Trapianto di cellule staminali di tessuto adiposo-derivato foglio per ridurre le perdite dopo la colectomia parziale in un modello del ratto

Riepilogo

La preparazione e il trapianto di tessuto adiposo derivato della cellula formativa (ASC) fogli sul insufficientemente suturate anastomosi colorettale in un modello del ratto è presentata. Questa applicazione romanzo mostra che fogli di ASC possono ridurre le perdite di anastomosi colorettale.

Abstract

Anastomotiche è una complicazione disastrosa dopo la chirurgia del colon-retto. Sebbene metodi correnti per la prevenzione di perdite hanno diversi livelli di efficacia clinica, sono fino a questo momento imperfette soluzioni. Terapia con cellule staminali utilizzando fogli di ASC potrebbe fornire una soluzione a questo problema. ASC sono considerati come promettenti candidati per la promozione del tessuto di guarigione a causa delle loro proprietà trofiche e immunomodulatori. Qui, mettiamo a disposizione metodi per produrre fogli ASC ad alta densità, che vengono trapiantate su un'anastomosi colorettale in un modello del ratto per ridurre la perdita. ASC formano strati delle cellule in piastre di coltura termo-sensibile che potrebbero essere facilmente smontati. Il giorno del trapianto, è stata eseguita una colectomia parziale con un'anastomosi colorettale 5-sutura. Gli animali sono stati trapiantati immediatamente con 1 foglio ASC per ratto. Fogli di ASC aderito spontaneamente all'anastomosi senza alcun collante, sutura o qualsiasi biomateriale. Gruppi di animali sono stati sacrificati 3 e 7 giorni postoperatorio. Confrontato agli animali trapiantati, l'incidenza degli ascessi anastomotic e perdita era maggiore negli animali di controllo. Nel nostro modello, il trapianto di fogli ASC dopo l'anastomosi colorettale è stata associata con un tasso di perdite inferiore e di successo.

Introduzione

Colectomia parziale con un'anastomosi primaria è un intervento chirurgico comunemente effettuato che può essere fatto per molte malattie che colpiscono il colon come cancro colorettale, morbo di Crohn e diverticolite^1,2. Il più temuto complicazione dopo l'anastomosi colorettale è anastomotiche³. Sebbene siano stati identificati diversi fattori di rischio connessi con perdite anastomotiche, soluzioni per prevenire perdite rimangono unkown^4,5.

Delle cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ASCs) sono associate con le proprietà antinfiammatorie e trofiche^6,7, che rende queste cellule promettenti candidati per terapie rigenerative⁸. L'efficacia di ASCs per promuovere la guarigione dei tessuti è stata dimostrata in vari tessuti quali il muscolo cardiaco, pelle ed esofago^{9,10,11,12,13}. Tuttavia, ci sono pochi rapporti sull'uso di ASCs per promuovere la guarigione intestinale. Trapianto locale di ASCs per anastomosi colorettale sperimentale via rivestite con ASC biosutures o iniezioni serosal dell'ASC ha mostrato entrambi nessun miglioramento nella guarigione¹⁴ o non impedì anastomotiche nonostante una più favorevole anastomotica ¹⁵la guarigione.

Il trapianto locale di ASC in sospensione o in combinazione con biomateriali potrebbero essere associati con la conservazione delle cellule insufficiente o un'inadeguata distribuzione delle cellule trapiantate¹¹. Cella foglio tecnologia^16,17 offre un innovativo metodo di consegna ASC^18,19. Pertanto, in uno studio precedente, un nuovo approccio è stato proposto in cui ASCs organizzato in una cella foglio potrebbe essere applicata su anastomosi colorettale sperimentale²⁰. Questo studio ha dimostrato che il trapianto di foglio ASC è riuscito a ridurre le perdite di anastomosi colorettale dopo colectomia parziale in un modello del ratto. Questo articolo segnala ASC foglio preparazione e tecnica chirurgica di trapianto.

Protocollo

Il tessuto adiposo sottocutaneo addominale è stato ottenuto da donatori umani con approvazione della Commissione etica medica (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Paesi Bassi. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della sperimentazione animale, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Paesi Bassi (133-14-01).

1. umani ASCs isolamento e coltura

1. Preparare 3 mL di terreno di isolamento per 1 g di tessuto adiposo. Mix basso glucosio Dulbecco di medie dell'Aquila per volta (LG-DMEM) con 10 g/L Bovine Serum Albumin (BSA) e della collagenosi 1 g/L di tipo 1.
2. Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo umano addominale (n = 8, tutte le donne, età media 40 ± 9 anni) in piccoli pezzi (0,5 cm) utilizzando una dimensione lama chirurgica sterile 10, pinze Adson-Brown e forbici Metzenbaum in una sterile SafetyCabinet biologici.
3. Conservare il tessuto dissecato in una bottiglia di archiviazione supporti vetro sterile. Pesare la quantità totale di tessuto dissecato e avviare la digestione con il mezzo di isolamento preparati (50 g di tessuto adiposo con 150 mL di terreno di isolamento per bottiglia). Il protocollo può essere sospesa qui memorizzando la bottiglia con il tessuto adiposo dissecato e mezzo di isolamento a 4 ° C durante la notte su un mixer a rulli. Quindi preriscaldare la bottiglia il giorno successivo a temperatura ambiente 25 ° C per 15 min prima di continuare con il passaggio successivo.
   Nota: Il tessuto adiposo sottocutaneo addominale è stato ottenuto come materiale rimasto da donatori sottoposti ad intervento chirurgico di ricostruzione del seno con approvazione del Erasmus MC medica comitato etico (# MEC-200) e secondo il codice di condotta: "corretto utilizzo secondario di tessuto umano"(< http://www.federa.org>). Avanzi di tessuto adiposo è stato utilizzato solo da donatori che ha fatto non opt-out per uso secondario.
4. Digerire il tessuto adiposo dissecato in una bottiglia di archiviazione media di vetro sterile in un agitatore-incubatore a 150 giri/min e 37 ° C per 1 h.
5. Dividere la soluzione digerita in provette da 50 mL e centrifugare le provette per 10 min a 390 x g.
6. Preparare il terreno di coltura: LG-DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B.
7. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di terreno di coltura (LG-DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B). Centrifugare le cellule ancora per 5 min a 390 x g e rimuovere il surnatante.
8. Risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno di coltura (LG-DMEM completati con 10% FBS, 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 100 µm.
9. Aggiungere 50 µ l di soluzione di 3% acido acetico/metilene blu (per la lisi di globuli rossi) a 50 µ l di sospensione cellulare, miscelare la soluzione e utilizzare 10 µ l per contare le celle. Eseguire cella contando con un emocitometro. Quindi piastra le cellule ad una densità di 40.000 cellule/cm² in terreno di coltura (LG-DMEM completate con 30% FBS, 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B).
10. Incubare le cellule a 37 ° C in un'atmosfera umida con 5% CO₂ per 24 h.
11. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con fosfato di caldo (37 ° C) tampone salino (PBS) per rimuovere i detriti cellulari e sostituire il supporto con 10% FBS terreno di coltura con appena aggiunto acido ascorbico-2-fosfato (25 µ g/mL) e crescita fibroblastico ricombinante umano fattore 2 (FGF2, 1 ng/mL).
12. Sottocultura ASCs confluenza 90% utilizzando la soluzione di standard 0,25% tripsina EDTA (3 mL per un pallone T175). Dopo 3-5 min, neutralizzare la soluzione di EDTA 0,25% tripsina con 10 mL di terreno di coltura (LG-DMEM completati con 10% FBS, 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B).
    Nota: Flusso cytometry analisi utilizzando marcatori di superficie comuni di ASC e differenziazione di tri stirpe saggi erano eseguite in precedenza e ha rivelati che ASCs isolati utilizzando questo protocollo visualizzato ASC caratteristiche specifiche^21,22.
13. Lavare le cellule con 10 mL di terreno di coltura (LG-DMEM supplementato con 10% FBS, gentamicina 50 µ g/mL e 1,5 µ g/mL ampothericin B) per un pallone T175 e centrifugare le cellule per 8 min a 250 x g. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura. Contare le celle con un emocitometro.
14. Piastra le cellule nel T175 matracci di cultura ad una densità di 8.000 cellule/cm².
15. Congelare le rimanenti ASC in azoto liquido con 10% di dimetilsolfossido (DMSO) nel terreno di coltura prima dell'ulteriore uso.

2. ASC foglio preparazione

1. Pre-cappotto termo-attivabile Petri (diametro 3,5 cm) con 1 mL di FBS, quindi posizionare le stoviglie in un incubatore a 37 ° C per almeno 30 min prima della semina delle cellule.
2. Tripsinizzano ASC utilizzando standard 0,25% tripsina EDTA soluzione per 3-5 min (3 mL per un matraccio di cultura T175). Se ci sono eventuali grumi di cellule dopo trypsinization, filtrare le cellule attraverso un filtro 100 µm prima del conteggio.
3. Neutralizzare la soluzione di tripsina con LG-DMEM supplementato con 10% FBS (10 mL per una boccetta di T175) e centrifugare la sospensione cellulare per 8 min x 250 g. eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di LG-DMEM supplementato con 10% FBS.
4. Dopo il rivestimento i piatti di cultura termo-attivabile con FBS, spostare i piatti dall'incubatrice una piastra riscaldante a 37 ° C e rimuovere FBS dal piatto.
5. ASC di seme a 400.000 cellule/cm² (in totale, 3,52 × 10⁶ cellule diluite in 2 mL di terreno di coltura per ogni piatto).
6. Accuratamente di distribuire più uniformemente possibile le cellule facendo oscillare delicatamente il piatto.
7. Fogli ASC di cultura per 48 h a 37 ° C in un'atmosfera umida con 5% CO₂.
   Nota: Cercare di minimizzare l'apertura della porta dell'incubatore dopo la semina ASCs per prevenire cadute di temperatura che potrebbero interferire con la formazione del foglio ASC o prematuro distacco di formato lastre ASC.

3. parziale colectomia e l'anastomosi colorettale

1. Indurre e mantenere ratti maschii di Wistar (peso compreso tra 250-350 g) con 1 L/min di isoflurane (inalazione di 1.5-5%)/oxygen e iniettare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via intramuscolare.
2. Una volta che gli animali sono in anestesia generale, valutare profondità anestetica utilizzando reflex test. Applicare unguento oculare contenente vitamina agli occhi per prevenire la secchezza. Quando l'anestesia è considerata sufficiente per la chirurgia, preparare asetticamente l'addome rasatura peli e spruzzare l'area chirurgica due volte con etanolo al 70%. Drappo l'addome con drappi di carta sterile. Utilizzare una tecnica asettica e mantenere il campo sterile durante l'intero intervento chirurgico.
3. Fare un'incisione addominale del midline di 5 cm con una dimensione di lama chirurgica sterile 10 ed estendere l'incisione con le forbici Metzenbaum. Identificare ed esternare il colon e pack colon fuori dal resto della cavità addominale con salina garza inumidita. Identificare la metà destra e sinistra arterie coliche nel mesentery, senza mezzi termini sezionare intorno ogni vaso usando Halsted mosquito e legare ogni singolo recipiente con non assorbibile intrecciata seta 4/0.
4. Isolare il segmento colico tra 1,0 cm aborally al cieco e 0,5 cm di sopra dell'arteria mesenterica caudale. Transetto attraverso colon sano utilizzando forbici Metzenbaum. Dopo la resezione del segmento colico, unire le estremità prossimale e distale del colon introducendo due tamponi di cotone lunga trans-analmente attraverso il colon distale e quindi nell'estremità prossimale del colon.
5. Utilizzando un microscopio operatorio, creare un'anastomosi to-end insufficientemente suturata invertendo uno strato sutura usando i suturare interrotti 5 (poliammide monofilamento non riassorbibile 8/0). Collocare le suture interrotte attraverso tutti gli strati della parete del colon e posizionare i nodi extraluminally.
6. Dividere i ratti in modo casuale in controllo o gruppo di foglio ASC.

4. ASC foglio trapianto

1. Consentire i piatti di cultura raffreddare a temperatura ambiente 40 min prima di trapianto in vivo , per facilitare il distacco del foglio ASC.
   Nota: Dopo la separazione, fogli di ASC ridursi a circa 2 cm di diametro. Attuabilità foglio ASC rimane alta per almeno 3-6 h dopo il distacco²⁰.
2. Rimuovere il terreno di coltura e sostituire con 1 mL di siero gratis LG-DMEM.
3. Delicatamente afferrare i bordi del foglio ASC con pinza atraumatica e posizionare il lato piatto del foglio ASC in cima alla linea anastomotica.
4. Con attenzione tratto fuori l'ASC foglio circa 0,25 cm sopra e sotto la linea anastomotica utilizzando la pinza atraumatica e avvolgere il foglio intorno i due punti. Sollevare il colon fino ad avvolgere il foglio ASC intorno al lato dorsale.
   Nota: Fogli di ASC aderiscano spontaneamente alla linea anastomotica, non c'è alcuna necessità di utilizzare colla tessuto o qualsiasi altri biomateriali. Il gruppo di controllo non riceve alcun trattamento supplementare.
5. Rimuovere i tamponi di cotone e cambiare i guanti e gli strumenti. Sostituire i due punti nell'addome. Chiudi l'addome-linea alba con uno strato di in esecuzione utilizzando suture assorbibili intrecciato 5/0 acido poliglicolico. Suturare subcutis e cutis insieme in un unico strato di eseguire suture utilizzando poliglicolico intrecciato riassorbibile acido 5/0.

5. post-operatorio valutazione e follow-up

1. Immediatamente reidratare gli animali con un'iniezione sottocutanea di soluzione salina calda 5ml postoperatorio. Sistemare gli animali sotto una lampada di calore per mantenere la temperatura corporea e monitorare i segni vitali fino a quando gli animali riprenda conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
   Nota: Gli animali che avevano subito la chirurgia non sono stati restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato. Dopo il recupero, consentire il libero accesso all'acqua e cibo regolare del ratto. Per alleviare il dolore post-chirurgico, amministrare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via sottocutanea ogni 6-8 h per 3 giorni. Senza antibiotici sono stato amministrato in qualsiasi momento in questo studio.
2. Ottenere valutazioni giornaliere cliniche del benessere e del peso. In caso di un punteggio molto basso benessere o grave perdita di peso, gli animali dovrebbero essere euthanized dal exsanguination via la puntura cardiaca mentre ancora sotto anestesia.
3. Il giorno postoperatorio 7 giorni o 3, anestetizzare i ratti nuovo con 1 L/min di isoflurane (inalazione di 1.5-5%)/oxygen senza il buprenorphine ed eseguire una re-laparotomia con un'incisione a forma di U. Verificare l'addome per i segni di peritonite, stenosi, aderenze fibrose e la presenza di ascessi. Segnare la severità delle aderenze e ascesso sia nell'addome e nella zona anastomotica.
4. Determinare la pressione di scoppio anastomotic mediante l'insufflazione di aria in un segmento chiuso del colon compreso l'anastomosi. Registrare la pressione dell'aria e il luogo della rottura, quando l'aria prima di perdite come pressione di scoppio.
5. Rimuovere i due punti da ogni animale sacrificato e fissare il segmento taglio del colon - contenente l'anastomosi colorettale - con formaldeide 4% tamponato, seguito da paraffina incorporamento e tagliando i due punti in 4 sezioni spesse μm.
6. Eutanasia degli animali mentre sotto anestesia direttamente dopo la raccolta del segmento anastomosi dal exsanguination via puntura cardiaca. Confermare la morte degli animali con l'assenza di respirazione, movimento e un battito cardiaco.
7. Eseguire colorazioni istochimiche quali ematossilina ed eosina e Picro Sirius rosso e gli stainings di immunohistochemical con gli anticorpi contro mitocondri umani, cellule endoteliali del ratto (anti-CD34) e cellule del sistema immunitario (CD3 +, CD163 +).
8. Digitalizzare le diapositive per analisi computerizzata e confrontare i gruppi di animali.

Risultati

Un diagramma di flusso di questo studio raffigurante sia cultura foglio ASC e la procedura di resezione del colon e l'anastomosi è illustrato nella Figura 1. La figura 2 Mostra la morfologia microscopica foglio ASC e l'apparenza macroscopica del foglio ASC durante e dopo la separazione. La figura 3 Mostra le diverse fasi di distacco del foglio ASC e trapianto. La figura 4

Discussione

Anastomotiche è l'evento avverso più grave a seguito di resezione del colon con un'anastomosi primaria. Tecniche ottimali per prevenire perdita e rottura anastomotic sono ancora carenti. Applicazione locale di una matrice di biomateriali è stata condotta, con diversi risultati^25,26,27. L'obiettivo delle terapie di cellula è quello di facilitare la riparazione dei tessuti da sostituzione di tessuto o la stimolazione della gua...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LG DMEM	Gibco, Life technologies	22320022	ASC isolation and culture
Collagenase type I	Gibco, Life technologies	17100-01	ASC Isolation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418	ASC Isolation
Fetal bovine serum	Gibco, Life technologies	10270-106	FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue	Stemcell Technologies	7060	ASC Isolation
Gentamicin	Gibco, Life technologies	15750-037	ASC isolation and culture
Ampothericin B	Gibco, Life technologies	15290-018	ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400)	Akribis Scientific	F240	ASC Isolation
Centrifuge	Hettichlab	Rotina380	ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline	Gibco, Life technologies	14190-094	PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2	AbD Serotec	AF-100-15	FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA	Gibco, Life technologies	25200-056	ASC culture
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650-5x	DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes	Nunc Thermo scientific	174904	ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0	B Braun	21151042	surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0	B Braun	G1118170	surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0	B Braun	C1048207	surgery