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Resumen

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Resumen

Células dendríticas (DC) son poblaciones celulares heterogéneas que difieren en sus marcadores de membrana de la célula, patrones de migración y distribución y en su presentación del antígeno y la capacidad de activación de la célula de T. Puesto que las vacunas la mayoría de modelos de tumores experimentales requieren millones de DC, son ampliamente aislados de la médula ósea o bazo. Sin embargo, estos DC significativamente diferentes de la sangre y tumor DC en sus respuestas a complejos inmunes (CI) y presumiblemente a otros receptores de lectina acoplados a Syk. Importante, dada la sensibilidad de la C.C. a moléculas asociadas de peligro, la presencia de endotoxinas o anticuerpos receptores de activación de la reticulación en uno de los aislantes que podría dar lugar en el oscurecimiento de la C.C. y así afectan los parámetros, o por lo menos el dosis, necesaria para activarlos. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo detallado para aislar MoDC de sangre y los tumores mientras que evita su activación prematura. Además, un protocolo de activación de MoDC con tumor IC, y sus posterior análisis.

Introducción

Desde su descubrimiento, las células dendríticas (DC) han sido un foco de investigación debido a su capacidad única para sesgar la diferenciación de células T1. En las últimas décadas, un esfuerzo de investigación ha tratado de definir los distintos subconjuntos de DC y su función durante la progresión del tumor y de la inmunidad 2. DCs se componen de poblaciones celulares heterogéneas que difieren entre sí en sus receptores de reconocimiento de patrones, distribución en los tejidos, y migratorias y antígeno presentación capacidades3,4,5. En comparación con otros subconjuntos de DC, DC derivados de monocitos (MoDC) son mucho más abundante en los tumores y se pueden generar fácilmente de circulación o infiltrantes de tumor monocitos6,7. Por lo tanto, muchos ensayos clínicos que buscan tomar ventaja de su prevalencia relativa se basan en la manipulación in vivo y ex vivo de MoDC autólogo para provocar inmunidad de células T 8,9.

Del mismo modo, vacunación basada en DC de modelos de tumores experimentales requiere inyecciones seriales 2-3, 5-7 días separados, de 1-2 x 106 activado DC pulsada con antígenos tumorales. Por lo tanto, para lograr este gran número de DC, más estudios con ratones han utiliza principalmente MoDC cultivada a partir de precursores de médula ósea (MO) en GM-CSF para 7-9 días (IL-4 no es necesario en la configuración del ratón)10,11. Sin embargo, nocaut de GM-CSF tienen ratones en general normal DC compartimiento 12,13y las poblaciones mixtas de esa cultura,14 la relevancia fisiológica de estos DC ha sido cuestionado.

Alternativamente, DC puede ser sistemáticamente aislada de células de bazo. Sin embargo, DC componen solamente cerca de 0.3-0.8% de células de bazo total (dando por resultado aproximadamente 7 x 105 DC esplénica) y de estas células, solamente CD103+ DC y MoDC pueden migrar hacia los órganos linfoides. Desde MoDCs comprenden aproximadamente el 10-15% de esplénico DC las poblaciones15,16, más protocolos de aislamiento producen aproximadamente 1 x 105 MoDC por bazo. Expansión de MoDC puede lograrse mediante la inyección de células B16 transfected que segregan GM-CSF, resultando en un 100-fold incremento en esplénica MoDC17. Sin embargo, el uso de MoDC para desarrollo de vacunas de la CC es limitado ya que este procedimiento no se puede hacer en los seres humanos y los obtenidos MoDC son ya altamente activa.

Además de obtener un número adecuado de DC, otro desafío para el desarrollo de vacunas efectivas de DC contra las células cancerosas autólogo consiste en la falta de suficientes señales de peligro en el entorno del tumor para activar completamente el DC. Inducción de señales coestimuladoras se logra a través de la activación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), o lectinas tipo c señalización vías18,19,20,21. Otro acercamiento para activar CC explota su capacidad para tomar los antígenos a través de interacciones con receptores Fcγ de la superficie (FcγR). De hecho, un número de manuscritos importantes han demostrado que inyección de MoDC de precursores BM activadas con tumor-IgG IC puede prevenir el crecimiento del tumor en configuración profiláctico y puede conducir a la erradicación de tumores establecidos22,23 .

En dos trabajos recientes, Carmi et al descubrieron que en contraste con BMDC y bazo DC, MoDC de la sangre y los tumores no puede responder a IC IgG sin estímulos adicionales. Esto fue encontrada para ser debido a la presencia de altos niveles intracelulares de tirosina fosfatasas regulación FcγR señalización24,25. Definiendo un punto de control crítico en DC, este trabajo proporciona una penetración importante en los requisitos de vacunación exitosa basada en DC. La necesidad de estímulos adicionales permitir FcγR señales y señalización de otros receptores de lectina utilizando una cascada de fosforilación similares, probablemente así subraya la necesidad de evitar el oscurecimiento de la C.C. durante su aislamiento.

Por lo tanto, el presente Protocolo describe el aislamiento de MoDC de sangre y tumores, que difieren marcadamente de BM y bazo DC, y destaca las precauciones dignas de consideración durante el proceso.

Protocolo

Los protocolos siguientes se refieren al aislamiento de ratón MoDC, sin embargo, los principios generales pueden aplicarse a otras células de subconjuntos de DC, así. 12 - ratones C57Bl/6j de 16-semanas de edad se mantuvieron en una asociación americana para la acreditación de laboratorio Animal Care – acreditado Animalario. Todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Stanford y Universidad de Tel Aviv institucional Animal cuidado y uso.

1. aislamiento de Tumor asociados derivados de monocitos DC

  1. En campana de flujo laminar, quitar tumores de CO2 eutanasia ratones y tumores en Medio RPMI sin suero fetal bovino (FBS).
    Nota: Se recomienda altamente los ratones y rociarlas con etanol al 70% antes de quitar los tumores, para minimizar la contaminación potencial de la piel. Asegúrese de que el tumor no supere los 25-40 mm2 puesto que los tumores más grandes tienen menos DC que tienden a ser frágiles y propensos a sufrir muerte celular. Si necesita un número mayor de DC, se puede inyectar cada ratón con células de tumores en múltiples sitios.
  2. Bajo una campana laminar estéril, picar los tumores utilizando tijeras de cirugía en pequeños pedazos (aproximadamente 1 x 1 mm2).
    1. Añadir todos los fragmentos del tumor de un ratón en un 30-mL fondo plano tubo estéril con barras de agitación magnética, que contiene 5 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS), colagenasa IV de 2 mg/mL y 0.01 mg/mL DNasa I.
      PRECAUCIÓN: Células mieloides producen energía a través de glicosilación, incluso en estado estacionario. Por lo tanto, únicos medios de uso que contiene glucosa (HBSS, RPMI y DMEM), como hambre de glucosa para tan poco como 10-15 min resultará en la muerte celular y apoptosis en 24 h. uso sólo una colagenasa bajo endotoxina IV, como la colagenasa es producida por gram-positivos bacterias (Clostridium histolyticum).
  3. Revuelva en cerca de 200-400 rpm en un incubador de 37 oC, con un agitador magnético durante 20-30 minutos.
  4. Añadir 5 mL de medio completo y resuspender vigorosamente.
  5. Filtro de las células a través de un tamiz celular de 70 μm. Centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos para que sedimenten las células.
    PRECAUCIÓN: No intente aislar las células inmediatamente después de la digestión enzimática, ya que algunos tumores necróticos contienen cantidades relativamente grandes de restos celulares o matriz extracelular. Aplicar células en 15% densidad gradiente medio para obtener únicamente las células.
  6. Suspender 9 mL de medio de gradiente de densidad con 1 mL de PBS de x 10 para ajustar la osmolalidad y obtener 100% solución de Percoll. Mezcla 1.5 mL densidad gradiente medio stock solución con 8,5 mL HBSS y mezcla vigorosamente con pellet de células tumorales. Suavemente de la capa 2 mL de DMEM en la parte superior 15% densidad gradiente medio y centrifugar a rcf 400 por 20 min a temperatura ambiente. Descartar los sobrenadantes, como las células formarán un balín en la parte inferior del tubo.
    1. Lavar las células pildoradas dos veces suspendiendo a los 10 ml que contiene 2% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 10 mM EDTA (tampón de aislamiento) y centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos para que sedimenten las células HBSS.
    2. Contar las células en un hemocitómetro con trypan azul bajo un microscopio de luz.
  7. Vuelva a suspender 1 x 108 células por separado 1 mL de búfer e incúbelos a 4 oC con 30 μL de CD11b conjugado de+ granos magnéticos durante 15 minutos.
    PRECAUCIÓN: Evite el uso de granos de CD11c conjugado, ya que esto activa el DC e inducir la muerte celular. No intente bloquear FcγRII y FcγRIII con anticuerpos anti-CD16/32. Bloqueo de anticuerpos ligar FcγR inducen fosforilación fuerte de MAP quinasas y cebar el DC.
    1. Quitar los granos exceso añadiendo 9 mL de tampón de aislamiento y centrifugar las células a rcf 400 5-10 min a 4oC.
  8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de tampón de aislamiento. Se aplican las celdas en una columna magnética prelavada. Lavar la columna dos veces con 3 mL de tampón de aislamiento.
    1. Retire la columna del imán. Pipeta de 6 mL de tampón de aislamiento a la columna y eliminar las células etiquetadas magnéticamente en un tubo estéril para recogida empujando el émbolo. Centrifugar las células en rcf 400 5-10 min a 4 oC.
    2. Resuspenda las células en 100 μL por 1 x 107 células y tinción con los anticuerpos conjugados fluoróforo siguientes: linaje negativo (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI y Ly6G), MHCII, Ly - 6C.
  9. Ordenar celdas por que bloquean las células pequeñas, con dispersión lateral (SSC) y adelante scatter (FSC) y la cultura en completo suplementado con 5 ng/mL GM-CSF. Incube las células durante 1 hora a 3 7 oC para permitir que los macrófagos que se adhieren a la placa. Luego, transferir el libremente y no adherente células a un nuevo plato de cultura.
    Nota: MoDC de ratón se definen como CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int 7,26,27. Expresión de Ly6C puede variar dramáticamente entre modelos de tumores y en algunos modelos (por ejemplo, LMP) MoDCs carecen totalmente de expresión Ly6C. En general, un tumor de3 B16F10 de 100 mm por lo general contiene 5 x 104 de DC, lo que resulta en aproximadamente 4-5 x 106 células totales. De estas células, 10-15% son células inmunes y 8-10% MoDC. Aumento en el número de C.C. puede lograrse mediante la inyección a ratones con tumores en múltiples sitios. Las células SSC/FCS pequeña especie, como otras células mieloides pueden expresar marcadores como CD11c y Ly6C.
    Opcional: Tipo el monocito como pequeñas células SSC/FSC que expresar Ly6CHola y son negativos para MHCII infiltrantes de tumor. Después, la cultura monocitos en vitro con GM-CSF de 50 ng/mL para obtener DC.

2. aislamiento de DC derivados de monocitos de sangre periférica

Nota: Desde MoDCs maduros son relativamente raras en la sangre de ratón, el protocolo que a continuación se refiere a su derivación en vitro de monocitos ordenados.

  1. Para aumentar los niveles de monocitos en la sangre, anestesiar ratones con 4% de isoflurano y les inyecta por vía subcutánea (s.c.) con 1 μg de GM-CSF en 50 μL PBS.
  2. Después de 1-2 h, sacrificar ratones con CO2.
    PRECAUCIÓN: No sacrificar ratones por dislocación cervical, ya que esto causará hemorragia interna.
  3. Inmediatamente después euthanization, rocíe el ratón con etanol al 70% y quitar la piel que cubre el corazón con unas tijeras quirúrgicas, bajo campana de flujo laminar estéril. Limpiar las tijeras con etanol y cortar la aurícula derecha del corazón. Poco a poco, limpie el corazón por el ventrículo derecho con 20 mM EDTA HBSS utilizando una jeringa de 10 mL y aguja de 25 G.
    1. Recoger la sangre con una jeringa estéril de la cavidad pleural en un tubo estéril que contiene sulfato de heparán y EDTA. Seguir lavar el corazón hasta el hígado y rosa de los pulmones se convierten o blanco.
  4. Aplicar sangre en una centrifugadora de americanos gradiente de densidad en rcf 400 a temperatura ambiente durante 15 minutos con poco freno.
    PRECAUCIÓN: Gradiente medio uso libre de endotoxina densidad (generalmente menos de 0.12 EU / mL).
    1. Recoger las células mononucleares en un tubo nuevo. Lavar las células suspendiendo nuevamente en 10 mL HBSS conteniendo 2% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina 10 mM EDTA (tampón de aislamiento) y luego centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos para que sedimenten las células.
      PRECAUCIÓN: Utilice solamente los medios de comunicación que contiene al menos 1 g/L de glucosa.
  5. Para la selección positiva de CD11b, vuelva a suspender 1 x 108 células en 1 mL de tampón de aislamiento e incubar por 15 min con 50 μL de granos magnéticos CD11b conjugado a 4 oC.
    1. Lavar granos exceso añadiendo 9 mL de tampón de aislamiento y centrifugación en rcf 400 5-10 min a 4 oC. aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de tampón de aislamiento. Se aplican las celdas en una columna magnética prelavada según instrucciones del fabricante.
    2. Quitar la columna del imán, pipeta de 6 mL de tampón de aislamiento a la columna y lave las células etiquetadas magnéticamente en un tubo estéril para recogida empujando el émbolo. Centrifugar las células a rcf 400 5-10 min a 4 oC. Wash la columna dos veces con 3 mL de tampón de aislamiento.
    3. Resuspenda las células en 1 x 107 células/100 μL aislamiento buffer y tinción con los anticuerpos conjugados fluoróforo siguientes: 0,1 μg CD115, 0.25 μg MHCII y 0.1 μg Ly-6C/1 x 106 células.
  6. Ordenar celdas por compuerta en el lado pequeño scatter (SSC) y células pequeñas forward scatter (FSC).
    Nota: Monocitos inflamatorios ratón se definen generalmente como CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6CHolay patrullaje monocitos se definen como CD115+/MHCII de /Ly6Clo/negneg 4,5. En casos donde no hay separación entre los dos subconjuntos es necesario, total SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo las células se pueden clasificar. Ingenuo y ratones con tumores contienen aproximadamente 5-8 x 104 MoDC por 1 mL de sangre y hasta 4-5 x 105 MoDC siguiente inyección de GM-CSF. De ellos, aproximadamente el 70% son monocitos inflamatorios y patrullando 30% monocitos.
  7. La placa de las células a una concentración de 1 x 106 células/mL en un medio completo suplementado con GM-CSF de 20 ng/mL. Después de 1 día, transferir las células no adherentes y adherentes libremente a una placa nueva y la cultura para 4-5 días adicionales.
    PRECAUCIÓN: Los medios de DC no deben suplementarse con piruvato.

3. preparación de complejos inmunes de IgG de Tumor

  1. Células tumorales de la cultura en frasco de cultura2 de 75 cm a la confluencia de 70% en medios DMEM completo.
    1. Añadir 2 mL de 0.25% tripsina/EDTA para separar las células de la cultura frasco y monitor de morfología de la célula bajo un microscopio de luz para evitar el exceso de la tripsinización.
    2. Añada 8 mL de medio de cultivo completo (por cada 2 mL de tripsina) para inhibir la digestión de la tripsina y centrifugar a 4 oC, rcf 400 para 5-10 minutos para que sedimenten las células.
      Nota: Asegúrese de chequear las células tumorales para Mycoplasma utilizando un kit comercial de PCR. Ensayo de prueba para la presencia de bacterias gramnegativas y endotoxinas hongos con Lisado de amebocitos de Limulus (LAL)28). Suero debe ser filtrado a través de 0.22 μM y testado para el 9 virus del código de regulaciones federales. Además, pruebe los medios de cultivo y sueros que cae 100-200 μL en LB-agar o caldo y cultura por 2 días a 37 oC.
    3. Células de lavado otra vez restos de tripsina y suero por volver a los suspensión en 10 mL de PBS y centrifugar a 400 rcf durante 5-10 min aspiración el sobrenadante y repetición el lavado 2 veces más.
  2. Fijar las células en 1,8% tamponada con paraformaldehido por 10 min a temperatura ambiente.
    1. Lavar las células volver a los suspensión en 10 mL de PBS y centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 min.
    2. Sobrenadantes de aspirado y repetición de lavado dos veces más.
      Opcional: Para ensayos de captación del tumor, las células pueden ser etiquetadas por incubar 5 min a 37 oC en PBS con un éster de succinimidyl carboxyfluorescein de 1 μM (CFSE). CFSE se apaga entonces con medios completo para 10 min en hielo. Las células deben lavarse exhaustivamente en PBS con un 2% de suero para eliminar tinte residual.
  3. Resuspenda las células en tampón FACS (PBS complementado con 2% FCS + 5 mM EDTA) y 0,5 μg/mL de anti-CD16/32 para bloquear posibles interacciones de proteínas no específicas. Placa en una forma de U 96 pozos/de la placa en una concentración de 1 x 105 células por μL 100.
    1. Añadir diferentes diluciones de anticuerpos de unión a tumor que van desde 5 μg - 5 ng/1 x 105 células. Incubar la placa de hielo durante 15-20 min.
      Nota: IgG anticuerpos fueron aislados del suero de ratones hembra de 20-24 semanas de ingenuo en columnas de proteína A, como describe24.
  4. Lavar las células añadiendo 150 μL de PBS y centrifugar la placa a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos.
    1. Deseche el sobrenadante y repetir el lavado dos veces. Resuspenda las células en 100 tampón FACS de μL que contiene anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo. Incube la placa en el hielo por 20 min.
    2. Lavar las células mediante la adición de 200 μL de tampón FACS y centrifugar la placa a 400 rcf durante 5-10 minutos descartar los sobrenadantes y repetir el lavado.
    3. Analizar el enlace del tumor mediante citometría de flujo y determinar la concentración mínima necesaria para las células de la capa.
      Nota: Los anticuerpos que no aumenten intensidad de fluorescencia media (IFM) de células del tumor manchadas por al menos cinco veces por el control de isotipo no deben utilizarse en posteriores ensayos funcionales.

4. activación de MoDC con IC Tumor-IgG

  1. Capa de las células del tumor con la concentración mínima de IgG, como se describe en las secciones 3.1 a 3.4.3
    1. Un día antes de activar MoDC con tumor IC, reemplazar MoDC cultura media, que contiene el GM-CSF. Para ello, suavemente los medios de comunicación de aspirar y lavar las células una vez con medios de cultivo completo precalentado.
      Nota: Se debe cultivar aislado MoDC madura asociada a tumor de por lo menos 2-3 h (o incluso durante la noche) después de su clasificación en medios completo sin GM-CSF y antes de activar con el IC.
    2. Para el análisis de la captación del tumor, agregar en una proporción de 1:5 (IC:MoDC) el tumor marcado con CFSE IC a MoDC e incubar durante una noche para 12-16 h en 1 mL de medio completo por 1 x 106 DC.
    3. Para análisis FACS de experimentos de activación de MoDC, agregar IC tumor en proporción 1:1 (IC:MoDC) e incube durante la noche por 12-16 h.
      Nota: Se recomienda incluir un control positivo, en que MoDC son estimulados con 1 μg/mL de LPS o de otros agonistas TLR.
    4. Tras la activación, aspirar el sobrenadante y lave las células suavemente tres veces con tampón de aislamiento, o de 10 mM EDTA HBSS.
    5. Para desconectar el DC de la placa, incubar células de 2-3 minutos en 1 mL HBSS conteniendo 10 mM EDTA y separar las células mediante pipeteo vigoroso.
    6. Centrifugar las células a rcf 400 y resuspender 1 x 106 DC en 90 de μL de PBS suplementado con 2% FCS, 5 mM EDTA (tampón FACS) y 0,5 μg de bloqueo de los anticuerpos. Incubar en hielo durante 5-10 minutos.
    7. Añadir 10 μL de la mezcla de anticuerpos a las células de coloración e incubar en hielo por 15 min.
    8. Añadir FACS de 2 mL de tampón a las células y centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos.
  2. Resuspenda las células en solución tampón FACS de 200 μL.
    1. Agregar 0.5 - 1 μg/mL de DAPI 1-2 min antes de correr las muestras, para excluir las células muertas del análisis. No sobre-incubar DAPI, como MoDC se llevará dentro de 10-15 minutos.

Resultados

Inicialmente se comparó la capacidad de los anticuerpos de ratones syngeneic y allogeneic ingenuo para atar a las células del tumor. Para ello, B16F10 y LMP líneas de células tumorales fueron fijadas en paraformaldehido y lavadas ampliamente. B16F10 es una línea celular de melanoma, que fue originalmente aislada de las metástasis del pulmón en ratones C57Bl/6. LMP es una célula de tumor pancreático que fue aislada de KrasG12D / + ratones LSL-Trp53R172H / + y Pdx-1-Cre y crece con...

Discusión

Dada la gran cantidad de CC necesario para la vacunación de ratones (aproximadamente 2-4 x 106 DC por un ratón), la mayoría de la vacunación en ratones las estrategias se basan en aislamiento del DC de BM y bazo, seguido por su activación ex vivo . Sin embargo, intenta activar tumor DC en vivo, usando las mismas condiciones para activar bazo y BM DC, a menudo han tenido éxito en producir inmunidad efectiva. En dos publicaciones posteriores, Carmi et al. han encontrado que sangr...

Divulgaciones

Todos los autores declaran no tienen ningún conflicto de interés y que no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Ninguno

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19861
Collagenase IVSigmaC9697-50MGTest each lot for endotoxin
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071Test each lot for endotoxin
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

Referencias

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