Trasplante de células madre derivadas de tejido adiposo hoja para reducir fugas después de colectomía parcial en un modelo de rata

Resumen

Se presenta la preparación y el trasplante de tejido adiposo derivado de la célula de vástago (ASC) hojas en anastomosis colorrectales suficientemente suturadas en un modelo de rata. Esta aplicación novedosa muestra que hojas ASC pueden reducir la fuga de la anastomosis colorrectal.

Resumen

Fuga anastomótica es una complicación catastrófica después de la cirugía colorrectal. Aunque los métodos actuales para la prevención de fugas tienen diferentes niveles de eficacia clínica, son hasta ahora imperfectas soluciones. Terapia de células madre utilizando hojas de ASC podría proporcionar una solución a este problema. ASCs son considerados como prometedores candidatos para promover tejido de cicatrización debido a sus propiedades tróficas e inmunomoduladores. Aquí, ofrecemos métodos para producir alta densidad hojas ASC, que se trasplantan en una anastomosis colorrectal en un modelo de rata para reducir la fuga. ASCs forman hojas celular en platos termo-sensible de la cultura que pueden ser desmontados fácilmente. En el día del transplante, se realizó una colectomía parcial con una 5-sutura en la anastomosis colorectal. Los animales fueron trasplantados inmediatamente con 1 hoja ASC por rata. Hojas ASC se adhirieron espontáneamente a la anastomosis sin ninguÌ n pegamento, sutura o cualquier biomaterial. Grupos de animales fueron sacrificados 3 y 7 días después de la operación. Comparado con animales trasplantados, la incidencia de abscesos anastomóticos y la salida fue mayor en los animales control. En nuestro modelo, el trasplante de hojas ASC después de anastomosis colorrectal era acertado y asociado con una menor tasa de salida.

Introducción

Colectomía parcial con una anastomosis primaria es una cirugía comúnmente realizada que se puede hacer para muchas enfermedades que afectan el colon como el cáncer colorrectal, enfermedad de Crohn y diverticulitis^1,2. La más temida complicación después de la fuga anastomótica³anastomosis colorrectal. Aunque se han identificado varios factores de riesgo asociados a fugas anastomóticas, soluciones para la prevención de fugas siguen siendo desconocido^4,5.

Células estromales derivadas de tejido adiposo (ASCs) están asociadas con propiedades antiinflamatorias y tróficos^6,7, que hace que estas células prometedores candidatos para terapias regenerativas⁸. La eficacia de ASCs para promover la curación del tejido fue demostrada en varios tejidos como el músculo cardiaco, piel y esófago^{9,10,11,12,13}. Sin embargo, hay pocos informes sobre el uso de ASCs para promover la curación intestinal. Trasplante local de ASCs para anastomosis colorrectales experimentales vía biosutures recubierto de ASC serosas inyecciones de ASCs no mostraron o mejora en la curación de¹⁴ o no impidió la fuga anastomótica a pesar de un más favorable anastomótica cura de¹⁵.

Trasplante local de ASC en suspensión o en combinación con biomateriales pueden asociarse a retención insuficiente de células o una distribución inadecuada de las células trasplantadas¹¹. Células hoja tecnología^16,17 ofrece un método innovador de ASC entrega^18,19. Por lo tanto, en un estudio anterior, se propuso un nuevo enfoque en que ASC organizada en una celda de la hoja podría aplicarse en anastomosis colorrectal experimental²⁰. Este estudio demostró que la ASC hoja trasplante es exitoso en la reducción de fugas de anastomosis colorrectal después de la colectomía parcial en un modelo de rata. Este artículo divulga ASC hoja preparación y técnica quirúrgica del trasplante.

Protocolo

El tejido adiposo abdominal subcutáneo se obtuvo de donantes humanos con la aprobación de la Comisión de ética médica (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Holanda. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Comité ético de Experimentación Animal, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Países Bajos (133-14-01).

