant les mécanismes de génération de ces morphologies. Trichomes larvaires, peignes de sexe adulte, appareil génital externe, pigmentation cutanée abdominale et aile pigmentation^6,7,8,9, sont des exemples de ces morphologies ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15}. afin d’étudier les différences morphologiques entre les adultes, observation et analyse des stades nymphales sont importantes, car le sort des traits adultes est déterminé dans les derniers stades larvaires et morphogenèse ultérieure procède au cours de la période nymphale.

Dans des études de biologie du développement de Drosophila melanogaster, « heures CSA » (heures après la formation de la pupe) est la méthode couramment utilisée pour indiquer une chrysalide¹⁶. Ce système emploie temps absolu après formation de la pupe et est très pratique pour des expériences courantes. Cependant, vitesse du développement peut-être différer chez les nymphes et peut être affectée par légères différences génétiques, épigénétiques ou micro-environnementales, et par conséquent avoir le même temps absolu après formation de la pupe ne garantit pas que les nymphes sont dans le même stade de développement. Dans de nombreux cas, les étapes définies par les caractéristiques morphologiques sont préférables pour comparer plusieurs personnes. En particulier, une comparaison entre les espèces nécessite mise en scène précise et comparaison entre les étapes (homologues) correspondantes.

Bainbridge et Bownes¹⁷ reconnu 20 stades nymphales (P1 à P15(ii)) basé sur des caractéristiques morphologiques des pupes de Drosophila melanogaster . Cette mise en scène est le plus largement utilisé de la mise en scène du développement morphologique¹⁸. Dans une étude précédente, nous avons effectué pupal mise en scène de Drosophila guttifera pour établir une base pour aile pigmentation études¹⁹. D. guttifera a pois noir sur ses ailes et est l’un de l’espèce modèle pour aile pigmentation formation²⁰. Bien que nous avons évoqué les critères morphologiques décrits dans le Bainbridge et 'Bownes recherche¹⁷, nous avons mesuré directement durées étape par observations série¹⁹, au lieu d’utiliser Bainbridge et Bownes' estimation de la durée de l’étape de la fréquence observée. Nous décrivons ici la méthode de mise en scène pupe et de mesure des durées des stades nymphales de Drosophila utilisé dans Fukutomi et al.,¹⁹.

Pour étudier le mécanisme du développement de la pigmentation de l’aile, nous avons besoin de savoir quand les stades nymphales ou adultes la pigmentation se produit. Fukutomi et al. ¹⁹ quantifiée des densités optiques (ODs) de pigmentation stades nymphal et adulte par analyse d’image des images de l’aile. La pigmentation des ailes de la drosophile est pensée pour être causée par une accumulation de mélanine noire²¹. Pour la quantification de ces substances, échelle de gris des images et ImageJ logiciel (https://imagej.nih.gov/ij/)²² ont été utilisés. Pour reconnaître et quantifier la pigmentation spot spécifique (ΔOD), nous soustrayons l’OD en dehors d’une place de la Division d’opposition à l’intérieur d’un spot. Pour rendre cette méthode objective et reproductible, les lieux de mesure OD doivent être déterminées en utilisant des veines de l’aile comme points de repère. Dans cet article, nous décrivons en détail cette méthode de dosage de la pigmentation de la voilure dans drosophile guttifera.

Protocole

1. la mouche stock

1. Utiliser Drosophila guttifera pour tous les protocoles suivants.
2. Utiliser des flacons en plastique (diamètre 25 mm x hauteur 96 mm) et bouchons de cellulose (diamètre 23 mm x hauteur 26 mm) pour l’entretien de stocks. Utiliser un aliment standard de la semoule de maïs/sucre/levure/agar et suivre une publication décrit trois autres recettes alternatives pour cette espèce².
   Remarque : d. guttifera (numéro de nomenclature 15130-1971.10) est fourni par l’espèce Drosophila Stock Center à l’Université de Californie, San Diego. Bien que d. guttifera appartient à immigrans-tripunctata rayonnement, qui est lointainement lié à d. melanogaster dans le genre²³, il possède de nombreuses propriétés biologiques en commun avec D. melanogaster . En conséquence, le présent protocole peut être appliqué à de nombreuses espèces de drosophile , bien que certaines espèces ont besoin d’aliments spécifiques et/ou des conseils techniques pour les entretenir².

2. observation de chrysalide et de définition des étapes pupes

Remarque : La chrysalide pour observation est tirée de la mouche stock maintenu avec un 12:12 h de lumière/obscurité cycle à 25 ° C. Bainbridge et Bownes¹⁷ décrit un faible risque de passer des pupes de d. melanogaster de l’endroit original de la nymphose sur un morceau de papier de soie humide (97 % de survie des pupes déplacés 946). Guttifera d. nymphes peuvent être préparés par essentiellement la même méthode.

1. Placer les adultes en bonne santé de la drosophile sur des aliments frais (norme alimentaire de semoule de maïs/sucre/levure/agar) dans un flacon en plastique (diamètre 25 mm x hauteur 96 mm) et qu’ils pondent des œufs. Attendre 7 jours pour obtenir la fin 3e stades.
2. Placer 1 mL de nourriture de semoule de maïs/sucre/levure/gélose standard dans chaque microtubes de 1,5 mL. Faire 3 trous d’épingle avec espacement de 2 mm dans les couvercles des microtubes en pénétrant avec une punaise pour permettre la respiration.
3. Centrifuger les microtubes avec de la nourriture pour 7 s dans une micro-centrifugeuse minie (860 x g).
4. Inverser et tapoter les flacons pour supprimer tous les adultes de la fiole.
5. Versez 5 à 10 mL de ddH₂O (ou inverse eau osmosée) dans le flacon.
6. Versez les larves avec de l’eau dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 90 mm x épaisseur 15 mm). Identifier les stades 3e fin par leur grande taille (3-4 mm de longueur).
7. Déplacez doucement fin 3ème stade larvaire avec une pince dans les microtubes contenant alimentaire (10 larves / microtube). Les incuber pendant la nuit à 25 ° C.
8. Déplacer des nymphes nouvellement formés sur un morceau de papier de soie qui a été mouillé par ddH₂O et placé dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 35 mm x épaisseur 10 mm).
9. Placez la boîte de Pétri dans une chambre humide (contenant 10 mL de ddH₂O en bas) et attendez que la pupe se développer au stade désiré.
10. Déplacer des pupes sur une pièce humide de papier de soie dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 60 mm x épaisseur 15 mm).
    Remarque : La définition des étapes peut surtout être prise en fonction sur les scènes de d. melanogaster¹⁷. En règle générale, la période nymphale de Drosophila peut être classée en P1 - P15(ii), bien que quelques modifications de définition de la scène il faudrait selon l’espèce utilisée. Si possible, enlever le puparium permet l’observation précise et détaillée. Voir détails ci-dessous (étape 3).
11. Observer les nymphes sous un microscope stéréo. Prendre des photos à l’aide d’une caméra numérique attachée au microscope stéréo.

3. Enlever le puparium

NOTE : Les nymphes de drosophile sont couverts par une structure appelée le puparium. Un insecte du Muscomorpha (mouches) n’apporte pas sa cuticule larvaire à la nymphose ; au lieu de cela, il durcit la cuticule après apolyse et l’utilise comme un couvercle de protection de la chrysalide, le puparium²⁴. Une nymphe qui résident à l’intérieur d’un puparium a une cuticule nymphale vraie, qui est très doux et fragile. Avant apolyse se déroule autour de P4(ii), épithéliums et puparium sont attachés ensemble, et donc enlever le puparium sans dommage est très difficile. Après P5, enlevant le puparium est laborieux, mais utile pour l’observation morphologique et définition des étapes pupes. Le processus est effectué comme suit.

1. Apposer un morceau de ruban adhésif double-face sur un morceau de papier absorbant.
2. Placez une nymphe sur la face ventrale du ruban adhésif double-face vers le haut (Figure 1 a).
3. Localiser l’espace entre la paroi antérieure de la puparium et la nymphe interne. Saisir et retirer le puparium autour de cette lacune à l’aide de pinces et exposer la face antérieure de la tête de la nymphe.
4. Insérez l’extrémité d’une pince en le déplaçant parallèlement à l’axe antéro-postérieur. Soulevez la pointe de la pince à rompre localement le puparium. Répétez l’opération jusqu'à ce que la rupture atteigne la partie postérieure de la puparium. Veiller à ce qu’un écart est également formé entre le puparium et jambes pupes et briser la face ventrale de la puparium et minimiser les dommages à la chrysalide interne (Figure 1 b).
5. Après la rupture du puparium autant que possible, retirez la pupe à l’aide d’un pinceau fin (#5/0) (Figure 1).
6. Placez la nymphe sur un morceau de papier de soie qui a été imbibé de ddH₂O et placé dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 60 mm x épaisseur 15 mm). Prendre des photos dès que possible parce que la chrysalide exposée est vulnérable et devienne facilement sec.
   NOTE : Nymphes sans un puparium ne conviennent pas pour mesurer les durées des périodes nymphales (étape 4), parce que stress (par exemple, la dessiccation) et les dommages physiques risquent d’interférer avec le développement normal.

4. mesure de la durée des stades nymphales

1. Préparer les nymphes pour la mesure des durées des stades nymphales tel que décrit à l’étape 2. Recueillir les nymphes de 1-2 et 2-3, 3-4 jours après la formation de pupe (20 nymphes). Donner des numéros d’identification individuels (1-60) à nymphes pour identification. Poursuivre la collecte nouvellement formé des nymphes aux étapes suivantes, afin d’obtenir 20 nymphes jeunes plus. Donner les numéros d’identification individuels (61-80) pour les nymphes nouvellement formés. Placer une nymphe sur un morceau ddH₂O imbibée de papier de soie dans un puits (3,9 cm²) d’une plaque de culture de cellules de 12 puits (1 chrysalide/puits, 12 chrysalides/plaque). Remplir l’espace entre bien des plaques avec les ddH₂O à conserver l’humidité, mettre les couvercles et placer les plaques à 25 ° C, des conditions de luminosité constante (24:0 h lumière/obscurité).
   Remarque : Les nymphes sans un puparium ne sont pas appropriés pour mesurer les durées des périodes nymphales. S’il vous plaît ne pas enlever le puparium.
2. Observez les traits morphologiques y compris couleur de la carrosserie, soies, tubes de Malpighi et corps jaune des chrysalides tous une fois chaque 30 min et consigner observée stades (P1 - P15(ii), basé sur les références^17,19) dans une feuille de pointage.
3. Continuer l’enregistrement pendant quatre jours consécutifs (96 h) par un déplacement rotatif de personnes trois (ou plus).
4. Compter le nombre d’enregistrements de chaque étape particulière et leur moyenne (moyenne nombre d’observations / nymphes). Puis multiplier par 0,5 (h), ayant pour résultat la longueur estimée des stades (h).

5. mesure de l’intensité des taches noires sur une aile

Remarque : L’intensité des taches noires sur une aile de nymphe ou adulte peut être quantifiée en mesurant la densité optique (do). Un filtre en verre avec ODs connus (filtre à densité gradins) est utilisé pour l’étalonnage²⁵, afin qu’on peut calculer le diamètre extérieur d’une zone particulière d’une image numérique d’une aile. On mesure le diamètre extérieur dans un endroit et la Division d’opposition en dehors de l’endroit, et cette dernière est soustraite de l’ancien pour obtenir l’intensité de la tache (ΔOD). Nous décrivons ici la méthode de dissection, de mesure et de calcul des ΔOD. Cette procédure peut être faite après l’étape 2, indépendante de l’étape 3 et l’étape 4. Une fois qu’on comprend tous les stades nymphales et a joué étape 2, on peut directement commencer ou répétez l’étape 5.

1. Préparation de l’image
   1. Préparer une nouvelle nymphe d’une étape de liaison tel que décrit à l’étape 2. Enlever la partie antérieure d’un puparium avec une pince. Retirez la nymphe avec une pincette et placez-le dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, tableau 2) dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 35 mm x épaisseur 10 mm).
   2. Couper le joint basal d’une aile (articulation basale est la partie proximale étroite de l’aile). Comme l’aile est pliée, placez-le dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 35 mm x épaisseur 10 mm) rempli de ddH₂O de la prolonger par la pression osmotique (l’aile se déploie en soi).
   3. Recueillir nouvellement éclos adultes une fois toutes les 10 min d’un flacon de stock. Anesthésier une mouche avec du CO₂ à l’aide d’un tampon anesthésiant de CO₂ , anesthetization pour confirmer l’immobilité et couper le joint basal d’une aile.
   4. Déposer 10 µL de PBS sur une lame de verre, y placer l’aile et recouvrir d’une lamelle couvre-objet (18 x 18 mm).
   5. Allumer la lampe du microscope stéréo. Placez la lampe au niveau maximum. Réglez le diaphragme de l’objectif 11,5 X. Régler le diaphragme à l’état plus ouvert. Mettez l’appareil photo. Régler l’appareil pour être (ISO : 100, mode SHQ 3136 x 2352 pixel, vitesse d’obturation : 1/20 s). Mettre l’accent sur l’échantillon en actionnant le bouton de mise au point du microscope.
   6. Poussez le bouton de l’obturateur de l’unité de contrôle à distance pour prendre une photo. Prendre 3 images par aile, chacun d'entre eux doit être centrée sur une sensille campaniforme, veine longitudinale spot ou postérieur crossvein, positionnement de la partie distale de l’aile sur le côté gauche et la partie antérieure de l’aile sur le dessus.
2. Calibration
   1. Prendre des photos des 9 parties d’un filtre de densité escalier en utilisant les mêmes paramètres de la caméra utilisées pour obtenir l’image de l’aile.
   2. Initier ImageJ logiciel (https://imagej.nih.gov/ij/)²².
   3. Cliquez sur le fichier | Ouvert | puis sélectionnez une des images du filtre densité de gradins.
   4. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
   5. Cliquez sur modifier | Sélection | Spécifiez | et vérifier la colonne ovale et centré . Dans la colonne Y coordonner , écrire 100 (pixels) dans la colonne de largeur , 100 (pixels) dans la colonne de hauteur , 1568 en colonne X coordonner et 1176. Cliquez sur OK.
   6. Cliquez analyser | Mesure |. La valeur de gris « signifie » de certaines zones est mesurés.
   7. 5.2.3 répéter. à 5.2.6. pour les 8 autres images.
   8. Cliquez analyser | Calibrer Rodbard²⁵ en fonction de colonne et sélectionnez inscrire le numéro suivant dans la colonne de droite au milieu (0,04, 0.336, 0,632, 0.928, 1,224, 1.52, 1.816, 2.112, 2,408 ; ces chiffres dépendent de la densité de la a filtre à densité).
   9. Vérifier le calibrage Global colonne, puis cliquez sur OK.
      Remarque : En effectuant cette procédure, « signifie la valeur de gris » est converti en « densité optique (do) » en utilisant la fonction Rodbard. Après cette étape, densité optique peut être calculée pour un domaine particulier sélectionné dans les logiciels ImageJ.
3. Choisir la zone de mesure
   NOTE : Les taches sont généralement associés à monuments, tels que des sensilles campaniformes, veine longitudinale trucs et crossveins. Ces et autres points de repère sur une aile peuvent servir à choisir la région de mesures. Ici, un exemple enD. guttifera(Figure 2) est décrite.
   1. Définition du Point A, point sensille campaniforme.
      1. Ouvrez une image dans laquelle un spot de sensille campaniforme est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
      2. Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle. Définissez le vertex supérieur gauche du rectangle afin qu’il est attaché à la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième et plus distale d’une tache de sensille campaniforme. La valeur du côté droit du rectangle afin qu’il se trouve à droite de la sensille campaniforme spot.
      3. Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |. Vérifier la colonne Afficher tout .
      4. Cliquez sur outil de l’Angle dans les Outils de sélection de ligne. Dessiner la première ligne sur la ligne postérieure du troisième veine longitudinale. Définissez les points de terminaison gauche de la ligne sur le sommet du rectangle dessiné à l’étape 1. Dessiner la deuxième ligne du côté supérieur du rectangle. Appuyez sur la touche « m » pour mesurer l’angle entre les deux lignes tracées dans cette étape. Cliquez sur la fenêtre de l’image sur l’écran de l’ordinateur.
      5. Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
      6. Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 la taille de la fenêtre d’image. Cliquez sur modifier | Sélection | Faire pivoter |. Écrire les moins degrés de l’angle mesuré à l’étape 5.3.1.4. Angle de colonne et cliquez sur OK pour faire pivoter le rectangle dessiné dans cette étape.
      7. Déplacez le rectangle dessiné à l’étape 5.3.1.6. en utilisant les touches fléchées. Définir le point de terminaison de la ligne postérieure de la deuxième veine longitudinale sur le côté gauche du rectangle et le côté inférieur du rectangle relié à la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième. Confirmer qu’une ligne perpendiculaire à partir du point de terminaison de la deuxième veine longitudinale à la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième est attirée dans cette procédure. Définir le pied de la ligne verticale sous le Point A (Figure 2 a).
      8. Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point A, ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point A.
   2. Définition du Point B, veine longitudinale Astuce tache
      1. Ouvrez une image dans laquelle une veine longitudinale Astuce tache est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
      2. Répéter la procédure décrite à l’étape 5.3.1. (Définition de A, campaniformes sensille spot) pour trouver un Point de l’image.
      3. Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
      4. Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle. Définissez le vertex supérieur gauche du rectangle à la fin de la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième.
      5. Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
      6. Cliquez sur outil de l’Angle dans les Outils de sélection de ligne. Dessiner la première ligne pour relier le Point A et le point final de la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième. Définir cette ligne comme la ligne A. dessiner la deuxième ligne du côté supérieur du rectangle dessiné à l’étape 5.3.2.4. Appuyez sur la touche « m » pour mesurer l’angle entre les deux lignes.
      7. Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
      8. Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 la taille de la fenêtre d’image. Cliquez sur modifier | Sélection | Faire pivoter |. Écrire les moins degrés de l’angle mesuré à l’étape 5.3.2.6. Angle de colonne et cliquez sur OK pour faire pivoter le rectangle dessiné dans cette étape. Déplacer le rectangle en utilisant les touches fléchées. Définir le côté supérieur du rectangle afin qu’il est attaché à la ligne A et le point final de la ligne antérieure de la quatrième veine longitudinale afin qu’il soit sur le côté gauche du rectangle.
      9. Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
      10. Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 la taille de la fenêtre d’image. Cliquez sur modifier | Sélection | Faire pivoter |. Écrire les moins degrés de l’angle mesuré à l’étape 6 en Angle de colonne, puis cliquez sur OK pour faire pivoter le rectangle dessiné dans cette étape. Déplacer le rectangle en utilisant les touches fléchées. Définissez le sommet inférieur gauche du rectangle afin qu’il soit au sommet supérieur gauche du rectangle dessiné à l’étape 5.3.2.8. qui aboutiront à l’obtention de la ligne verticale partir du point de terminaison de la ligne antérieure de la veine longitudinale quatrième ligne A. définir la point d’intersection de la ligne verticale et la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième Point b (Figure 2 b).
      11. Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point B, a indiqué ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point B.
   3. Définition du Point C, tache postérieure crossvein
      1. Ouvrez une image dans laquelle une tache postérieure crossvein est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
      2. Définir le Point C comme le point le plus postérieur de la ligne antérieure de la quatrième veine longitudinale dans la zone d’intersection de la crossvein postérieure et la quatrième veine longitudinale (Figure 2).
      3. Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point C, ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point C.
   4. Définition de Point D, zone de contrôle
      1. Ouvrez une image dans laquelle un spot de sensille campaniforme est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
      2. Cliquez à droite dans les Outils de sélection de ligne et tracer une ligne reliant le point de fin de la ligne antérieure de la deuxième veine longitudinale et l’extrémité de la ligne postérieure de la quatrième veine longitudinale. Define Point D comme le point de passage de cette ligne et la ligne postérieure de la troisième veine longitudinale (Figure 2D).
      3. Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point D, ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point D.
4. Mesures
   1. Ouvrez une des images des spots d’aile (pour mesure du Point A, ouvrez l’image avec un Point au centre). Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
   2. Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 taille de la fenêtre d’image.
   3. Cliquez sur modifier | Sélection | Spécifiez |. Vérifier la colonne ovale et centré . 100 (pixels) dans les colonnes de largeur et de hauteur , écrire les coordonnées en x du Point A (ou B Point ou Point C) et D dans la colonne X coordonner et écrire l’y coordonnées du Point A (Point B ou Point C) et D dans la colonne Y coordonner . Cliquez sur OK.
   4. Cliquez analyser | Mesure |. Si l’étalonnage mentionné au point 5.2 est déjà terminée, ODs sont indiqués dans la colonne moyenne .
   5. Calculer ΔODs en soustrayant OD du Point D de ODs des Points A, B et C.
      NOTE : Point D se trouve dans une partie transparente de l’aile et n’inclut pas de pigmentation et par conséquent est approprié pour un contrôle de fond.

Résultats

La période de pupe de d. guttifera est divisée en 17 étapes (P1 - P15(ii) ; images représentant trois stades (P1, P5 - 6, P10) sont indiquées Figure 3et 17 toutes les étapes sont illustrées à la Figure 4). Que Bainbridge et Bownes¹⁷ reconnu 20 étapes chez d. melanogaster, certaines de ces étapes ne pourraient pas s’appliquer aux d. guttifera. L’ordre des deux évé...

Discussion

Nous décrivons ici les protocoles pour la définition des étapes pupes, enlevant le puparium pour l’observation détaillée, mesure des durées des stades nymphales et mesure de l’intensité des taches noires sur une aile dans d. guttifera. Ces protocoles peuvent être appliquées pour les nombreux Drosophila et des espèces, en particulier les espèces avec la pigmentation de l’aile.

Observation approfondie et une description plus détaillées des événements du dé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article
Plastic vial	Hightech	MKC-30	Plastic vial, for fly stock maintenance
Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials	Fisher Scientific	AS-271	Cellulose plug, for fly stock maintenance
White soft sugar	Mitsui Sugar	J-500g	White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Corn flour	Nippon Flour Mills	F	Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Corn grits - C	Nippon Flour Mills	GC	Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Agar powder	Matsuki Kanten Sangyo	No.602	Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Dry beer yeast	Asahi Food & Healthcare	Y2A	Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Butyl p-hydroxybenzoate	Nacalai Tesque	06327-02	Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Ethanol	Wako	057-00456	Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Flat bottom microtube	Ina Optica	CF-0150	1.5 mL microtube, for collecting pupae
CAPSULEFUGE	Tomy	PMC-060	Mini microcentrifuge, for collecting pupae
Sterilized Schale NB	Sansei Medical	01-013	Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm)
Serum tube rack	Iwaki	9796-050	Used as a moist chamber, for observation of pupa
Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish	Corning	353001	Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm)
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)
Push-pin	Kokuyo	51233709	Push-pin, for making pinholes on the microtube lid
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope, for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera, for imaging
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape, for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps, for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush, for removing puparium
Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate	Merck	665-180	12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods
NaCl	Wako	191-01665	NaCl, for PBS
KCl	Nacalai Tesque	285-14	KCl, for PBS
Na2HPO4·12H2O	Wako	196-02835	Na2HPO4·12H2O, for PBS
KH2PO4	Nacalai Tesque	28721-55	KH2PO4, for PBS
Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0	Edmund Optics	64-384	Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement
ImageJ software	NIH	1.8.0-101	ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov)
FINE FROST glass slide	Matsunami Glass Ind	FF-001	Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing
Square microscope cover glass 18 x 18	Matsunami Glass Ind	C018181	Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing