Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Resumen

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Resumen

Microglia, las células inmunes residentes en el cerebro, son los primeros respondientes a los inflamación o lesiones en el sistema nervioso central. La investigación reciente ha revelado microglia a ser dinámico, capaz de asumir fenotipos pro inflamatorias y antiinflamatorios. Tanto M1 (pro inflamatorio) y M2 fenotipos (pro-reparadora) juego un papel importante en capensis condiciones tales como lesión cerebral perinatal y exposición de diferentes funciones en respuesta a ciertos estímulos ambientales. La modulación de la activación microglial se ha observado para conferir neuroprotección así sugiriendo la microglía puede tener potencial terapéutico en el daño cerebral. Sin embargo, se requiere más investigación para comprender mejor el papel de la microglia en la enfermedad, y este protocolo facilita. El protocolo describe a continuación combina un proceso de centrifugación del gradiente de densidad para reducir desechos celulares, con separación magnética, produciendo una muestra muy pura de las células microgliales primaria que pueden utilizarse para la experimentación in vitro , sin la necesidad de 2 a 3 semanas de cultivo. Además, los pasos de caracterización rendimiento robustos datos funcionales sobre la microglia, ayudando a los estudios para mejorar nuestra comprensión de la polarización y cebado de estas células, que tiene fuertes implicaciones en el campo de la medicina regenerativa.

Introducción

Daño adquirido durante el período de inflamación, hipoxia isquemia y hemorragia perinatal puede tener una serie de secuelas a largo plazo. La teoría de la compleja Fisiopatología de la lesión cerebral perinatal es involucrar a la inflamación y la isquemia con posterior muerte neuronal y axonal¹. La respuesta inmunitaria innata desempeña un papel importante en la cascada de eventos que llevan a lesión².

Microglia, las células inmunes residentes en sistema nervioso central (SNC), son los primeros respondientes a lesiones³. Microglia son tipos de células de plástico con capacidad de ser protector o tóxico, dependiente en el medio ambiente⁴. Están involucrados en la quimiotaxis, fagocitosis, presentación del antígeno y la producción de citocinas y especies de oxígeno reactivo^4,5. Microglia senescente constantemente encuesta sobre el medio ambiente y se activan por la presencia de una sustancia perjudicial o extranjeros⁴. La activación conduce a una respuesta proinflamatoria, crítica en el CNS protección⁴. Estos M1 "inflamatorias" fenotipo microglia participan principalmente en la presentación del antígeno y la muerte de patógenos⁴. A pesar del papel crucial de la respuesta inflamatoria en la neuroprotección, inflamación incontrolada o prolongada puede ser perjudicial y conducir a daño neuronal⁴. Sin embargo, cuando se expone a ciertos estímulos ambientales, microglia puede exhibir un fenotipo antiinflamatorio. Estos pro-reparadora microglia M2 tienen un papel fundamental en la cicatrización de heridas y reparación⁶, lanzando una gama de citoquinas y otros mediadores solubles que regular a la baja la inflamación, aumentan la fagocitosis y promover la reparación de^{4, 7}. los papeles de microglia son diversos e incluyen diferenciación de oligodendrocyte conducción durante re-mielinización⁸, protegiendo las neuronas durante la depleción de oxígeno y glucosa en tiempos modelos⁹ y promoción de la consecuencia del neurite en ¹⁰los modelos de lesión de la médula espinal.

El estudio de estas células gliales representa un aspecto importante en la comprensión y manipulación de la respuesta a la neuroinflamación. El protocolo descrito permite más investigación sobre el potencial terapéutico de la modulación de la microglia en afecciones capensis.

La modulación de la activación microglial hacia un papel neuroprotector se ha observado en una amplia gama de condiciones^11,12,13. Por lo tanto, mejorar la comprensión actual y estudiar más la modulación de la activación microglial es crítica, que requieren el uso de varios modelos, incluyendo tanto in vitro como in vivo. In vitro los estudios representan una herramienta importante debido a su mayor eficiencia, menor costo y su capacidad para investigar una población aislada de la célula.

Hay una gama de protocolos descritos en la literatura para el aislamiento de la microglia del cerebro murino, el desafío de producir eficientemente una muestra de alto rendimiento con buena viabilidad y pureza elevada. Utilizado métodos de aislamiento de microglia primaria son por separación magnética y prolongado temblor de cultivos gliales mixtos. A través de la experiencia personal, se encontró que existía un alto grado de desechos celulares que obstruyó la columna magnética. Por lo tanto, se utilizó el siguiente protocolo, que incorpora un paso de centrifugación del gradiente de densidad inicial seguido por la separación magnética de CD11b. El protocolo que se describe a continuación ha sido optimizado para producir una muestra muy pura en cantidad suficiente. Es ventajoso debido a su alta pureza y el corto período de tiempo, uno puede realizar análisis dentro de 2 días sin tener a la cultura durante 2-3 semanas. Potencialmente se puede adaptar este protocolo para el aislamiento de astrocitos murinos primarios.

Protocolo

Los siguientes procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética Animal en la Universidad de Monash. Se utilizaron ratones C57Bl6/J P3-6 de recién nacido sano para generar resultados representativos.

1. enzimática digestión

Nota: Es importante considerar la esterilidad al aislamiento y cultivo de células primarias. Y asegurando que el ambiente es tan estéril como sea posible, la disección inicial y la cosecha de cerebros murinos pueden completarse fuera una campana de flujo laminal, con pasos posteriores realizados dentro de una campana de flujo laminar.

1. Utilizar instrumentos estériles, eutanasia el ratón mediante dislocación cervical, decapitar al animal y enjuagar con etanol al 100%. Con pequeñas tijeras estériles, hacer pequeñas incisiones a lo largo de los lados derecho e izquierdos de la cabeza. A esta edad, la piel se pela fácilmente. Usando las puntas de las pinzas curvas, deslice suavemente el tejido hacia la tribuna para exponer el cráneo, incluyendo el Bregma.
2. Inserte la punta de la tijera en la apertura del canal medular y haga una incisión lateral en el conducto auditivo externo. Hacer una incisión a lo largo de la sutura sagital Bregma, suavemente hacia la punta de las tijeras hacia arriba para evitar daños en el cerebro. Introduzca la punta de la tijera en el Bregma y hacer incisiones laterales a los lados derecho e izquierdos de la cabeza a lo largo de la sutura coronal.
3. Con unas pinzas, con cuidado retire el cráneo para exponer el cerebro. Para ello, sujete los bordes del cráneo expuesto por la incisión lateral y Jale suavemente el cráneo al lado. El cráneo debe despegar fácilmente. Suavemente con unas pinzas curvas, primicia en el cerebro para sacarlo.
4. Colocar el cerebro en un recipiente estéril de 5 mL, lavar 2 - 3 veces con medios helada colada (de baja glucosa Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina), aproximadamente 5 mL los medios de comunicación por lavado, para eliminar la sangre.
5. En una campana de flujo laminar, colocar el contenido del envase de 5 mL en una placa Petri pequeña (35 mm), descansando en el hielo. Utilizando una cuchilla estéril de bisturí o tijeras estériles, quite el cerebelo y el bulbo olfatorio. Haga una línea media para separar los dos hemisferios.
6. Cuidadosamente retire la capa meníngea con pinzas finas, teniendo cuidado de no para dañar las cortezas. Identificar la capa meníngea como una capa muy delgada de células con una tonalidad rojiza en la superficie del cerebro, con visibles vasos sanguíneos. Manteniendo el cerebro frío es esencial para la eliminación adecuada de meninges. Si se rompe la capa meníngea, siguen pelando lejos los fragmentos rotos hasta que se quita totalmente.
7. Transferir los hemisferios a un nuevo plato de petri pequeñas (sobre hielo) y llenar con los medios de lavado. Cortar el cerebro en pedazos pequeños con cuchilla estéril bisturí/tijeras.
   Nota: Estos deben ser de ~ 1 mm² de tamaño, y debe tener cuidado de no cortarlas en trozos muy pequeños, esto puede reducir el rendimiento.
8. Añadir 100 μl papaína (acción de 17 U/mg) y 150 μL de DNasa I en los medios de comunicación e incubar 30 min a 37 ° C
9. Después de la digestión, triturate tejido usando una pipeta P1000. Si pedazos de tejido son demasiado grandes para entrar en la pipeta, considere el uso de un par o tijera estéril para ensanchar la punta de la pipeta. Durante este proceso, asegúrese de no para introducir burbujas en los medios de comunicación como esto puede reducir la viabilidad de las células.

2. retiro de escombros mielina

1. Bajo campana de flujo laminar utilizar equipo estéril, preparación de un tubo cónico de 50 mL con un 100 μm filtro de célula, de cada cerebro. Vierta el contenido de la caja Petri, que contiene las piezas de medio y el cerebro de digerir en un colador. Empuje a través de las piezas del cerebro utilizando el émbolo de una jeringa estéril 3 mL en un movimiento de pulido hasta que hay no hay tejido más accesibles. Después de la digestión, el tejido cerebral debe desmoronarse fácilmente.
2. Constantemente lavar el filtro con los medios de lavado por rellenar el filtro de la célula a lo largo de este proceso. Esto va a lavado a través de las células atrapadas en el filtro.
   Nota: Esto debe hacerse hasta que haya aproximadamente ~ 15 mL en el tubo. Esto es para asegurar que el filtro se lava suficientemente a través de y para maximizar la cantidad de células recogidas.
3. Centrifugar la suspensión unicelular a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Durante este tiempo, preparar el medio de gradiente de densidad como se describe.
   1. Preparar el percoll isotónica stock (SIP), que es el medio de gradiente de densidad utilizado. Para ello, agregando la relación 9:1 de medio de gradiente de densidad a 10 x estéril madejas de solución salina balanceada (HBSS).
   2. Preparación de gradientes como 30% SIP en DMEM y 70% SIP en 1 x HBSS. Por ejemplo, para preparar 10 mL de 30% SIP, añadir 3 mL de SIP a 7 mL DMEM.
4. Aspirar el sobrenadante de los tubos cónicos y resuspender el sedimento celular con 8 mL de 30% SIP en DMEM. Transferir el volumen completo a un nuevo tubo cónico 15 mL.
5. La SIP solución al 70% de la arpillera. Para ello, llene una pipeta de transferencia con 70% SIP y cuidadosamente empuje a través de la pipeta hasta el fondo del tubo cónico. Una vez que la punta está cerca de la parte inferior, suavemente empuje por el contenido de la pipeta de transferencia.
   Nota: Hacer esto lentamente para no perturbar la interfaz 30/70. Debe haber una línea clara que separa las dos capas.
6. Centrifugue las capas SIP, incluyendo las células, en 650 g de x con freno 0 y aceleración 4, durante 25 minutos a temperatura ambiente.
   Nota: Es esencial para completar el giro con freno OFF y para permitir que la centrífuga lentamente llegar a un alto, como aplicación del freno de alterar la interfase y reducir dramáticamente la recolección de células entre las capas de la SIP.
7. Aspire los detritos celulares en la parte superior del tubo y eliminar aproximadamente 4 mL de medios de la parte superior. Esto facilitará la eliminación de las células mononucleares en el siguiente paso. Con una pipeta P1000, baje con cuidado la punta de la pipeta hacia la interfase. Aislar las células mononucleares de la interfaz medio gradiente de densidad de 30/70. Recoger aproximadamente 3 mL de la interfaz de nublado y transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 mL. A continuación, diluir la mezcla con 9 mL de HBSS para ayudar a la eliminación del medio de gradiente de densidad.
8. Centrifugar la interfase medio degradado densidad diluida, que contiene las células mononucleares a 500 x g por 5 min aspirar el sobrenadante y resuspender con medio de cultivo 1 mL (DMEM suplementado con 10% bovino fetal del suero y el 1% antibióticos). A continuación, mancha las células resuspendidas con trypan azul y realizar un conteo usando un hemocitómetro.

3. magnético celular activado clasificación

Nota: Estos pasos son modificados del protocolo del fabricante.

1. Centrifugar las células mononucleares recogidas a 300 x g durante 10 min a 4 ° C para eliminar el medio de crecimiento, esto va a interferir con el aislamiento magnético. Utilizando la misma cuenta de célula de paso 2.8, resuspender en 1 x 10⁸ nucleated células/mL en PBS (⁺⁺ de Ca y Mg⁺⁺ libre) que contiene 2% de SBF y 1 mM de EDTA, dentro de un rango de volumen de 0.1-2.5 mL.
2. Agregar el volumen completo de las células nucleadas en PBS desde el paso anterior a un tubo de poliestireno fondo redondo 5 mL fresco (12 x 75 mm). Añadir 50 μl de reactivo de etiquetado CD11b PE por 1 mL de muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz.
3. Añadir 70 μl de selección cocktail (una combinación de anticuerpos monoclonales contra CD11b en PBS) por 1 mL de muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz.
4. Mezcla de partículas magnéticas mediante pipeteo arriba y abajo más de 5 veces. Añadir 50 μl/mL para la muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos protegido de la luz.
   Nota: Estas partículas forman un complejo tetramérica con los anticuerpos y se conseguir atadas a la columna magnética.
5. Si el volumen total de la mezcla de células es inferior a 2,5 mL, tapa hasta este volumen con PBS (⁺⁺ de Ca y Mg⁺⁺ libre) que contiene 2% FBS y 1 mM EDTA y mezclar mediante pipeteo suave 2 - 3 veces. Coloque el tubo (sin tapa) en el imán e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. En un movimiento continuo, totalmente invertir el imán que contiene el tubo de 2-3 s, verter fuera el sobrenadante. Regrese el imán a una posición vertical y retire el tubo del imán. Preparación lavar las células restantes de la columna.
   Nota: El sobrenadante contiene células sin etiquetar y no deseadas, que se eliminan por inversión del tubo mientras que en el imán. El tubo contiene el Cd11b adjunto⁺ las células.
7. Lavar las células repitiendo los pasos 3.5 y 3.6 dos veces más. Si la muestra es mayor de 1 mL, se recomienda una mayor repetición de pasos 3.5 y 3.6.
8. Resuspender las células en un medio de crecimiento deseado. Enjuague el lado del recipiente de colección así (ej. un tubo de 15 mL) para recoger células de los lados del tubo y maximizar los rendimientos.

4. verificación de pureza de la Microglia

Nota: La microglia primaria aislada de 3 L (n = total de 5 animales) fueron verificados mediante fluorescente celular activada (FACS) para determinar pureza para obtener resultados representativos de clasificación.

1. Células en cultivo en un matraz T-25 en el medio de crecimiento que contiene 10% FBS durante la noche, siembra a una densidad de 1-2 x 10⁶ células cada frasco.
2. Lavar las células en los matraces T-25 con PBS 3 x 5 min eliminar cualquier medio de crecimiento restante que podría interferir con la tripsinización.
3. Añadir 2 mL de tripsina 0.25% para separar las células de los frascos. Asegúrese de que el volumen de la tripsina es suficiente para cubrir toda la superficie del frasco. Tras suave remolino del frasco para asegurar una cobertura uniforme de la tripsina, incubar por 5 min a 37 ° C.
4. Apagan el proceso tripsinización añadiendo 2 mL de medio de crecimiento que contiene 10% FBS en el matraz.
5. Recoger el sobrenadante que contiene las células tripsinizaron y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para recoger células.
6. Quite el sobrenadante que contiene el medio de cultivo y tripsina y resuspender el precipitado en tampón de FACS de 500 μL. Realizar el conteo de células con azul tripán.
7. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Realizar el bloqueo de receptores Fc añadiendo 50 tampón FACS de μL + bloqueador de FcR de 1 μL por 5 x 10⁶ células. Incubar por 15 min a 4 ° C.
   Nota: El bloque del receptor de Fc es un paso crítico en el procedimiento de tinción para evitar atascamiento no específico de inmunoglobulinas a los receptores de Fc en las poblaciones de células inmunitarias. Este bloqueo no afecta aguas abajo Unión de otros anticuerpos.
8. Terminar el proceso de bloqueo mediante la dilución con tampón de FACS de 500 μL. A continuación, centrifugar la mezcla que contiene las células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
9. Resuspender en tampón de FACS de μL 500 frescos.
10. Lugar la mayoría de las células (por ejemplo si resuspender las células en 500 μL de tampón FACS, uso 400 μL) en un tubo de muestras. Distribuir las células restantes entre los tubos de control y superior a 100 μL por tubo de control (e.g. para 6 tubos de control soportar 16.67 μL en cada tubo de control y top 83,33 tampón FACS de μL). Hacer grupos (tubos de control en negrita) como Unstained, solo manchado (CD45, CD11b), solo la mancha en vivo/muerto, consistente y tubos de muestras.
11. Sedimenten las células en todos los tubos por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
12. Se tiñen las células en el tubo con 1 anticuerpo μL por tampón FACS de 100 μL por 5 x 10⁶ células. Incubar por 20 min a 4 ° C.
    Nota: Utilice 50 μL del anticuerpo cóctel si se utilizan menos de 2 x 10⁶ células.
13. Lavar las células con buffer de FACS de 500 μL. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
14. Resuspender las células en solución tampón FACS de 300 μL.
    Nota: Use ~ 100 μl si el recuento es inferior a 2 x 10⁶.
15. Usando análisis de citometría de flujo, cuantificar las células CD45^bajo y positivo para la tinción de CD11b. Este porcentaje corresponde a la microglia primaria aislada.

5. inmunohistoquímica tinción de Microglia primaria

1. Placa las células en una placa de 96 pozos a una densidad de 1 x 10⁵ células con el medio de cultivo e incubar durante la noche.
2. Quite el sobrenadante y lavar 3 veces con PBS.
3. Fijar las células con paraformaldehído al 4% en PBS para eliminar las AFP con una pipeta P1000 a 15 minutos, luego lavar 3 veces con PBS + 0.1% Triton-X.
4. Bloque de fijación no específica con seroalbúmina bovina al 3% durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Incubar con conejo Iba-1 (1: 100) por 24 h a 4 ° C. A continuación, retire la mezcla del anticuerpo primario y lavar 3 veces con PBS.
6. Incubar con el conjugado GFP secundario anti-conejo (1: 200) por 1 h a temperatura ambiente. A continuación, retire la mezcla del anticuerpo secundario y lavar 3 veces con PBS.
7. Montaje de diapositivas con un fluorescente montaje medio y captura imágenes mediante un microscopio de fluorescencia.

6. cuantificación de Microglia pHrodo ensayo

Nota: El ensayo de pHrodo permite la identificación de los niveles de fagocitosis en células cultivadas. A absorción a través de endocitosis, la internalización en el ambiente más ácido aumenta los niveles de fluorescencia de los conjugados de bioparticle. Entonces pueden cuantificar niveles de fluorescencia por FACS. Modificación de los pasos del protocolo del fabricante.

1. Cultura durante la noche las células en un frasco de T-25 en el medio de crecimiento, siembra a una densidad de 1-2 x 10⁶ células cada frasco. Lavar las células en frascos T-25 con PBS 3 veces durante 5 minutos.
2. Separar las células utilizando tripsina de 0.25% de 2 mL. Incubar por 5 min a 37 ° C.
3. Apagan el proceso de trypsinization mediante la adición de 2 mL de medio de crecimiento que contiene 10% FBS en el matraz.
4. Centrifugue la suspensión de células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
5. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene la microglia primaria en medio de cultivo 10⁶ células/ml.
   Nota: Alternativamente, placa de células en una placa de 96 pocillos por lo menos un día antes y busca 1 x 10⁵ células viables por pozo en el día el ensayo debe ser realizado.
6. Células de placa en placa de 96 pocillos en 1 x 10⁵ células/pozo, 100 μL por pozo. Placa de controles y pozos experimentales por triplicado y dejar un pozo vacío por control positivo para realizar una sustracción de fondo del control no celular.
7. Añada 100 μL de medio de crecimiento para los pozos vacíos para fondo de celular no.
   Nota: Como cualquier otro en vitro ensayo, controles adecuados son vitales para la exactitud de las lecturas. Junto a la celda de no control (fondo de la lectura), también incluyen el control negativo bien (conjugado pHrodo añadido, pero colocado en hielo).
8. Cubrir la placa e incubar durante 1 h en una incubadora con 5% CO₂ a 37 ° C.
9. Preparar pozos experimentales agregando estimulante y tratamiento. Agregar controles de vehículo (sólo medios de crecimiento) a pozos no tratadas.
   Nota: Lipopolisacárido 1 μg/mL [estimulante] y células epiteliales del amnios humano (hAEC)-media condicionada [tratamiento] se utilizaron para generar resultados representativos.
10. Descongelar un vial de conjugado colorante, añadir vortex y brevemente 2 mL de tampón de absorción. Transferir el contenido del tubo a un tubo de vidrio limpio y someter a ultrasonidos durante 5 minutos, para asegurarse de que las partículas se dispersan uniformemente.
11. Aspire el medio de cultivo de los pozos de la microplaca y reemplazar rápidamente con 100 μL de suspensión de tinte. Cubrir e incubar a 37 ° C durante 1 h.
    Nota: Recuerde a los tubos de control así como la mancha.
12. Usando análisis de citometría de flujo, cuantificar células de tinción positiva para los granos de pHrodo conjugado y se presentan como un porcentaje (del padre) de phagocytosing activamente la microglia.

7. cuantificación de la Microglia Apoptosis tras insulto inflamatorio

1. Repita los pasos 1-7 de la sección "Verificación de pureza de microglía".
2. Lugar la mayoría de las células (por ejemplo, si se resuspendió las células en 500 μL de tampón FACS, uso 400 μL) en un tubo de muestras. Distribuir las células restantes entre los tubos de control y superior a 100 μL por tubo de control (por ejemplo, para tubos de control 6, poner 16.67 μL en cada tubo de control y top con tampón FACS de 83,33 μL). Grupos (tubos de control en negrita): sin manchas, solos las manchas (AnnexinV, yoduro de propidio), solo la mancha en vivo/muerto, consistente, tubos.
3. Sedimenten las células en todos los tubos por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
4. Incubar con 1 μL del anticuerpo/100 μL FACS buffer/5 x 10⁶ células por 20 min a 4 ° C.
   Nota: Utilice 50 μL si tienen menos de 2 x 10⁶ células.
5. Lavar las células añadiendo 500 μL de buffer de FACS y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos.
6. Resuspender el precipitado de células en solución tampón FACS de 300 μL.
   Nota: ~ 100 μL si el recuento es inferior a 2 x 10⁶.
7. Cuantificar las células dentro de cada cuadrante (Q1: necrótico, Q2: apoptosis tardía, Q3: viable, Q4: apoptotic temprana).

Resultados

Utilizando los métodos descritos aquí, poblaciones puras de microglia pueden ser aisladas y pueden estar listas para la caracterización mediante el análisis FACS y en vitro . Con 18 animales se pueden utilizar hasta por cull, con un rendimiento esperado de aproximadamente 450.000-600.000 las células microgliales. Es crucial confirmar primero la pureza de las células aisladas, y para ello análisis FACS fue realizada por la coloración de los dos marcadores CD45 y CD11b. ide...

Discusión

Microglia tienen la capacidad de ser pro - y antiinflamatoria, alterada por los estímulos del medio ambiente. Estudios anteriores han demostrado que la modulación de la activación de la microglía puede conferir neuroprotección. Su capacidad para proporcionar protección a las neuronas y reparar lesiones requiere más investigación para la comprensión actual de estas células complejas. Así, aislamiento de alta pureza primaria microglia es una técnica importante y útil. Este es un método relativamente rápido p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, low glucose, pyruvate	Gibco	11885084
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grade II from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep magnet variant
EasySep magnet	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphate buffered saline	Gibco	14040182
Trypsin (2.5%) (10X)	Gibco	15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Corning	352063
175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap	Corning	431080
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom	Corning	CLS3799
Paraformaldehyde (powder, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-Iba1	Wako	01919741
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Antibodies	Company	Catalog Number
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodide solution	Miltenyi Biotech	130-093-233