1. cultivo y aislamiento de ASCs humano

1. Preparar 3 mL de medio de aislamiento de 1 g de tejido adiposo. Glucosa baja mezcla Dulbecco de medio de Eagle modificado (LG-DMEM) con bovinos de 10 g/L albúmina sérica (BSA) y la colagenasa 1 g/L tipo 1.
2. Disecar el tejido adiposo abdominal subcutáneo humano (n = 8, todas mujeres, media de los 40 años ± 9 años de edad) a trozos pequeños (0,5 cm) utilizando una cuchilla quirúrgica estéril tamaño 10, fórceps del tejido de Adson-Brown y tijeras de Metzenbaum en un estéril SafetyCabinet biológica.
3. Guarde el tejido disecado en estéril frasco de almacenamiento en cuanto a los medios de comunicación. Pesar la cantidad total de tejido disecado y comenzar la digestión con el medio de aislamiento preparada (50 g de tejido adiposo con 150 mL de medio de aislamiento por la botella). El protocolo puede pausarse aquí guardando la botella con la diseca el tejido adiposo y aislamiento medio a 4 ° C en un mezclador de rodillos durante la noche. Luego Precaliente la botella al día siguiente a temperatura ambiente 25 ° C durante 15 minutos antes de continuar con el siguiente paso.
   Nota: El tejido adiposo abdominal subcutáneo fue obtenido como material sobrante de donantes sometidos a cirugía de reconstrucción de mama con la aprobación de la Erasmus MC médico Comité de ética (# MEC-200) y de acuerdo con el código de conducta: "uso secundario adecuado de tejido humano"(< http://www.federa.org>). El tejido adiposo sobrante fue utilizado solamente de donantes que no optar a la utilización secundaria.
4. Digerir el tejido adiposo disecado en una botella de almacenamiento de medios de vidrio estéril en un Incubador agitador a 150 rpm y 37 ° C durante 1 h.
5. La solución digerida se dividen en tubos de 50 mL y centrifugar los tubos durante 10 min a 390 x g.
6. Preparar medio de cultivo: LG-DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 50 de μg/mL gentamicina y 1.5 μg/mL ampothericin B.
7. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 20 mL de medio de cultivo (LG-DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 50 de μg/mL gentamicina y 1.5 μg/mL ampothericin B). Centrifugar las células nuevamente por 5min a 390 x g y eliminar el sobrenadante.
8. Resuspender el pellet celular con 10 mL de medio de cultivo (LG-DMEM suplementado con 10% FBS, 50 de μg/mL gentamicina y ampothericin B de 1.5 μg/mL) y filtre la suspensión de células a través de un filtro de 100 μm.
9. Añadir 50 μl de la solución de 3%, ácido acético, metileno azul (para lisis de glóbulos rojos) a 50 μl de suspensión celular, mezclar la solución y utilizar 10 μL para contar las células. Realizar el celular cuenta con un hemocitómetro. Entonces la placa las células a una densidad de 40.000 células/cm² en medio de cultivo (LG-DMEM suplementado con 30% FBS, 50 de μg/mL gentamicina y ampothericin de 1.5 μg/mL B).
10. Incube las células a 37 ° C en atmósfera húmeda con 5% CO₂ durante 24 h.
11. Tras la incubación, lavar las células con fosfato caliente (37 ° C) tampón salino (PBS) para eliminar restos celulares y reemplazar los medios de comunicación con medio de cultivo 10% FBS con recién añadieron ácido ascórbico 2-fosfato (25 μg/mL) y el crecimiento de fibroblastos recombinante humano factor 2 (FGF2, 1 ng/mL).
12. ASC de subcultura en el 90% de confluencia con solución estándar 0.25% tripsina EDTA (3 mL en un matraz T175). Después de 3-5 min, neutralizar la solución 0.25% tripsina EDTA con 10 mL de medio de cultivo (LG-DMEM suplementado con 10% FBS, 50 de μg/mL gentamicina y ampothericin de 1.5 μg/mL B).
    Nota: Flujo cytometry análisis con marcadores de superficie ASC común y la diferenciación de tri-linaje ensayos realizaron previamente y reveló que ASC aislados usando este protocolo muestra ASC características específicas^21,22.
13. Lavar las células con 10 mL de medio de cultivo (LG-DMEM suplementado con 10% FBS, 50 μg/mL gentamicina y ampothericin de 1.5 μg/mL B) para un matraz T175 y centrifugar las células durante 8 min a x 250 g. eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de medio de cultivo. Contar las células con un hemocitómetro.
14. Placa las células T175 frascos de cultivo a una densidad de 8.000 células/cm².
15. Congelar el ASCs restantes en nitrógeno líquido con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en medio de cultivo antes de su uso posterior.

2. ASC hoja preparación

1. La capa platos termo-sensible de la cultura (3,5 cm de diámetro) con 1 mL de SBF, luego coloque los platos en una incubadora a 37 ° C durante al menos 30 minutos antes de sembrar células.
2. Trypsinize ASC con solución estándar de EDTA de tripsina 0.25% durante 3-5 min (3 mL en un matraz de cultivo T175). Si hay cualquier grupos de células después de la tripsinización, filtrar las células a través de un filtro de 100 μm antes de contar.
3. Neutralizar la solución de tripsina con LG-DMEM suplementado con 10% FBS (10 mL en un matraz T175) y Centrifugue la suspensión de células durante 8 min a x 250 g. eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de LG-DMEM suplementado con 10% FBS.
4. Después de los platos termo-sensible de la cultura con FBS de la capa, mover los platos de la incubadora en una placa de calentamiento a 37 ° C y FBS Retire el plato.
5. Semilla ASC en 400.000 células/cm² (en total, 3,52 x 10⁶ células diluidos en 2 mL de medio de cultivo por plato).
6. Distribuir cuidadosamente las células tan uniformemente como sea posible agitando ligeramente el plato.
7. Hojas ASC de cultivo durante 48 h a 37 ° C en atmósfera húmeda con 5% CO₂.
   Nota: Tratar de minimizar la apertura de la puerta de la incubadora después de la siembra de ASCs para evitar bajadas de temperatura que pueden provocar un despegado prematuro de las hojas formadas de ASC o interferir con la formación de la hoja ASC.

3. parcial colectomía y Anastomosis colorrectal

1. Inducir y mantener ratas Wistar macho (peso entre 250-350 g) con 1 L/min de isoflurano (inhalación de 1.5-5%)/oxygen e inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina intramuscular.
2. Una vez que los animales están bajo anestesia general, evaluar la profundidad anestésica mediante pruebas reflejas. Aplicar pomada de ojos contiene vitamina A en los ojos para evitar la sequedad. Cuando la anestesia se considera suficiente para la cirugía, preparar asépticamente el abdomen por afeitar pelos y rociar el área operada dos veces con etanol al 70%. Cubra el abdomen con cortinas de papel estéril. Utilizar una técnica aséptica y mantener el campo estéril durante el procedimiento quirúrgico general.
3. Hacer una incisión abdominal de línea media de 5 cm con un tamaño de cuchilla quirúrgica estéril 10 y extender la incisión con tijeras de Metzenbaum. Identificar y exteriorizar el colon y colon el paquete del resto de la cavidad abdominal con solución Salinas gasas humedecidas. Identificar la mitad derecha y sin rodeos deja las arterias cólicos en el mesenterio, diseca alrededor de cada recipiente con mosquito Halsted y ligar cada recipiente individual con seda trenzada no absorbible 4/0.
4. Aislar el segmento colónico entre 1,0 cm aborally al ciego y 0,5 cm por encima de la arteria mesentérica caudal. Transectos a través del colon sano con unas tijeras de Metzenbaum. Después de la resección del segmento colónico, reúne los extremos proximales y distales del colon mediante la introducción de dos hisopos de algodón larga trans-analmente por el colon distal y luego en el extremo proximal del colon.
5. Utilizando un microscopio quirúrgico, crear una anastomosis suturada escaso de end-to-end invirtiendo una capa usando suturas interrumpidas 5 (8/0 de la poliamida del monofilamento no absorbible) de sutura. Colocar las suturas interrumpidas a través de todas las capas de la pared del colon y coloque la extraluminally de nudos.
6. Dividir las ratas al azar en control o grupo de hoja ASC.

4. ASC hoja trasplante

1. Deje que los platos de la cultura se enfríe a temperatura ambiente 40 min antes del trasplante en vivo , para facilitar el desprendimiento de la hoja ASC.
   Nota: Después de la separación, hojas ASC se encogen a aproximadamente 2 cm de diámetro. Viabilidad de hoja ASC se mantiene alto durante al menos 3-6 h después de la separación²⁰.
2. Retire el medio de cultivo y reemplazar con 1 mL de suero libre de LG-DMEM.
3. Suavemente agarra los bordes de la hoja ASC con pinzas atraumáticas y coloque el plato de lado de la hoja de la ASC sobre la línea de anastomosis.
4. Cuidadosamente extiende la ASC hoja aproximadamente 0,25 cm por encima y por debajo de la línea anastomótica usando las pinzas atraumáticas y el abrigo la hoja alrededor de los dos puntos. Levante el colon hasta la envoltura de la hoja de la ASC en el lado dorsal.
   Nota: Hojas ASC se adhieren espontáneamente a la línea anastomótica, sin necesidad de usar pegamento de tejido o cualquier otro biomaterial. El grupo control no recibieron ningún tratamiento adicional.
5. Retirar las torundas de algodón y cambiar los guantes e instrumentos. Reemplazar los dos puntos en el abdomen. Cerrar el abdomen-línea alba con una capa de corriente usando suturas absorbibles trenzadas poliglicólico ácido 5/0. Sutura el tejido subcutáneo y el cutis en una capa de corriente usando suturas absorbibles trenzadas poliglicólico ácido 5/0.

5. seguimiento y evaluación postoperatorio

1. Inmediatamente rehidratar los animales con una inyección subcutánea de solución salina tibia 5 mL después de la operación. Colocar los animales bajo una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal y monitorear los signos vitales hasta animales recuperar la suficiente consciencia para mantener recumbency esternal.
   Nota: Los animales que habían sido sometidos a cirugía no fueron devueltos a la compañía de otros animales hasta que se recuperó completamente. Después de la recuperación, permiten acceso libre al agua y chow rata regular. Para aliviar el dolor postoperatorio, administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea cada 6-8 h por 3 días. No antibióticos fueron administrados en cualquier momento de este estudio.
2. Obtener evaluaciones clínicas diarias de peso y bienestar. En caso de una puntuación de bienestar muy bajo o pérdida de peso severa, animales deben ser sacrificados por exsanguinación mediante punción cardiaca mientras que aún bajo anestesia.
3. Postoperatorio día 3 o día 7, anestesiar las ratas otra vez con 1 L/min de isoflurano (inhalación de 1.5-5%)/oxygen sin buprenorphine y realizar una re-laparotomía con una incisión en forma de U. Compruebe el abdomen para los signos de la presencia de abscesos, peritonitis, estenosis y adherencias fibrosas. Puntuación de la severidad de las adherencias y absceso en el abdomen y en la zona anastomótica.
4. Determinar la presión rotura anastomótica por la insuflación de aire en un segmento cerrado del colon como la anastomosis. Registrar la presión de aire y el lugar de ruptura cuando el primer aire de fugas como la presión de ruptura.
5. Quitar los dos puntos de cada animal sacrificado y fijar el segmento cortado del colon - que contiene la anastomosis colorrectal - con 4% tamponada formaldehído, por parafina inclusión y los dos puntos de corte en secciones de 4 μm de espesor.
6. Eutanasia a los animales mientras que bajo anestesia directamente después de la colección del segmento de anastomosis por exsanguinación mediante punción cardiaca. Confirman muerte de animales con la ausencia de respiración, movimiento y un ritmo cardíaco.
7. Realizar los stainings histoquímicos como hematoxilina & eosina y Picro Sirius rojo y los stainings de immunohistochemical con los anticuerpos contra las mitocondrias humanas, las células endoteliales de la rata (anti-CD34) y células del sistema inmune (CD3 +, CD163 +).
8. Digitalizar diapositivas de análisis computarizado y comparar los grupos de animales.

Resultados

Un diagrama de flujo de este estudio que representa el cultivo de hoja ASC y el procedimiento de resección del colon y la anastomosis se muestra en la figura 1. La figura 2 muestra la morfología microscópica de la hoja ASC y el aspecto macroscópico de la hoja ASC durante y después de la separación. La figura 3 muestra los diferentes pasos de desprendimiento de la hoja ASC y trasplante.

Discusión

Fuga anastomótica es el evento adverso más grave después de la resección de colon con una anastomosis primaria. Técnicas óptimas para evitar fugas y disrupción anastomótica siguen faltando. Aplicación local de una amplia gama de biomateriales se ha realizado, con distintos resultados^25,26,27. El objetivo de las terapias de la célula es facilitar la reparación de los tejidos por el reemplazo del tejido o la estimulaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LG DMEM	Gibco, Life technologies	22320022	ASC isolation and culture
Collagenase type I	Gibco, Life technologies	17100-01	ASC Isolation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418	ASC Isolation
Fetal bovine serum	Gibco, Life technologies	10270-106	FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue	Stemcell Technologies	7060	ASC Isolation
Gentamicin	Gibco, Life technologies	15750-037	ASC isolation and culture
Ampothericin B	Gibco, Life technologies	15290-018	ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400)	Akribis Scientific	F240	ASC Isolation
Centrifuge	Hettichlab	Rotina380	ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline	Gibco, Life technologies	14190-094	PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2	AbD Serotec	AF-100-15	FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA	Gibco, Life technologies	25200-056	ASC culture
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650-5x	DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes	Nunc Thermo scientific	174904	ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0	B Braun	21151042	surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0	B Braun	G1118170	surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0	B Braun	C1048207	surgery