JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Özet

Sirkadiyen kalp pili devre gündüz/gece döngüsü gibi çevre yardımlar ile koordine ritmik davranış ve fizyolojik çıkış orchestrates. Her kalp pili nöron içinde moleküler saat sirkadiyen ritim ritmik nöronal işlevleri devre çalışması için gerekli altında yatan gen ekspresyonu oluşturur. Kalp pili nöronların farklı alt sınıfları içinde bireysel moleküler osilatörler ve nöronal sinyal ile etkileşimlerini özelliklerinin incelenmesi sirkadiyen kalp pili devre daha iyi bir anlayış verir. Burada, saat nöronların beynin kültürlü Drosophila larva moleküler saat izlemek için geliştirilen bir hızlandırılmış floresan mikroskopi yaklaşım mevcut. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükte genetik olarak kodlanmış floresan sirkadiyen gazetecilere ritimler çok günlük kaydı sağlar. Bu kurulum yakından moleküler saat gerçek zamanlı yanıt çeşitli bileşikler olarak analiz etmek için farmakolojik manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Sirkadiyen ritim, çok amaçlı bu yöntem güçlü Drosophila genetik teknikleri ile birlikte canlı beyin dokusunun farklı nöronal veya moleküler işlemde çalışma imkanı sunmaktadır.

Giriş

Sirkadiyen saatler organizmaların dünya 24 h döndürme tarafından oluşturulan Periyodik çevresel değişikliklere uyum yardımcı. Hatırlayan translasyonel transkripsiyon geribesleme döngüsü yaygın tür1arasında moleküler makineler sirkadiyen saatler altında yatan. Sirkadiyen kalp pili devre oluşur saat içeren nöronlar entegre açık/koyu (LD) ve günlük bir bolluk ritimlerin yönetmek için sıcaklık döngüsü gibi çevre yardımlar ifade zaman günün bilgi fizyolojik ve davranışsal işlemleri2,3. Moleküler ritimleri nöronal girişleri ve çıkışları ile koordinasyon kritik sirkadiyen devre ama sadece kısmen anladım kalır çalışması için önemlidir.

Drosophilaiçinde moleküler saat özünde saat/döngüsü (CLK/CYC) heterodimerdir dönemi (başı), transkripsiyonu etkinleştirir ve zamansız (tim). BAŞINA ve TIM bir kompleks oluştururlar ve çekirdeği, nerede onlar transkripsiyon etkinlik CLK/CYC ve sonuç olarak kendi transkripsiyonu inhibe girin. Çoğu ve translasyon düzenlemeler CLK/CYC-aracılı transkripsiyon ve baskı başına arasında gecikmelere neden / TIM yaklaşık 24-h moleküler titreşimler1,3,4 nesil sağlanması, . Yaklaşık 150 nöronlar bu moleküler saat formu içeren bir devre yetişkin denetimi sirkadiyen davranışı için5uçar. Saat nöronların - 5 ventral yanal nöronlar (LNvs; 4 PDF-pozitif LNvs ve aşağıya bakın bir PDF-negatif LNv), 2 Dorsal nöron 1s (DN1s) ve 2 Dorsal nöron 2s (DN2s) - 3 grupları oluşan bir çok basit henüz tam olarak işlevsel sirkadiyen devre larva mevcuttur beyin6,7.

Basit larva sirkadiyen devre arası nöronal iletişim ve moleküler saat arasındaki etkileşimler eğitim için mükemmel bir model sunuyor. Hangi düzeyde protein ve hücre altı konumu başına taklit eder, yeni geliştirilen floresan muhabirimiz başına-TDT, kullanarak farklı saat nöron gruplarının larva sirkadiyen devre moleküler saat dinamikleri karakterize istedi 8. Ayrıca, peptit pigment Dispergatör faktörü (PDF) rolünün sirkadiyen ritim nöronal düzeyde9,10,11düzenlenmesinde 4 LNvs tarafından üretilen bilmek, biz doğrudan incelemek istedim Moleküler saatler PDF etkisi. Bu amaçla, biz sirkadiyen gen ekspresyonu ritimleri larva beyin olarak birden fazla gün içinde tarafından hızlandırılmış confocal mikroskopi explant izlemek için bir yöntem geliştirdi. Protokol ayrıca PDF ya da diğer bileşikler etkisi başına TDT düzeyinde test etmek farmakolojik deneyleri için uyarlanmıştır. Böylece, beyin explant kültür ilaç uygulama erişilebilir hale getirme, zamansal çözünürlük artırmak ve daha kısa bir süre için Imaging uyum oluşur.

