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Resumen

El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.

Resumen

El circuito del marcapasos circadiano orquesta rítmicas salidas conductuales y fisiológicas coordinadas con señales ambientales, tales como ciclos de día/noche. El reloj molecular dentro de cada neurona de marcapasos genera ritmos circadianos en la expresión génica, que subyacen a las funciones neuronales rítmicas esenciales para el funcionamiento del circuito. Investigación de las propiedades de los osciladores moleculares individuales en diferentes subclases de las neuronas marcapasos y su interacción con la señalización neuronal produce una mejor comprensión del circuito del marcapasos circadiano. Aquí, presentamos un enfoque de Time-lapse microscopia fluorescente desarrollado para controlar el mecanismo molecular en las neuronas reloj del culto cerebro larvas de Drosophila . Este método permite la grabación de varios día de los ritmos de reporteros circadianos fluorescentes genéticamente codificados en resolución unicelular. Esta configuración puede combinarse con manipulaciones farmacológicas a analizar de cerca la respuesta en tiempo real del reloj molecular para varios compuestos. Más allá de los ritmos circadianos, este método polivalente en combinación con potentes técnicas de genética de la Drosophila ofrece la posibilidad de estudiar diversos procesos neuronales o moleculares en el tejido vivo cerebral.

Introducción

Relojes circadianos ayudan a los organismos para adaptarse a los cambios ambientales periódicos generados por la rotación de 24 h de la tierra. Los circuitos de retroalimentación transcripcional y traduccional enclavijado comúnmente subyacen la maquinaria molecular de los relojes circadianos a través de especies1. El circuito del marcapasos circadiano compuesto de reloj que contiene neuronas integra información de hora del día, transmitido por las señales ambientales, como luz/oscuridad (LD) y ciclos de temperatura, a coordinar los ritmos de una plétora de diario fisiológico y procesos conductuales2,3. La coordinación de ritmos moleculares neuronales entradas y salidas es críticamente importante para el funcionamiento del circuito circadiano pero sigue siendo sólo parcialmente entendida.

En Drosophila, en el centro del reloj molecular, el heterodímero/ciclo de reloj (CLK/CYC) activa la transcripción del período (por) y timeless (tim). PER y TIM forman un complejo y entrar en el núcleo, donde inhiben la actividad transcripcional de CLK/CYC y en consecuencia su propia transcripción. Reglamentos postranscripcional y poste-de translación causan retrasos entre CLK/CYC-mediada por transcripción y represión por / TIM, asegurando la generación de alrededor de 24-h oscilaciones moleculares1,3,4 . Unos 150 neuronas que contiene estos relojes moleculares forma un circuito para control circadiano comportamiento de adulto vuela5. Un mucho más simple pero totalmente funcional circadiano circuito que consiste en 3 grupos de neuronas reloj - 5 las neuronas laterales ventrales (LNvs; 4 LNvs PDF-positivo y uno negativo PDF LNv, ver abajo), 2 Dorsal neurona 1 (DN1s) y 2 2s Dorsal de neuronas (DN2s) - está presente en las larvas cerebro de6,7.

El simple circuito circadiano larvas ofrece un excelente modelo para estudiar las interacciones entre la comunicación inter neuronal y el mecanismo molecular. Usando nuestro nuevo reportero fluorescente por TDT, que imita los niveles de proteína y su localización subcelular, se intentó caracterizar la dinámica de la mecánica molecular en subgrupos de reloj diferentes neuronas en el circuito circadiano larvas 8. conocer el papel fundamental del factor de dispersión de pigmento neuropéptido (PDF) producido por 4 LNvs en la regulación de los ritmos circadianos en el nivel neuronal9,10,11, además, queríamos examinar el directo efecto de PDF sobre los relojes moleculares. Para ello, se desarrolló un método para controlar la expresión de genes circadianos ritmos en cerebro larvas presentaron durante varios días por microscopia confocal Time-lapse. El protocolo fue adaptado también para que Ensayos farmacológicos probar el efecto de PDF u otros compuestos en el nivel de la por-TDT. Así, la adaptación consiste en hacer accesible al uso de la droga la cultura de explante de cerebro, aumentando la resolución temporal y proyección de imagen para una duración más corta.

Ex vivo la cultura del cerebro de Drosophila de diferentes etapas de desarrollo han sido previamente establecidas12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando que estos protocolos se han utilizado para la proyección de imagen distintos fenómenos biológicos, algunos de ellos no son compatibles con la proyección de imagen en resolución unicelulares o no apoyo la cultura por más de varias horas. Métodos alternativos para realizar proyección de imagen a largo plazo de vivo de neuronas circadianas en Drosophila incluyen proyección de imagen de bioluminiscencia de ritmos molecular19,20,21 y proyección de imagen de fluorescencia de indicador de calcio con microscopia de luz hoja22,23. Aunque proyección de imagen de bioluminiscencia puede conseguir mayor resolución temporal y microscopía de luz de hoja puede ser adaptable para proyección de imagen en vivo , están limitadas en la resolución espacial y requieren sistemas especializados de microscopio.

El método descrito aquí está diseñado para visualizar señales fluorescentes en la cultura de todo el cerebro unicelular resolución durante varios días. Este método fácil y versátil puede adaptarse a cerebros de mosca adulta imagen cultivada y para experimentos farmacológicos estudiar diferentes problemas en Neurobiología de la Drosophila .

Protocolo

1. preparación de soluciones Stock bajo una campana de cultura

  1. Preparar 400 mL de 1 x medio activo Schneider (SAM) optimizado para cultivo ex vivo de cerebros larvales (modificado de referencia24,25) (tabla 1). Alícuota de 5 mL y flash congelar en nitrógeno líquido (LN2), tienda a - 80 ° C.
  2. Preparar 1 x disecante solución salina (DSS) por dilución 10 x solución (modificado de referencia26) (tabla 2).
  3. Fibrinógeno alícuota de 10 mg y almacenar a 4 ° C para un solo uso.
    PRECAUCIÓN: Pesar fibrinógeno bajo cabina de flujo laminar, con guantes, ya que es perjudicial.
  4. Preparar la solución stock de trombina en SAM (NIH 1500 unidad/mg) y alícuotas de 10 μl, flash freeze en LN2 y mantener a-80 ° C.
    PRECAUCIÓN: Lleve guantes al manipular la trombina ya que es perjudicial.
  5. Alícuota de solución madre de 100 x penicilina-estreptomicina. Mantener a-20 ° C.
  6. Corta círculos de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) (véase tabla de materiales) al tamaño que se ajusta dentro de un plato de fondo de cristal. Enjuague en el 70% EtOH y luego esterilizado dH2O. esterilizar y secar bajo cabina de flujo laminar con UV. Mantenga en una placa Petri estéril. Uso individual.
    Nota: El PTFE es una membrana flexible porosa que permite el intercambio de gases y evita que el medio de evaporación durante la grabación a largo plazo.

2. configuración de microscopia Time-lapse

Nota: La siguiente configuración es para un microscopio confocal tándem escáner invertido (véase tabla de materiales) equipada con un escáner de resonancia (8.000 Hz). El sistema incluye un detector muy sensible Foto-multiplicador, que junto con el escáner de resonancia previene la fototoxicidad y photobleaching. Temperatura y humedad son controladas dentro de una cámara microscopio (véase Tabla de materiales) que cubre la mayor parte del microscopio.

  1. Coloque una cámara de humedad de la etapa superior.
  2. Activar los controladores de temperatura y humedad para equilibrar la cámara microscopio a 25 ° C y 80% de humedad.
  3. Para realizar experimentos en la oscuridad constante (DD), cubre la cámara microscopio con un paño opaco (a menos que la cámara del microscopio está hecha de un material opaco).
  4. Si utiliza un objetivo de inmersión en agua, colocar un dispensador de Micro de inmersión de agua sobre el objetivo y programa un protocolo con el software de controlador de Autoimmersion objetivo para dispensar agua a un ritmo constante durante la proyección de imagen de Time-lapse.
    Nota: Se recomiendan objetivos de inmersión en agua junto con un dispensador de agua o seco objetivo para largo plazo en la proyección de imagen, como otro tipo de medio de inmersión se seque.
  5. Coloque el soporte de una placa de Petri en el escenario, dentro de la cámara de humedad.
  6. Inicie el software del microscopio y seleccione el modo de escáner resonante desde el primer cuadro de diálogo. Seleccione Aceptar para iniciar la etapa cuando se le solicite. Ir a ficha Configuración y a la configuración de Hardware para conectar las líneas de láser pertinentes.
  7. Ir a ficha de adquisición y al panel XY para seleccionar modo bidireccional y conjunto imagen parámetros de adquisición.
    Nota: La descrita imagen Configuración presentada aquí (figura 2, figura 3 y 1 película) está optimizada para observar la expresión circadiana de reporteros fluorescentes específicos. Los siguientes parámetros fueron elegidos para encajar nuestras especificaciones: 40 X objetivo de inmersión, promedio de línea X 8 con resolución de imagen de 512 × 512 de agua. Imágenes multicolor, adquisición de imágenes secuenciales se requiere cuando la longitud de onda de la emisión de un fluoróforo y la longitud de onda de excitación de otra superposición (aquí, longitudes de onda de emisión de proteína fluorescente amarilla (YFP) y superposición de excitación de tomate). Elegir el modo secuencial "entre pila" ya que es el más rápido y el movimiento de las neuronas reloj es insignificante durante la adquisición de una pila de Z. Configuración de microscopía deben adaptarse para satisfacer el objetivo de cada experimento.

3. configuración de la cultura de explante de cerebro larvas

Nota: Todo el procedimiento de disección a la incrustación de los explantes de cerebro tarda ~ 30 minutos.

  1. Preparación de los reactivos bajo una campana de cultura.
    1. Descongelar una alícuota de la trombina y mantener a temperatura ambiente hasta el paso de empotrar (paso 3.3). Uso individual.
    2. Descongelar rápidamente una alícuota de SAM a 37 ° C y mantener en hielo para un solo uso.
    3. Añadir a SAM a una alícuota de 10 mg de fibrinógeno 10 mg/ml, mueva suavemente e incubar a 37 ° C durante al menos 30 minutos y durante el paso de empotrar (paso 3.3). Uso individual.
      Nota: No incubar la solución de fibrinógeno más de 2 h empieza a polimerizar.
    4. Descongelar una alícuota de 100 acciones de x penicilina-estreptomicina. Preparar 2,5 mL de SAM que contiene 1 x penicilina-estreptomicina (SAM/antibióticos). Mantener a temperatura ambiente.
      Nota: Stock de tienda los restantes 100 x penicilina-estreptomicina a 4 ° C hasta 1 mes.
    5. Preparar una alícuota de 500 μl del SAM restantes. Mantener en hielo.
    6. Para la proyección de imagen a largo plazo, aplicar grasa para vacío en autoclave a la parte de plástico de la parte inferior del plato de fondo de cristal (figura 1A) y esterilizar bajo cabina de flujo laminar con UV.
  2. Disección de la cuerda del nervio del sistema nervioso central y ventral.
    1. Limpie las pinzas y 2 x cristal bien tres platos de disección con el 70% EtOH. Verter 400 μL de DSS en pozos de 4 y 400 μL de SAM en un pozo. Mantener en hielo.
    2. Sacar medio mosca que contiene larvas y escoger no vagando larvas de estadio 3 (L3) con pinzas. Enjuagar sucesivamente en 2 pozos llenos de DSS. Mantenerlos en el pozo 3 lleno de DSS en el hielo que anestesia las larvas.
      Nota: L3 dura aproximadamente 2 días a 25 ° C. Para observar el cerebro en tiempo fisiológicamente relevante hemos optado por utilizar larvas L3 no errante. Otros subgrupos de neuronas reloj, tales como l-LNvs y DN3s, comienzan a formarse en la fase L3 que vaga pero aún no están necesariamente ciclismo (datos no mostrados). Por lo tanto, aunque es posible imagen ciclismo las neuronas reloj en esta etapa (datos no mostrados), es importante distinguir cuidadosamente las neuronas reloj larvas ya funcional de los análisis de datos desarrollo de. Errantes no L3 aparecen aproximadamente de 4 a 4,5 días después ponedora a 25 ° C. Para utilizar este protocolo para el estudio de los ritmos circadianos, sincronizar (arrastrar) el convertirse larvas en 12 h/12 h LD ciclos a 25 ° C durante 3 días antes de recoger las larvas L3.
    3. Diseccionar cerebros larvales con pinzas finas en el pozo lleno de DSS 4, que no se ha utilizado para el enjuague de larvas, utilizando el método de adentro hacia fuera27.
      1. Brevemente, corte la larva dos, suavemente pellizcar los ganchos de la boca con un par de pinzas y ruede para arriba de adentro hacia afuera la pared del cuerpo con el otro par de pinzas, exponiendo el cerebro. Libre el cerebro cortando a la tráquea y los nervios que se conectan con el resto del cuerpo.
      2. Aspire el cerebro en 3 μl de DSS con una pipeta de 20 μl (que han sido enjuagada con DSS) y dispensar en el pozo lleno de SAM. Repita el procedimiento para cerebros hasta 7.
        Nota: La disección debe realizarse sobre una superficie fría para mantener las larvas anestesiadas y el cerebro refrigerado. Por ejemplo, colocar el plato de la disección en un bloque de enfriamiento conectado a una bomba para circular el agua bien fría. La disección procedimiento toma 30 s por cerebro. Es importante mantener los discos imaginal ojo/antenal conectados al cerebro y la médula ventral del nervio intacta. Estas piezas se dañan el cerebro y reducir la calidad de la cultura. También, Evite exponer el cerebro al aire. Antes de aspirar el primer cerebro, pipetear arriba y abajo de los DSS que contiene piezas de las larvas disecadas, ya que evita que el cerebro se adhiera a la pared de la punta.
  3. Inclusión de los explantes de cerebro en una matriz 3D y montaje (~ 20 min).
    1. Sumerja un cerebro disecado en la solución de trabajo de fibrinógeno (~3.3 de final de la concentración de fibrinógeno mg/mL, 10.5 μl por cerebro) como sigue:
    2. Aspirar 3.5 μl de SAM/antibióticos (con la punta del mismo utilizada en el punto 3.2.3). Aspirar un cerebro disecado de la disección en la misma punta de pipeta sin dispensar el medio SAM/antibióticos en la punta.
    3. Dispensar el cerebro y el medio en la tapa de una placa de Petri estéril. Añadir otro 3.5 μl de SAM/antibióticos y 3.5 μl de solución de 10 mg/mL caliente fibrinógeno/SAM en la gota que contiene el cerebro. Mezcle suavemente la solución alrededor del cerebro mediante pipeteo con una pipeta de 20 μl.
      Nota: Usando una pipeta, en lugar de fórceps en este paso evita haciendo hincapié en el cerebro.
    4. Tomar 2 μl de la solución de trabajo de fibrinógeno de la gota y aplique sobre el cubreobjetos de vidrio plato inferior como un pequeño círculo. Añadir 0,8 μl de trombina y mezclar rápidamente con una punta de pipeta. El fibrinógeno se convierte en fibrina y comienza a polimerizar.
    5. Tomar el cerebro que se encuentra en el fibrinógeno solución (paso 3.3.1) entre un par de pinzas y colocarlo en la matriz una vez que un blanco de la matriz de fibrina es visible. Orientar la parte anterior del cerebro hacia abajo (para proyección de imagen las neuronas reloj). Empújela hacia abajo lo más cerca posible al cubierta de vidrio. Coágulo de fibrina se compone de capas de fibrina. Escoger una capa y doble en la parte superior del cerebro con movimientos suaves y pequeños sin extraer la matriz.
      1. Repita 2 a 3 veces de diferentes partes del coágulo para estabilizar el cerebro.
        Nota: Al manipular el cerebro con pinzas, tenga cuidado de no secar o se impone un estrés físico.
    6. Añadir 20 μl de SAM/antibióticos en la parte superior del cerebro incrustado para detener la acción de la trombina.
    7. Repita el procedimiento para montar los cerebros restantes. Es posible incorporar hasta 5 a 6 cerebros en un plato de fondo de cristal.
    8. De largo plazo en la proyección de imagen, añadir 600 μl de SAM/antibióticos en el pozo interior (la parte de vidrio). Colocar una membrana PTFE corta encima de la media y pegarla a la grasa para vacío aplicado en la parte de plástico de la parte inferior (3.1.5) (figura 1A).
    9. Para los ensayos farmacológicos, llene el plato con 2 mL de SAM/antibióticos (figura 1B).
      Nota: Es muy importante evitar la evaporación del medio, ya que la osmolalidad del medio es fundamental para la viabilidad de las neuronas. Por lo tanto, para los experimentos de proyección de imagen a largo plazo, es necesario sellar la placa de cultivo con membrana de PTFE. Mientras que para los experimentos a corto plazo, membrana de sellado no es necesaria siempre y cuando el plato se llena con 2 mL de medio y controlado en una cámara humidificada.

4. adquisición de la imagen Time-lapse

  1. Coloque el plato de fondo de vidrio en el soporte del plato de Petri dentro de la cámara de humedad de la etapa superior.
  2. Ir al panel de z-stack en la pestaña de adquirir y fijar los pasos de la sección de z desde el software del microscopio (2 μm × 40 en los experimentos se muestra en la figura 2 y figura 3y 1 película). Establece el principio de una pila de z en el plano más alejado el cubreobjetos y el final en la superficie del explante cerebro, cerca del cubreobjetos. Aunque los movimientos cerebrales son insignificantes, añadir secciones z extras al principio y al final de la pila de z.
  3. Ir a marcar y encontrar instalación y panel de adquisición de imagen de múltiples posiciones. Con el objetivo de X 40, 1 hemisferio del cerebro puede ser capturado dentro de un campo de visión
  4. Ir a panel de modos de adquisición y selección xyzt (Time-lapse z-stack). Ir al panel de tiempo de adquisición y definir los parámetros de intervalo y la frecuencia de tiempo preferido.
    Nota: Adquisición de imágenes de Time-lapse con frecuencia deseada. Tenga en cuenta que a largo plazo en la proyección de imagen (24-72 h) con intervalo de lapso de tiempo más corto que 2 h tiende a resultados en menos neuronas ciclismo, probablemente debido a que reduce la viabilidad de las neuronas. El volumen de datos se expande como la tasa de aumento de adquisición de imagen, que hace el almacenamiento y análisis de datos más difícil.

5. farmacológico tratamiento de explantes de cerebro con viva imagen a corto plazo

Nota: El siguiente procedimiento es esencialmente el mismo que para la proyección de imagen a largo plazo pero requiere una membrana PTFE. Para evitar exponer a los cerebros para luz azul cuando el producto químico se agrega a la cultura, el microscopio debe colocarse en el cuarto oscuro con luz roja.

  1. Ir al panel de tiempo de adquisición y establecer el intervalo de tiempo deseado y el número de análisis para obtener los datos de línea de base antes de la aplicación de la droga. Iniciar el análisis.
  2. Después de la línea de base se ha completado la exploración, levante la cabeza de exploración de la sistema del microscopio. Retire la tapa del regulador de humedad de la etapa superior y con mucho cuidado retire la tapa del plato de fondo de vidrio sin moverla.
  3. Retire la cantidad apropiada de medio de cultivo si es necesario. Añadir la solución experimental en el medio y, con cuidado y muy suavemente, mezclar con una pipeta Pasteur estéril sin tocar los explantes de cerebro.
    Nota: Para aplicación de baño de PDF, utilice 2 μm PDF solución (en 10% DMSO).
  4. Vuelva a colocar las tapas del plato de fondo de cristal y la cámara húmeda y el jefe de exploración. Si se utiliza, volver a colocar el paño opaco negro alrededor de la cámara de microscopio.
  5. Compruebe si los cerebros están en sus posiciones originales en el modo de escaneado. Ajustar si es necesario.
  6. Ir al panel de tiempo de adquisición y establecer el intervalo de tiempo deseado y el número de análisis. Iniciar el análisis.
    Nota: Aquí hemos probado Time-lapse imágenes obtenidas cada hora durante un máximo de 10 h.

Resultados

Presentamos los resultados representativos de la grabación a largo plazo de un reportero fluorescente circadiano en ex vivo cerebro larvas cultura y los resultados de imagen vivo de PDF baño aplicación para la expresión del reportero.

Larvas L3 vagando por no expresar el reportero reloj molecular por TDT y la UAS-mCD8::YFP conducido por un conductor de neurona de reloj Clk 856-gal4 (fig...

Discusión

Aquí describimos el método de largo plazo de microscopía de fluorescencia Time-lapse de cerebros larvas cultivados. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, tales como la salud de la cultura, método para la inmovilización del explante de cerebro, la intensidad de fluorescencia y relación señal a ruido de la reportera, temporal y resolución espacial, y accesibilidad para el explante. Estos factores pueden ser mutuamente excluyentes. Por ejemplo, aumento de frecuencia de lapso de tiemp...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Michael Rosbash por su asesoría y apoyo durante la fase inicial del desarrollo de este método. Este trabajo fue financiado por el PRESTO JST programa, la Fundación Nacional Suiza de ciencia (31003A_149893 y 31003A_169548), el Consejo Europeo de investigación (ERC-StG-311194), Fundación Novartis para la investigación biomédica médica (13A39) y la Universidad de Ginebra .

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
KH2PO4Sigma-AldrichP5655I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2Sigma-AldrichC7902
MgSO4.7H2OSigma-Aldrich230391
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
D-(+) GlucoseSigma-AldrichG7021
Yeast extractSigma-AldrichY1000
InsulinSigma-AldrichI0516-5ML
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
BIS-TRISSigma-AldrichB4429
L-(−)-Malic acidSigma-AldrichM7397
D-(+)-Trehalose dihydrateSigma-AldrichT0167
Succinic acidSigma-AldrichS9512
Fumaric acidSigma-AldrichF8509
α-Ketoglutaric acidSigma-AldrichK1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screenedBioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4E&K Scientific ProductsEK-654011
KClSigma-AldrichP5405
NaH2PO4Sigma-AldrichS5011
SucroseSigma-AldrichS7903
Fibrinogen from bovine plasmaCalbiochem (Merck)341573-1GMCAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasmaSigma-AldrichT9549CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OHChi Scientificcustom made
Vaccum greaseSigma-Aldrich18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishesfisherscientific08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μmMilliporeSCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filmDupont200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMilliporeSLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMilliporeSLGV033RS
Three-well glass dissection dishAny company
Fine forceps, size 5, DumontFine Science Tools11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectorsLeica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamberLife Imaging ServicesThe CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controllerLife Imaging Servicescustom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller softwareLeica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift pluginImageJ software
10x iterative deconvolutionAutoQuant and Imaris software

Referencias

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