אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Summary

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

Abstract

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב במוח, הם המגיבים הראשונים כדי דלקת או פגיעה במערכת העצבים המרכזית. מחקר שנערך לאחרונה גילה מיקרוגלייה דינאמיות, מסוגל בהנחה פנוטיפים הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות. M1 (פרו-דלקתיים) והן M2 (pro-תיקוני) פנוטיפים לשחק תפקיד חשוב neuroinflammatory מצבים כגון פגיעה מוחית הלידה, נספח שונות פונקציות בתגובה לגירויים סביבתיים מסוימים. מודולציה של הפעלת microglial נרשמה להיוועץ neuroprotection ובכך רומז מיקרוגלייה ייתכן הפוטנציאל הטיפולי של פגיעה מוחית. עם זאת, מחקר נוסף נדרש כדי להבין טוב יותר את התפקיד של מיקרוגלייה במחלה, פרוטוקול זה מאפשר את זה. הפרוטוקול המתואר להלן משלב תהליך צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות להפחתת פסולת הסלולר, עם הפרדה מגנטית, הפקת מדגם מאוד טהור של תאים microglial העיקרי שיכול לשמש לניסויים בתוך חוץ גופית , בלי הצורך 2-3 שבועות culturing. בנוסף, השלבים אפיון תשואות פונקציונלי נתונים אודות מיקרוגלייה, מחקרים לשיפור ההבנה שלנו של קיטוב וסיוע הטרמה של תאים אלה, אשר יש השלכות חזק בתחום של רפואה רגנרטיבית.

Introduction

נזק רכשה במהלך תקופת הלידה דלקת, מחוסר חמצן-ischaemia, דימום יכול להיות מערך של sequelae לטווח ארוך. הפתופיזיולוגיה המורכבת של פגיעה מוחית הלידה הוא משוער לערב דלקת ו איסכמיה עם מוות עצביים עצב שהתפתח¹. התגובה החיסונית מולדת ממלא תפקיד חשוב בהמפל של האירועים שהובילו פגיעה².

מיקרוגלייה, תושב תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), הם המגיבים הראשונים פציעה³. מיקרוגלייה הם סוגי תאים פלסטיק עם היכולת להיות תלויי מגן או רעיל, על הסביבה⁴. הם מעורבים כימוטקסיס, phagocytosis, מצגת אנטיגן וייצור של ציטוקינים ו^4,של מינים חמצן תגובתי⁵. מיקרוגלייה senescent כל הזמן סקר את הסביבה, מופעלים על ידי הנוכחות של חומר זר או מזיקים⁴. הפעלת מוביל לתגובה הפרו דלקתיים, קריטי ב CNS הגנה⁴. מיקרוגלייה פנוטיפ "פרו-דלקתיים" אלה M1 מעורבים בעיקר אנטיגן מצגת ומוות של פתוגנים⁴. למרות תפקיד מכריע התגובה דלקתית neuroprotection, דלקת בלתי מבוקרת או ממושך יכול להיות מזיקים להוביל נזקים עצביים⁴. עם זאת, כאשר הם נחשפים לגירויים סביבתיים מסוימים, מיקרוגלייה יכול התערוכה של פנוטיפ אנטי דלקתיות. מיקרוגלייה M2 pro-תיקוני אלה יש תפקיד קריטי פצע ריפוי ותיקון⁶, שחרור מגוון של ציטוקינים ותיקון עוד מגשרים מסיסים downregulate דלקת, להגדיל phagocytosis ולקדם^{4, 7}. התפקידים של מיקרוגלייה הינם מגוונים וכוללים בידול אוליגודנדרוציטים נהיגה במהלך re-myelination⁸, הגנה על נוירונים במהלך דלדול חמצן, גלוקוז מודלים קו⁹ וקידום תוצר neurite ב פגיעה בחוט השדרה מודלים¹⁰.

המחקר של אלה גלייה מייצג היבט חשוב להבנה, מניפולציה התגובה neuroinflammation. הפרוטוקול המתואר מאפשר חקירה מתמשכת לתוך הפוטנציאל הטיפולי של אפנון מיקרוגלייה בהפרעות neuroinflammatory.

מודולציה של הפעלת microglial לקראת תפקיד neuroprotective נצפתה במגוון של מצבים^11,12,13. לכן, שיפור ההבנה הנוכחית נוספת ללמוד אפנון של הפעלת microglial הוא קריטי, הדרישה לשימוש של מודלים שונים כולל חוץ גופית בתוך ויוו. מחקרים במבחנה מייצגים כלי חשוב בשל שלהם גדול יותר, נמוך יותר עלות ויעילות היכולת לחקור אוכלוסיה תא מבודד.

ישנם מגוון של פרוטוקולים המתוארים בספרות על בידודו של מיקרוגלייה מן המוח מאתר, האתגר לייצר ביעילות מדגם תשואה גבוהה עם יכולת הקיום טוב, טוהר גבוהה. השיטות הנפוצות של בידוד של ראשי מיקרוגלייה הן על ידי הפרדה מגנטית ורעדתי ממושך של תרבויות גליה מעורבת. מניסיון אישי, התברר שהיה שם מידה רבה של פסולת הסלולר אשר נחסמת העמודה מגנטי. כך, הפרוטוקול הבא היה מנוצל, אשר משלבת צעד צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הראשוני ולאחריו הפרדה מגנטית CD11b. הפרוטוקול המתואר להלן מוטבה כדי לייצר מדגם הטהור מאד בכמות מספקת. . זה יתרון בשל טוהר גבוהה שלה ואת תקופת זמן קצר – אחד יכול לבצע מבחני תוך יומיים ללא צורך תרבות במשך 2-3 שבועות. באופן פוטנציאלי יכול להיות מותאם פרוטוקול זה בידודו של ראשי האסטרוציטים מאתר.

Protocol

ההליכים הבאים אושרו על ידי ועדת האתיקה חיה ב אוניברסיטת מונש. בריאה neonate טיפול C57Bl6/J P3-6 עכברים שימשו כדי להפיק את התוצאות נציג.

1. עיכול אנזימטי

הערה: חשוב לשקול עקרות כאשר בידוד culturing ראשי תאים. תוך הקפדה שהסביבה הוא סטרילי ככל האפשר, הקרע הראשוני ואת הקציר של המוח מאתר יכולה להסתיים מחוץ ברדס זרימה laminal, עם כל והשלבים מבוצעים תא למינארי.

1. באמצעות מכשירים סטריליים, המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם, לערוף את החיה, לשטוף עם 100% אתנול. בעזרת מספריים קטנות סטרילי, לבצע חתכים קטנים לאורך צד ימין ועל שמאל של הראש. בגיל הזה, העור קליפות משם בקלות. באמצעות קצות המלקחיים מעוקל, החלק בעדינות את הרקמה לכיוון פניו כדי לחשוף את הגולגולת, כולל את Bregma.
2. הכנס את קצה המספריים הפתיחה של תעלת השדרה, עושים חתך לרוחב אל תעלת האוזן. לבצע חתך לאורך התפר המשונן Bregma, הצבעה בעדינות את קצה המספריים כלפי מעלה כדי למנוע נזק למוח. להוסיף טיפ מספריים Bregma ולבצע חתכים לרוחב צידי הראש לאורך התפר הפרונטליים ימינה ושמאלה.
3. באמצעות מלקחיים, בעדינות הקילוף הגולגולת כדי לחשוף את המוח. כדי לעשות זאת, את הקצוות של הגולגולת שנחשפו על ידי חתך לרוחב, ומשוך בעדינות את הגולגולת אל הצד. הגולגולת צריך לקלף בקלות. בעזרת מלקחיים מעוקל, סקופ בעדינות לתוך המוח כדי להסיר אותו.
4. מקום במוח במיכל סטרילי של 5 מ"ל, לשטוף 2 - 3 פעמים עם שטיפת קר כקרח מדיה (של גלוקוז נמוך Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין), כ- 5 מ ל מדיה לכל שטיפת, ולהסיר את הדם.
5. בשכונה למינריות זרימת אוויר, למקם את התוכן של הגורם המכיל 5 מ"ל בצלוחית קטנה (35 מ מ), נח על קרח. באמצעות אזמל סטרילי להב או מספריים סטרילי, הסר את המוח ואת הריח הנורה. להפוך את קו האמצע לחתוך כדי להפריד בין שתי האונות.
6. בזהירות לקלף את השכבה של קרום המוח עם מלקחיים בסדר, מטפל לא לפגוע cortices. לזהות את שכבת קרום המוח כמו שכבה דקה מאוד של תאים עם גוון אדום על פני השטח של המוח, עם כלי דם גלוי. שמירה על המוח קר חיוני להסרת קרומי המוח תקין. אם השכבה של קרום המוח שובר, המשך פילינג משם השברים קרוע עד שיוסר לחלוטין.
7. להעביר את ההמיספרות חדש קטן פטרי (בקירור), מילוי עם שטיפת המדיה. קוצצים את המוח לחתיכות קטנות עם האזמל סטרילי סכין/מספריים.
   הערה: אלה צריכים להיות ~ 1 מ מ² בגודל, להקפיד לא לחתוך אותם לחתיכות קטנות יותר מדי כמו זה עשוי להפחית את התשואה.
8. להוסיף µL 100 פפאין (מניות U/מ ג 17) ו- 150 µL DNase אני לתוך המדיה דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C
9. בעקבות עיכול, triturate רקמות באמצעות פיפטה של P1000. אם הרקמה חלקים גדולים מדי כדי להזין את פיפטה, שקול להשתמש בזוג או מספריים סטרילי להרחיב את הטיפ פיפטה. במהלך תהליך זה, לטפל לא כדי להציג בועות לתוך המדיה כמו זה עשוי להפחית את הכדאיות התא.

2. מיאלין פסולת להסרת

1. תחת תא למינארי להשתמש הציוד סטרילי, להכין צינור חרוטי 50-mL עם 100 מיקרומטר תא מסננת, עבור כל המוח. שופכים את תכולת הפטרי, המכיל את תקציר בינוני והמוח החתיכות על גבי מסננת. יקדם את החלקים של המוח באמצעות הבוכנה של מזרק mL 3 סטרילי בתנועה שחיקה עד שיש אין רקמות יותר גלוי. בעקבות עיכול, רקמת המוח צריך להתפרק בקלות.
2. ללא הרף לשטוף את המסנן עם התקשורת לשטוף, מאת מצטייד מסננת את התא לאורך כל התהליך הזה. זה ואשטוף דרך תאים לכוד בתוך מסננת...
   הערה: זה צריך להיעשות עד שיש כ ~ 15 מ"ל בצינור. זה כדי להבטיח כי מסננת מספיק נשטף דרך וכדי למקסם את כמות התאים שנאספו.
3. Centrifuge התליה תא בודד ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. במהלך תקופה זו, להכין את המדיום הדרגתיות צפיפות כמתואר.
   1. הכינו את percoll מול מניות (SIP), אשר הוא המדיום צפיפות הדרגתי בשימוש. לעשות זאת על-ידי הוספת 9:1 יחס של צפיפות בינונית הדרגתיות 10 x סטרילי הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS).
   2. להכין מעברי צבע עד 30% SIP ב- DMEM ו- 70% ללגום ב 1 x HBSS. לדוגמה, כדי להכין 10 מ"ל של 30% SIP, להוסיף 3 מ"ל של SIP 7 mL DMEM.
4. וארוקן את תגובת שיקוע צינורות חרוט, resuspend בגדר תא 8 מ של 30% ללגום ב- DMEM. להעביר את אמצעי האחסון מלא צינור חרוטי טריים 15 מ"ל.
5. ביסוד הפתרון SIP 70%. כדי לעשות זאת, למלא פיפטה העברה של 70% SIP וקדם בקפידה העברת פיפטה לתחתית הצינור חרוט. לאחר הטיפ קרוב לתחתית, דחף בעדינות דרך התוכן של פיפטה העברה.
   הערה: לעשות את זה לאט כדי לא לשבש את הממשק 30/70. בטח יש קו ברור המפריד בין שתי השכבות.
6. Centrifuge את השכבות SIP, לרבות תאי, ב g x 650 ועם בלם 0 ההאצה 4, 25 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: זה חיוני כדי להשלים את הסיבוב עם בלם את ולאפשר לצנטריפוגה לבוא לאט לקיפאון, כמו יישום של בלם לשבש את לאטמוספרה, להפחית באופן דרמטי את האוסף תא בין שכבות SIP.
7. האחות ההריסות הסלולר בחלק העליון של הצינור, ולהסיר כ 4 מ"ל מדיה מלמעלה. זה תקל את ההסרה של תאי תאי בשלב הבא. בזהירות בעזרת פיפטה P1000, אפשרות להוריד את הטיפ פיפטה לכיוון לאטמוספרה. לבודד תאי תאי מממשק 30/70 צפיפות בינונית הדרגתיות. לאסוף כ 3 מ"ל ממשק מעונן והעברה אל צינור חרוטי 15 מ"ל. בעקבות זאת, לדלל את התערובת עם 9 מ של HBSS כדי לסייע הסרה של המדיום הדרגתיות צפיפות.
8. Centrifuge את צפיפות מדולל הדרגתיות לאטמוספרה בינוני, המכילות את התאים תאי ב 500 g x עבור 5 דק תשאף תגובת שיקוע resuspend עם מדיום הגידול 1 מ"ל (DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום ו 1% אנטיביוטיקה). בעקבות זאת, מכתים את התאים resuspended עם trypan blue ולבצע ספירת תאים באמצעות של haemocytometer.

3. מגנטי תא מופעל מיון

הערה: השלבים עוברות שינוי מפרוטוקול של היצרנים.

1. Centrifuge תאי תאי שנאספו ב 300 גרם x 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את מדיום הגידול כפי זה יפריע הבידוד מגנטי. באמצעות ספירת באותו המתקבל שלב 2.8, nucleated resuspend-עונה 1 פרק 10⁸ תאים למ"ל ב- PBS (Ca⁺⁺ ו מ ג⁺⁺ חינם) המכילה EDTA FBS ו- 1 מ מ 2%, בטווח נפח של 0.1-2.5 מ ל.
2. להוסיף נפח מלא של תאים nucleated PBS מהשלב הקודם לרכבת התחתית התחתונה עגול פוליסטירן טריים 5 מ ל (12 x 75 מ מ). להוסיף 50 µL CD11b PE labelling מגיב לכל 1 מ של דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור.
3. הוסף µL 70 של מבחר קוקטיילים (שילוב של נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD11b ב- PBS) לכל 1 מ של דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור.
4. מערבבים חלקיקים מגנטיים על-ידי pipetting למעלה ולמטה יותר מ 5 פעמים. להוסיף µL 50/mL המדגם. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות מוגן מפני אור.
   הערה: חלקיקים אלה יוצרים מתחם tetrameric עם הנוגדנים ואז להיקשר אל העמודה מגנטי.
5. אם הנפח הכולל של תערובת התא הוא פחות מ 2.5 מ ל, המובילים אל אמצעי אחסון זה עם PBS (Ca⁺⁺ ו מ ג⁺⁺ חינם) המכיל 2% FBS ו- 1 מ מ EDTA ומערבבים על ידי בעדינות pipetting 2 - 3 פעמים. למקם את הצינור (ללא מכסה) לתוך המגנט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
6. בתנועה רציפה אחת, היפוך מלא המגנט המכיל את צינור s 2-3, לשפוך את תגובת שיקוע. לחזור המגנט זקוף, הסר את הצינורית של המגנט. להכין לשטוף את התאים הנותרים מן העמודה.
   הערה: תגובת שיקוע מכיל תאים unlabelled ולא רצויים, אשר יוסרו על ידי היפוך הצינור עדיין בזמן המגנט. הצינור מכיל את Cd11b המצורף⁺ תאים.
7. לשטוף את התאים על ידי וחזור על שלבים 3.5, 3.6 עוד פעמיים. אם המדגם גדול מ 1 מ"ל, נוספת אני חוזר של שלבים 3.5 ו- 3.6 מומלץ.
8. Resuspend התאים מדיום הגידול הרצוי. לשטוף את הצד של אוסף כלי השיט גם כן (למשל. צינור 15 מ"ל) לאיסוף תאים ומהצדדים של הצינור של להגדיל את התשואות.

4. אימות של טוהר מיקרוגלייה

הערה: מיקרוגלייה העיקרי מבודד 3 L (n = סה כ 5 חיות) אומתו באמצעות פלורסנט תא מופעל מיון (FACS) כדי לקבוע טוהר עבור התוצאות נציג.

1. התרבות התאים בקבוקון T-25 במצע הגידול המכיל 10% FBS לילה, זריעה על צפיפות של 1-2 x 10⁶ תאים לכל את הבקבוק.
2. לשטוף את התאים המבחנות T-25 עם PBS 3 x עבור 5 דקות כדי להסיר את כל התקשורת צמיחה הנותרים, אשר עשויים להפריע trypsinization.
3. להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין להתנתק תאים מן המבחנות. ודא כי אמצעי האחסון של טריפסין מספיקה לכסות את המשטח כולו + בקבוקי שתייה צידניות. בעקבות עדין מתערבל + בקבוקי שתייה צידניות כדי להבטיח כיסוי אחיד של טריפסין, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
4. להרוות את תהליך trypsinization על-ידי הוספת 2 מ של צמיחה המדיה המכילה 10% FBS לתוך הבקבוק.
5. לאסוף את תגובת שיקוע המכילות את התאים trypsinized ואת צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף תאים.
6. הסר את תגובת שיקוע המכילות את מדיום הגידול ואת טריפסין, resuspend בגדר במאגר FACS 500 μL. לבצע את ספירת התאים באמצעות trypan blue.
7. צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. לבצע Fc קולטן חסום על-ידי הוספת μL FACS מאגר 50 + 1 μL ה-FcR חוסם לכל 5 x 10⁶ תאים. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 º C.
   הערה: הבלוק קולטן Fc היא שלב קריטי בהליך מכתימים כדי למנוע קשירה שאינם ספציפיים של immunoglobulins לקולטנים Fc אוכלוסיות תאים חיסוניים. מצור זה אינו משפיע על איגוד במורד הזרם של נוגדנים אחרים.
8. לסיים את תהליך חסימה על ידי דילול עם מאגר FACS μL 500. בעקבות זאת, centrifuge את התערובת המכילות את התאים ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
9. Resuspend במאגר טריים 500 μL FACS.
10. מניחים את רוב התאים (למשל אם resuspending תאי μL 500 FACS מאגר, μL שימוש 400) לתוך צינור מדגם. להפיץ את התאים הנותרים בין הצינורות שליטה, מובילים μL עד 100 למחזור בקרת (למשל עבור 6 שפורפרות הבקרה, לסבול 16.67 μL לתוך כל שפופרת שליטה ו- top 83.33 μL FACS מאגר). להפוך את הקבוצות (שפורפרות הבקרה באותיות מודגשות) כמו Unstained, יחיד צבעונית (CD45, CD11b), הכתם חי/מת בודד, FMOs, צינורות מדגם.
11. גלולה התאים לכל הצינורות על ידי צריך שתוציאו ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
12. כתם התאים בצינור עם נוגדנים μL 1 לכל מאגר FACS μL 100 לכל 5 x 10⁶ תאים. תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
    הערה: השתמש 50 קוקטייל נוגדן μL אם פחות מ 2 x 10⁶ תאים משמשים.
13. לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS μL 500. Centrifuge התאים ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
14. Resuspend התאים במאגר FACS 300 μL.
    הערה: השתמש μl ~ 100 אם ספירת הדם היא פחות מ- 2 x 10⁶.
15. באמצעות ניתוח cytometry זרימה, לכמת התאים הם CD45^נמוך , חיובית עבור CD11b מכתים. אחוז זה מקביל מיקרוגלייה העיקרי מבודד.

5. נוגדן של ראשי מיקרוגלייה

1. צלחת התאים צלחת 96-ובכן-צפיפות של תאים⁵ עונה 1 פרק 10 עם מדיום הגידול, דגירה בין לילה.
2. הסר את תגובת שיקוע, לשטוף 3 פעמים עם PBS.
3. לתקן את התאים paraformaldehyde 4% ב- PBS במשך 15 דקות להסיר כדורגלן עם פיפטה P1000 ולאחר מכן לשטוף אותם 3 פעמים עם PBS + 0.1% טריטון-X.
4. בלוק לכריכה שאינם ספציפיים עם אלבומין שור 3% לשעה בטמפרטורת החדר.
5. דגירה עם הארנב רשות השידור-1 (1: 100) במשך 24 שעות ביממה ב 4 º C. בעקבות זאת, הסר את התערובת נוגדן ראשוני, לשטוף 3 פעמים עם PBS.
6. דגירה עם משני אנטי-ארנב GFP המספר המשלים (1:200) לשעה בטמפרטורת החדר. בעקבות זאת, הסר את התערובת נוגדנים משניים, לשטוף 3 פעמים עם PBS.
7. הר שקופיות עם פלורסנט הרכבה בינונית, לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

6. כימות מיקרוגלייה באמצעות pHrodo Assay

הערה: וזמינותו pHrodo מאפשר זיהוי של רמות של phagocytosis בתאים בתרבית. על ספיגת דרך אנדוציטוזה, הפנמה לסביבה חומצי יותר מגבירה את רמות של זריחה של conjugates bioparticle. לאחר מכן ניתן לכמת רמות קרינה פלואורסצנטית מאת FACS. השלבים הבאים הם ששינה מפרוטוקול של היצרנים.

1. התרבות התאים בבקבוקון T-25 במצע הגידול בן-לילה זריעה על צפיפות של 1-2 x 10⁶ תאים לכל את הבקבוק. לשטוף את התאים T-25 מבחנות עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
2. ניתוק התאים באמצעות טריפסין 0.25% 2 מ"ל. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
3. להרוות את תהליך trypsinisation על-ידי הוספת 2 מ של צמיחה המדיה המכילה 10% FBS לתוך הבקבוק.
4. Centrifuge התליה תא ב g x 500 דקות 5-4 ° C עד הצניפה תאים.
5. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה את מיקרוגלייה ראשי תרבות בינוני-10⁶ תאים למ"ל.
   הערה: לחלופין, צלחת תאים בצלחת 96-ובכן לפחות יום לפני ולכוון עבור 1 x 10⁵ התאים קיימא לכל טוב ביום וזמינותו נמצא שיבוצע.
6. צלחת תאים לתוך צלחת 96-ובכן-עונה 1 פרק 10⁵ תאים/טוב, μL 100 לכל טוב. צלחת פקדים, בארות ניסיוני שהפקידים והשאר באר ריקה אחת לכל בקרת חיובי עבור חיסור רקע תאים ללא שליטה.
7. להוסיף 100 μL של צמיחה מדיה הבארות נשאר ריק עבור חיסור רקע לא-התא.
   הערה: כמו כל שאר במבחנה assay, הפקדים המתאימים הם חיוניים על הדיוק של הקריאות. לצד התא ללא שליטה (רקע קריאה), כוללים גם את הפקד שלילי טוב (המספר המשלים pHrodo נוסף, אך מניחים על הקרח).
8. לכסות את הצלחת ואת תקופת דגירה של h 1 באינקובטור עם 5% CO₂ ב 37 º C.
9. להכין בארות ניסיוני על-ידי הוספת ממריץ וטיפול. להוסיף פקדים הרכב (מדיה גדילה בלבד) וולס לא מטופל.
   הערה: ליפופוליסכריד 1 µg/mL [ממריץ] ו תא האפיתל אנוש השפיר (hAEC)-מדיה ממוזגים [טיפול] שימשו כדי להפיק את התוצאות נציג.
10. הפשרת בקבוקון צבע מצומדת, להוסיף מאגר ספיגת 2 מ"ל, בקצרה מערבולת. להעביר את התוכן צינור לתוך שפופרת זכוכית נקי, sonicate במשך 5 דקות, כדי להבטיח כי חלקיקים מפוזרים באופן אחיד.
11. האחות המדיום תרבות microplate בארות והחלף במהירות 100 μL של השעיה לצבוע. מכסה, דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
    הערה: לזכור כתם הצינורות שליטה גם כן.
12. באמצעות ניתוח cytometry זרימה, לכמת תאים מכתים חיובית החרוזים pHrodo מצומדת ובהווה כאחוז (האב) של פעיל phagocytosing מיקרוגלייה.

7. כימות של אפופטוזיס מיקרוגלייה בעקבות עלבון דלקתיות

1. חזור על השלבים 1-7 מהסעיף "אימות של מיקרוגלייה טוהר".
2. מניחים את רוב התאים (למשל אם אתה resuspended תאי μL 500 FACS מאגר, μL שימוש 400) לתוך צינור מדגם. להפיץ את התאים הנותרים בין הצינורות שליטה, מובילים μL עד 100 למחזור שליטה (למשל עבור שפורפרות הבקרה 6, לסבול 16.67 μL לתוך כל שפופרת שליטה ו- top 83.33 μL FACS מאגר). קבוצות (שפורפרות הבקרה באותיות מודגשות): כתמים וללא רבב, יחיד (AnnexinV, Propidium יודיד), יחיד חי/מת הכתם, FMOs, דוגמת צינורות.
3. גלולה התאים כל הצינורות על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x במשך 5 דקות.
4. דגירה עם 1 μL נוגדנים/100 μL FACS מאגר/5 x 10⁶ תאים עבור 20 דקות ב 4 º C.
   הערה: השתמש 50 μL אם פחות מ 2 x 10⁶ תאים.
5. לשטוף את התאים על-ידי הוספת 500 μL FACS מאגר צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות.
6. Resuspend בגדר תא במאגר FACS 300 μL.
   הערה: ~ 100 μL אם ספירת הדם היא פחות מ- 2 x 10⁶.
7. לכמת תאים בתוך כל רביע (Q1: נמק, Q2: מוות מאוחר, Q3: מעשית, ש4: מוות מוקדם).

תוצאות

באמצעות השיטות המתוארות כאן, אוכלוסיות טהור של מיקרוגלייה ניתן לבודד והוא יכול להיות מוכן אפיון באמצעות במבחנה וניתוח FACS. כדי להתחיל עם, עד 18 בעלי חיים יכולים לשמש לכל cull, עם התשואה הצפויה של-450,000-600,000 microglial תאים. זה חיוני לאשר תחילה את הטוהר של תאים מבודדים, לעשות ניתו...

Discussion

מיקרוגלייה יש את היכולת להיות גם פרו - דלקתי, ששונו על-ידי סביבת גירויים. מחקרים קודמים הראו שמודולציה של הפעלת מיקרוגלייה יכול להתייעץ neuroprotection. היכולת שלהם לספק הגנה את הנוירונים ותיקון פציעה מחייבת מחקר נוסף כדי לקדם את ההבנה הנוכחית של תאים מורכבים אלה. לכן, בידוד של טוהר גבוהה מיקרוגלי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, low glucose, pyruvate	Gibco	11885084
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grade II from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep magnet variant
EasySep magnet	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphate buffered saline	Gibco	14040182
Trypsin (2.5%) (10X)	Gibco	15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Corning	352063
175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap	Corning	431080
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom	Corning	CLS3799
Paraformaldehyde (powder, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-Iba1	Wako	01919741
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Antibodies	Company	Catalog Number
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodide solution	Miltenyi Biotech	130-093-233