Ex vivo kültür, Drosophila beyinlerinin farklı gelişim aşamalarında,-si olmak be daha önce kurulan12,13,14,15,16,17 ,18. Bu protokoller çeşitli biyolojik olayları görüntüleme için kullanılmış olan ise, bazıları tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ile uyumlu olmayan veya kültür daha--dan birkaç saat için desteklemiyor. Moleküler ritimleri19,20,21 bioluminescence görüntüleme ve floresan görüntüleme sirkadiyen nöronların uzun vadeli canlı görüntüleme Drosophila içinde gerçekleştirmek için alternatif yöntemler içerir Kalsiyum göstergesi ile hafif levha mikroskobu22,23. Bioluminescence görüntüleme yüksek zamansal çözünürlük elde edebilirsiniz ve hafif levha mikroskobu vivo içinde görüntüleme için uyarlanabilir olabilir rağmen Uzaysal çözünürlük sınırlı olduğunu ve özel mikroskop sistemleri gerektirir.

Burada açıklanan yöntemi birden fazla gün içinde tüm beyin kültür tek hücreli çözünürlükte floresan sinyallerini görselleştirmek için hazırlanmıştır. Bu facile ve çok yönlü yöntemi kültürlü görüntü yetişkin sinek beyin için ve pek çok farklı sorun Drosophila Nörobiyoloji yılında çalışmaya farmakolojik deneyler için adapte olabilir.

Protokol

1. hazırlanması kültür başlık altında hisse senedi çözümleri

  1. Ex vivo kültür larva beyin (başvuru24,25değiştirilmiş) için optimize edilmiş 1 x Schneider aktif orta (SAM) 400 mL hazırlamak (Tablo 1). Aliquot 5 mL ve flash için sıvı azot (LN2) Dondurma, 80 ° C'de - mağaza
  2. Sulandrarak 10 hisse senedi çözüm (başvuru26değiştirilmiş) x 1 x Dissecting tuzlu çözüm (DSS) hazırlayın (Tablo 2).
  3. 10 mg ve mağaza bir kişilik 4 ° C'de aliquot fibrinojen.
    Dikkat: fibrinojen laminar akış, zararlı olduğu gibi eldivenler altında tartın.
  4. Trombin SAM hisse senedi çözümde hazırlamak (1500 NIH birim/mg) ve 10 µL için aliquot, flash LN2 ' dondurma ve-80 ° C'de tutmak
    Dikkat: zararlı olduğu gibi Trombin işlerken eldiven.
  5. 100 aliquot hisse senedi çözüm penisilin-streptomisin x. -20 ° C'de tutmak
  6. Daireler politetrafloroetilin (PTFE) membran kesmek (malzeme tabloya bakın) cam alt çanak içine uygun boyutu. % 70'yıka alkol ve sonra autoclaved dH2O. Sterilize ve kuru UV laminar akış altında. Steril kabında tutun. Tek Kişilik Kullanım.
    Not: PTFE gaz değişimi sağlar ve uzun süreli kayıt sırasında buharlaşan orta engeller gözenekli bir esnek zar olduğunu.

2. hızlandırılmış mikroskobu Kur

Not: Aşağıdaki Kurulum tandem ters tarayıcı confocal mikroskop için (malzeme tabloya bakın) bir rezonans tarayıcı (8000 Hz) ile donatılmıştır. Sistemde önleyen rezonans tarayıcı ile birlikte fototoksisite ve photobleaching son derece hassas fotoğraf-çarpanı dedektörü vardır. Sıcaklık ve nem kontrol edilir bir mikroskop çevre oda içinde ( Malzeme tabloyabakın) bu mikroskop çoğunu kapsar.

  1. Bir sahne-üst nem odası yerleştirin.
  2. 25 ° C ve % 80 nem mikroskop odasına equilibrate için sıcaklık ve nem denetleyicileri açın.
  3. Deneyler sürekli karanlık (DD) gerçekleştirmek için (mikroskop odası opak bir malzemeden yapılmış sürece) mikroskop çevre odası opak bir bezle Kapak.
  4. Eğer bir su-daldırma amacı istimal, su daldırma mikro dağıtıcısı amacı üstüne getirin ve bir iletişim kuralı ile hızlandırılmış görüntüleme sırasında sabit bir oranda su dağıtmak için Autoimmersion amaç denetleyicisi yazılım programı.
    Not: başka türde bir daldırma orta kuru olarak su-daldırma hedefleri ile birlikte su dağıtıcısı veya kuru objektif lens uzun vadeli canlı görüntüleme için tavsiye edilir.
  5. Bir Petri kabına tutucu içinde nem odası sahne yerleştirin.
  6. Denize indirmek mikroskop bilgisayar yazılımı ve rezonans tarayıcı kipi ilk diyalog kutusundan seçin. İstendiğinde sahne başlatmak için Tamam'ı seçin. Yapılandırma sekmesini ve donanım yapılandırma ilgili lazer satırlarında geçiş yapmak için gidin.
  7. Al sekmesini ve çift yönlü modu seçin ve görüntü alma parametrelerini ayarlamak için XY paneline gidin.
    Not: Burada sunulan açıklanan görüntüleme Kur (Şekil 2, şekil 3 ve film 1) belirli floresan gazetecilere sirkadiyen ifade gözlemlemek için optimize edilmiştir. Aşağıdaki parametreleri bizim özellikleri en iyi sığacak şekilde seçilmiştir: 40 X su daldırma amaç, 8 X satır ortalama 512 × 512 görüntü çözünürlüğü ile. Çok renkli görüntüleme için sıralı resim alma ne zaman gereklidir emisyon dalga boyu bir fluorophore ve başka bir örtüşme (burada, dalga boylarında, sarı floresan Protein (YFP) emisyon ve domates uyarma örtüşme) uyarma dalga boyu. En hızlısı ve saat nöronların hareketi Z fiş satın alma sırasında ihmal edilebilir "yığın arasında" sıralı modu seçin. Mikroskopi ayarları her denemenin amacı uygun şekilde adapte olmalıdır.

3. Kurulum larva beyin Explant kültür

Not: tüm prosedürü diseksiyon üzerinden beyin explants gömmenin ~ 30 dakika sürer.

  1. Reaktifler bir kültür başlık altında hazırlanması.
    1. Trombin bir aliquot çözülme ve gömme adım kadar (3.3 adım) oda sıcaklığında tutmak. Tek Kişilik Kullanım.
    2. Hızlı bir şekilde SAM bir aliquot 37 ° C'de erimek ve buz bir oda tutun.
    3. 10 mg aliquot fibrinojen 10 mg/ml, SAM eklemek, yavaşça fiske ve 37 ° c en az 30 dakika ve gömme adım (Adım 3.3) sırasında kuluçkaya. Tek Kişilik Kullanım.
      Not: polimerize Başlarken fibrinojen çözüm daha çok 2 h kuluçkaya değil.
    4. Bir aliquot 100 x stokunun penisilin-streptomisin çözülme. 2,5 mL içeren 1 Sam hazırlamak penisilin-streptomisin (SAM/antibiyotik) x. Oda sıcaklığında tutmak.
      Not: Mağaza kalan 100 x stok penisilin-streptomisin 4 ° c ilâ 1 ay.
    5. 500 µL bir aliquot kalan SAM'den hazırlayın. Buz üstünde tutun.
    6. Uzun vadeli görüntüleme için autoclaved vakum yağ cam alt çanak (şekil 1A) alt plastik bölümü için geçerli ve laminar akış UV altında sterilize.
  2. Merkezi sinir sistemi ve ventral sinir kordonu diseksiyon.
    1. Temiz forseps ve 2 x 3-şey cam diseksiyon yemekleri ile % 70 alkol. DSS 400 µL 4 kuyu içine ve Sam bir iyi 400 µL dökün. Buz üstünde tutun.
    2. Larva içeren sinek orta kepçe ve Forseps ile sigara dolaşıp 3 INSTAR larva (L3) seçin. Art arda 2 wells DSS dolu yıka. Onları 3 DSS dolu iyi larvalar anesthetizes buz üzerinde tutun.
      Not: L3 25 ° C'de yaklaşık 2 gün sürer. Beyin fizyolojik ilgili süre içinde gözlemlemek için sigara dolaşıp L3 larva kullanmayı seçtiniz. L3 sahne dolaşıp oluşturulmasına izin saat nöronların, l-LNvs ve DN3s, gibi diğer alt gruplar başlamak ama mutlaka Bisiklete binme henüz (veri gösterilmez) değildir. Görüntüye mümkün olsa da bu nedenle, saat nöronlar bu aşamada (veri) gösterilmez, Bisiklete binme bu dikkatle zaten fonksiyonel larva saat nöronlar olanlar veri analizi için gelişmekte olan ayırt etmek önemlidir. Sigara dolaşıp L3 görünür yaklaşık 4-4.5 gün sonra yumurta 25 ° C'de döşeme Sirkadiyen ritim eğitimi için bu iletişim kuralını kullanmak için eşitleme (trene binmek) gelişmekte olan larvalar içinde 12 h/12 h LD L3 larva toplama önce 3 gün boyunca 25 ° C'de döngüleri.
    3. Hangi27Inside-out yöntemi kullanarak larva, durulama için kullanılmamış 4 DSS dolu iyi, iyi Forseps ile larva beynini incelemek.
      1. Kısaca, larva ikiye, yavaşça ağız kanca forseps bir çift ile pinch ve vücut böylece beyin açığa forseps, diğer çifti kullanarak duvar iç-out kadar rulo. Trakea ve vücudun geri kalanına ekleyin sinirler keserek beyin bedava.
      2. DSS yaklaşık 3 µL beyinde (DSS ile önceden durulanır) 20 µL pipet ile Aspire edin ve SAM dolu kuyuda dağıtmak. 7 beyin için yordamı yineleyin.
        Not: Diseksiyon anestezi larva ve soğutulmuş beyin tutmak için soğuk bir yüzeye yapılmalıdır. Örneğin, bir pompa buz soğuk su dolaşmaya bağlı bir soğutma bloğu üzerindeki diseksiyon çanak yerleştirin. Diseksiyon yordamı alır ~ 30 s beyin başına. Beyin ve bozulmamış ventral sinir kablosu bağlı göz/antennal Imaginal diskleri tutmak önemlidir. Bu parçalar kapalı yırtılma beyin hasar ve kültür kalitesini azaltır. Ayrıca, beynini havaya maruz kaçının. Daha önce aspirating ilk beyin, pipet disseke larvalar bölümlerini içeren DSS yukarı ve aşağı olarak beyin ucunu duvara yapışmasını önler.
  3. Beyin explants bir 3D matris ve montaj (~ 20 dk) gömme.
    1. Fibrinojen çalışma çözüm (fibrinojen son konsantrasyon ~3.3 mg/mL, beyin başına 10.5 µL) disseke beyinde aşağıdaki gibi batırılma:
    2. SAM/antibiyotik 3,5 µL (3.2.3 bölümünde kullanılan aynı tıp ile) Aspire edin. Diseksiyon de aynı pipet ucu içine bir disseke beyin ucu SAM/antibiyotik ortamda dağıtımı olmadan Aspire edin.
    3. Beyin ve steril Petri kabına kapağındaki orta dağıtmak. Başka bir 3,5 µL SAM/antibiyotik ve sıcak fibrinojen/SAM 10 mg/mL solüsyon 3,5 µL beyin içeren damla ekleyin. Beyin etrafında çözüm karışımı yavaşça 20 µL pipet ucu ile pipetting.
      Not: Bu adımda bir pipet forseps yerine kullanarak beyin vurgulayarak önler.
    4. Fibrinojen çalışma eriyik--dan belgili tanımlık damla 2 µL alacak ve cam alt tabak küçük bir daire olarak coverslip üzerinde uygulayabilirsiniz. Trombin 0.8 µL ve çok hızlı bir şekilde bir pipet ucu ile karıştırın. Fibrinojen fibrin için dönüştürülür ve polimerize başlar.
    5. Çözüm (Adım 3.3.1) forseps bir çift arasında çalışma fibrinojen oturuyor beyin almak ve fibrin beyaz bir matris görünür olduğunda matrisin üzerinde konumlandırın. Beyin ön tarafı aşağı (saat nöronlar için Imaging) gelecek şekilde yönlendirin. Mümkün olduğunca yakın kapak cama bastır. Fibrin pıhtısı fibrin katmanların oluşur. Bir katman seçin ve matrix ayırma olmadan küçük ve yumuşak hareketler ile beyin üzerine katlayın.
      1. 2-3 kat beyin dengelemeye pıhtı farklı bölgelerinden gelen yineleyin.
        Not: beyin Forseps ile işlerken, Kuru ya da fiziksel bir stres empoze değil dikkatli olun.
    6. SAM/antibiyotik 20 µL Trombin eylemi durdurmak için katıştırılmış beyin üzerine ekleyin.
    7. Kalan beyin takmak için yordamı yineleyin. 5 cam alt çanak üzerinde 6 beyin için katıştırmak mümkündür.
    8. Uzun vadeli canlı görüntüleme için SAM/antibiyotik 600 µL iç kuyuda (cam bölümü) ekleyin. Önceden kesilmiş PTFE membran orta üzerine konumlandırın ve alt (3.1.5) (şekil 1A) plastik parçası üzerinde uygulanan vakum yağ için sopa.
    9. Farmakolojik deneyleri için çanak SAM/antibiyotik (şekil 1B) 2 mL ile doldurulması.
      Not: Orta osmolalite nöronlar canlılık için kritik olduğu gibi orta buharlaşma önlemek çok önemli. Bu nedenle, uzun vadeli görüntüleme deneyler için PTFE membran ile Kültür çanak mühür gereklidir. Oysa yemek orta 2 mL ile dolu ve oksijen odasında izlenen sürece kısa süreli deneyler için membran mühürleme gerekli değildir.

4. hızlandırılmış resim alma

  1. Sahne-üst nem odası içindeki Petri kabına kutusunda cam alt çanak yerleştirin.
  2. Z-yığın paneli edinme sekmesinde gidin ve z-bölüm adımları--dan mikroskop bilgisayar yazılımı (2 µm × ~ 40 Şekil 2 ve şekil 3ve film 1gösterilen deneylerde) ayarla. Bir z-yığın başlangıcı en uzak coverslip ve beyin explant coverslip yakın yüzey vasıl belgili tanımlık son uçak ayarlamak. Yine de beyin hareketleri yok denecek kadar azdır, başlangıç ve z-yığın sonunda ekstra z-bölümleri ekleyin.
  3. Mark & paneli ve set-up çok pozisyonlu resim alma bulmak için gidin. 40 X amacı ile 1 beyin yarıküre görüş alanı içinde yakalanabilir
  4. Toplama modu paneli ve seçin xyzt (z-yığın hızlandırılmış) gidin. Zaman edinme Masası'na gidin ve uygun zaman aralığı ve sıklık parametrelerini ayarlamak.
    Not: İstenen frekansı ile hızlandırılmış görüntüleri elde etmek. Nöronlar canlılığı azalttığı muhtemelen Not uzun vadeli canlı görüntüleme (24-72 saat) zaman atlamalı aralığı 2 h kısa ile daha az Bisiklete binme nöronlar, sonuçlarında eğilimindedir. Veri birimi görüntü edinme artar, daha zorlu veri analizi ve depolama kılan oranı genişletir.

5. farmakolojik tedavisi beyin Explants vadeli canlı görüntüleme ile

Not: Aşağıdaki yordam aslında uzun vadeli görüntüleme için aynıdır ancak PTFE membran gerektirmez. Kimyasal kültür için eklendiğinde ışık mavi beyin kullanılmasını önlemek için mikroskop kırmızı ışık ile karanlık odada yer almalıdır.

  1. Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve uyuşturucu uygulamadan önce temel verileri elde etmek için tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır.
  2. Sonra temel tarama tamamlandıktan, mikroskop sistem inceden inceye gözden geçirmek başkanı kaldır. Sahne-üst nem denetleyicisi kapağını kaldırmak ve çok dikkatli hareket ettirmeden cam alt çanak kapağı kaldırın.
  3. Kültür orta uygun miktarda kaldırın. Deneysel çözüm orta ve, dikkatli ve yavaşça, beyin explants dokunmadan bir steril Pasteur pipet ile karıştırın.
    Not: PDF banyo uygulanması için 2 µM PDF hisse senedi çözüm (% 10 DMSO içinde) kullanın.
  4. Cam alt çanak ve nemli odası ve tarama başın kapakları değiştirin. Kullanıyorsanız, siyah opak kumaş mikroskop odası yeniden konumlandırın.
  5. Beyni canlı tarama modu özgün konumlarında, olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse ayarlayın.
  6. Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır.
    Not: Burada en fazla 10 saat için her saat alınan hızlandırılmış görüntüleri test ettik.

Sonuçlar

İşte, ex vivo larva beyin kültür ve PDF banyo uygulaması muhabir ifade üzerinde canlı görüntüleme sonuçlarını sirkadiyen floresan muhabir uzun süreli kayıt temsilcisi sonuçlarını göstermektedir.

Sigara dolaşıp L3 larva moleküler saat muhabir başına TDT ve UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (şekil 1 c) ld beyinlerinde entrained bir saat nöron sürücü tarafında...

Tartışmalar

Burada biz kültürlü larva beyin uzun vadeli Floresans hızlandırılmış mikroskopi yöntemi nitelendirdi. Beyin explant, floresan yoğunluğu ve sinyal-gürültü oranı gazeteci, zamansal ve mekansal çözünürlüğü, immobilizasyon için yöntem Multipl faktörler, kültür, sağlık gibi bu tür deneyler başarısı bağlıdır ve erişilebilirlik için explant. Bu faktörler dışlayan olabilir. Örneğin, hızlandırılmış sıklığı artan kültür sağlık etkiler ve beyin explant immobilizasyon gaz deği...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu yöntem geliştirme başlangıç aşamasında destek ve Michael Rosbash onun rehberlik için teşekkür ederiz. Bu eser JST PRESTO program tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_149893 ve 31003A_169548), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG-311194), Novartis Vakfı tıp Biyomedikal Araştırma (13A39) ve Cenevre Üniversitesi finanse edildi .

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
KH2PO4Sigma-AldrichP5655I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2Sigma-AldrichC7902
MgSO4.7H2OSigma-Aldrich230391
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
D-(+) GlucoseSigma-AldrichG7021
Yeast extractSigma-AldrichY1000
InsulinSigma-AldrichI0516-5ML
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
BIS-TRISSigma-AldrichB4429
L-(−)-Malic acidSigma-AldrichM7397
D-(+)-Trehalose dihydrateSigma-AldrichT0167
Succinic acidSigma-AldrichS9512
Fumaric acidSigma-AldrichF8509
α-Ketoglutaric acidSigma-AldrichK1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screenedBioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4E&K Scientific ProductsEK-654011
KClSigma-AldrichP5405
NaH2PO4Sigma-AldrichS5011
SucroseSigma-AldrichS7903
Fibrinogen from bovine plasmaCalbiochem (Merck)341573-1GMCAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasmaSigma-AldrichT9549CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OHChi Scientificcustom made
Vaccum greaseSigma-Aldrich18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishesfisherscientific08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μmMilliporeSCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filmDupont200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMilliporeSLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMilliporeSLGV033RS
Three-well glass dissection dishAny company
Fine forceps, size 5, DumontFine Science Tools11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectorsLeica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamberLife Imaging ServicesThe CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controllerLife Imaging Servicescustom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller softwareLeica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift pluginImageJ software
10x iterative deconvolutionAutoQuant and Imaris software

Referanslar

  1. Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?. Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
  2. Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
  3. Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).
  4. Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
  5. Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
  6. Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
  7. Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
  8. Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
  9. Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
  10. Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
  11. Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
  12. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  13. Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
  15. Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
  17. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  18. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  19. Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
  20. Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
  21. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
  22. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
  23. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
  24. Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
  25. Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
  26. Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
  30. Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
  31. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
  32. Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
  33. Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
  34. Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
  35. Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
  36. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 131n rolojiksirkadiyen ritimn ronal ileti imh zland r lm g r nt lemeex vivo beyin k lt rfloresan muhabirDrosophila

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır