Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición2

Resumen

Combinaciones de fármacos sinérgicos son difíciles y lleva mucho tiempo identificar empíricamente. Aquí, describimos un método para identificar y validar sinérgicas pequeñas moléculas.

Resumen

Aunque los medicamentos antimicrobianos han aumentado dramáticamente la vida útil y calidad de vida en^{el siglo 20} , resistencia a los antimicrobianos amenaza la capacidad de nuestra sociedad entera para el tratamiento de infecciones sistémicas. En los Estados Unidos, las infecciones resistentes a los antibióticos mata a aproximadamente 23.000 personas al año y costo alrededor de 20 billones dólares en atención médica adicional. Un método para combatir la resistencia a los antimicrobianos es la terapia de combinación, que es particularmente útil en la etapa crítica temprana de la infección, antes de que el organismo infectante y su perfil de resistencia a drogas han sido identificados. Muchos tratamientos antimicrobianos utilizan terapias combinadas. Sin embargo, la mayoría de estas combinaciones son aditivos, lo que significa que la eficacia combinada es igual a la suma de la eficacia de antibióticos individual. Algunas terapias de combinación son sinérgicos: la eficacia combinada es mucho mayor que el añadido. Combinaciones sinérgicas son particularmente útiles, ya que pueden inhibir el crecimiento de cepas resistentes a los fármacos antimicrobianos. Sin embargo, estas combinaciones son raros y difíciles de identificar. Esto es debido al número de moléculas necesarias para ser probado en forma pares: una biblioteca de 1.000 moléculas tiene 1 millón de combinaciones posibles. Así, se ha intentado predecir moléculas para la sinergia. Este artículo describe el método de alto rendimiento para predecir pares sinérgicos pequeña molécula conocidas como la superposición² método (O2M). O2M utiliza patrones de conjuntos de datos químicos genéticos para identificar a mutantes que son hipersensibles a cada molécula en un par sinérgico pero no a otras moléculas. El laboratorio marrón aprovecha esta diferencia de crecimiento realizando una pantalla de alto rendimiento para las moléculas que inhiben el crecimiento de la mutante pero las células no-tipo salvaje. Trabajo de laboratorio previamente identificado moléculas que sinergice con el antibiótico trimethoprim y lo antimicóticos fluconazol utilizando esta estrategia. Aquí, los autores presentan un método para pantalla para novela combinaciones sinérgicas, que puede ser alterado por múltiples microorganismos.

Introducción

Las bacterias resistentes a los antibióticos causan infecciones más de 2 millones y 23.000 muertes anualmente en los Estados Unidos según la CDC¹. Nuevos tratamientos se necesitan para superar estas infecciones. Estrategias para identificar estos nuevos tratamientos incluyen el desarrollo de nuevos antimicrobianos o la reasignación de pequeñas moléculas aprobadas para que otras condiciones para el tratamiento de las infecciones microbianas^2,3,4. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos medicamentos es muy costoso y desperdiciador de tiempo. Reasignación de drogas no puede identificar nuevos fármacos o drogas objetivos^5,6. Nuestro laboratorio se centra en una tercer estrategia conocida como terapias de combinación sinérgica. Combinaciones sinérgicas se producen cuando dos moléculas pequeñas juntas tienen una eficacia mayor que el efecto aditivo de sus eficacias individuales⁷. Además, combinaciones sinérgicas pueden ser efectivos contra un patógeno resistente a una de las moléculas pequeñas en la pareja además de tener menos efectos no deseados de fuera de objetivo, hacerlas gran potencial^{8,9, 10}.

Pares sinérgicos son raras, ocurriendo en aproximadamente 4-10% de combinaciones de drogas^11,12,13. Así, las técnicas tradicionales tales como pantallas pares son difícil y desperdiciador de tiempo, con miles de combinaciones posibles de una pequeña biblioteca de cien moléculas. Por otra parte, las interacciones sinérgicas usualmente no se puede predecir de la actividad de los compuestos¹⁴. Sin embargo, los autores desarrollaron un enfoque de alto rendimiento para detectar pares sinérgicos, llamado el traslapo² método (O2M)¹². Este método, descrito aquí, permite la identificación más rápido, más eficiente de estos pares sinérgicos. O2M requiere el uso de un par sinérgico conocido y un conjunto de datos de química genética. Conjuntos de datos de química genética se generan cuando una biblioteca de mutantes knockout se cultiva en presencia de muchas moléculas pequeñas diferentes. Si una molécula en un par sinérgico conocido induce el mismo fenotipo de un mutante de nocaut en particular como la segunda molécula sinérgica, cualquier molécula pequeña que provoca el fenotipo de ese mismo mutante debe también sinergizar con cada miembro de la conocida par sinérgico. Este razonamiento se ha utilizado en el laboratorio de marrón para identificar pares antibióticos sinérgicos activas contra Escherichia coli (e. coli) y antimicóticos sinérgico activo contra el hongo Cryptococcus neoformans (C. neoformans)^11,12. O2M no sólo es adaptable para diversos agentes patógenos, pero permite la proyección de grandes bibliotecas de moléculas para identificar pares sinérgicos fácilmente y rápidamente. Proyección con el mutante genético identificado por O2M nos permite validar sólo aquellas moléculas pequeñas para sinergia. Así pues, prueba una biblioteca de 2.000 moléculas pairwise llevaría meses, mientras que si sólo había 20 moléculas en eso Biblioteca predicho para sinergizar, pruebas de sinergia ahora lleva unos días. O2M no requiere conocimientos de programación, y el equipo necesario está disponible en la mayoría de laboratorios o instalaciones de la base. Además de los investigadores interesados en combinaciones de medicamentos, análisis de O2M es de interés para cualquier persona que ha completado una pantalla de la droga y quiere ampliar sus éxitos mediante la identificación de las interacciones de fármacos importantes. A continuación es el protocolo para identificar moléculas pequeñas sinérgicas en las bacterias, así como validar las interacciones sinérgicas predichas en ensayos bien conocido^15,16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. identificación de mutantes de predicción de sinergia del conjunto de datos de química genética por el método² de superposición (O2M)

Nota: Este es el método para la identificación de mutantes de la predicción de sinergia con el conjunto de datos publicado de Nichols et al. ¹⁷ en e. coli. Sin embargo, esto puede hacerse en cualquier conjunto de datos de química genética y microorganismo. Estos conjuntos de datos contienen una biblioteca de mutantes knockout crecido en presencia de más de 100 pequeñas moléculas, dando una puntuación de crecimiento cuantitativo para cada mutante en cada molécula pequeña. Un par sinérgico debe conocerse, y debe haber decenas de crecimiento para ambas moléculas pequeñas incluidas en el conjunto de datos.

1. Calcular la desviación estándar y puntaje de crecimiento para todos los mutantes cultivados en presencia de una concentración individual de cada molécula pequeña.
   Nota: Esto puede hacerse con cualquier software de hoja de cálculo. El laboratorio marrón utiliza Excel y las funciones =AVERAGE(B3:B3981) y =STDEV(B3:B3981) para los cálculos de cada columna de molécula pequeña.
   1. Calcular las medias y desviaciones estándar de cada columna de molécula pequeña, aunque esta orientación puede diferir si se utiliza un conjunto de datos diferentes.
2. Calcular los puntajes Z para cada concentración de la molécula pequeña usando el mismo conjunto de datos de Nichols et al. ¹⁷ en un programa de hoja de cálculo. Para ello, puntuaciones z negativo será Z(2.5) = significa - 2.5 * desviación estándar y las puntuaciones z positivo será Z(2.5) = media + 2.5 * desviación estándar.
3. Determinar que genes mutantes contienen importantes puntuaciones de Z en las moléculas pequeñas que conforman el conocido par sinérgico, asegurándose de que mirar a todas las concentraciones de las moléculas. Si el crecimiento es resultado de un mutante, menos que la negativa Z (2.5) puntaje o es mayor que la puntuación Z (2.5) positiva para esa pequeña molécula, se considera significativo.
4. Determinar si cualquiera de los mutantes del gen significativo pertenece a un operón.
   Nota: Para e. coli, los autores recomiendan "Ecoli wiki" para obtener información con respecto a si los genes se transcriben como parte de un policistrónico RNA.
5. Identificar mutantes gene/operon que son comunes a la mayoría de las pequeñas moléculas de interés a diferentes concentraciones (por ej., cuando buscando moléculas que sinergice con el antibiótico trimethoprim, identificar mutantes que muestran un significativo Z puntuación cuando se cultiva en presencia de trimetoprima y sus socios sinérgicos conocidos como sulfametoxazol sulfametoxazol). Son mutantes de predicción supuesta sinergia.

2. predicción de Synergizers dentro del conjunto de datos de química genética por O2M

1. Volver a los¹⁷del conjunto de datos, identifican cada concentración de molécula pequeña que se obtiene una puntuación de importante crecimiento de la mutante de predicción de sinergia. Esto se hace analizando las puntuaciones Z calculadas para cada concentración de pequeñas moléculas. Una vez más, un puntaje de crecimiento significativo es menor la puntuación Z negativa o mayor que el positivo Z score para concentración de pequeñas moléculas.
   Nota: Si una molécula aparece en uno de sus concentraciones, la molécula se considera un synergizer predicha. Cualquier molécula que no provocan un resultado de un crecimiento significativo es un synergizer no prevista.

3. validación de interacciones sinérgicas previstas

1. Encontrar la concentración inhibitoria mínima (CIM) de synergizers previstas.
   1. Cultivar una cultura de la noche de e. coli en los media mínimo M9 a 37 ° C.
      Nota: Cualquier cultura durante la noche se puede cultivar en medio adecuadamente definido para el organismo de interés. El laboratorio marrón no recomienda medios enriquecidos como libra YPD. Media mínimo M9 consta de 10,5 g/L caldo M9, 0.2% casamino ácidos, 0.1 M CaCl₂, 0,4% glucosa, 1 M MgSO₄, el ácido nicotínico 0.25% y 0,33% tiamina en H₂O.
   2. Si no hay datos MIC para el patógeno de interés se encuentra en la literatura sobre la recepción de las moléculas pequeñas, disuelvan en dimetil sulfóxido (DMSO) en alta concentración (> 10 mg/mL).
   3. Usando una placa de 96 pocillos, agregar 100 μl de medio M9 a cada pocillo. Añadir un extra de 100 μl de medio M9 en la columna 1 que contiene un total de 200 μl.
   4. Añadir una cantidad arbitraria (~ 10 μl) de solución concentrada de moléculas pequeñas en la columna 1. Una molécula pequeña por pocillo de la columna 1 (8 moléculas pequeñas por placa).
      Nota: Estas son las pequeñas moléculas de interés, que se predicen para sinergizar. El laboratorio de color marrón generalmente agrega 10 μl de la solución altamente concentrada de molécula pequeña, que está por debajo de la cantidad de DMSO 100% que puede inhibir e. coli.
   5. Una vez que se han añadido las moléculas pequeñas, diluir las moléculas pequeñas a través del eje x de la placa. Tomar 100 μl de solución de la columna 1, coloque en la columna 2 y mezclar. Tomar 100 μl de la columna 2, coloque en la columna 3 y mezclar. Continúe este proceso hasta que se colocan 100 μL en la columna 11. Columna 11 de la mezcla, luego tomar 100 μl de la columna y descartar. Deje la columna 12 con apenas medios para normalizar los datos.
   6. Inocular la placa. Obtener la densidad óptica (OD₆₀₀) de una cultura de la noche a la mañana. Preparar una solución con la cultura y los medios de M9 a un OD₆₀₀ de 0.002 (o apropiado de concentración que representa 500 células/μl para el organismo deseado de interés). Pipetear 2 μl de solución de la cultura en cada pocillo de la placa por lo que hay 1.000 células por pocillo.
   7. Homogeneizar la placa y obtener el OD₆₀₀ para la 0 h lectura. Deje que la placa de crecer a 37 ° C durante 24 h. obtener OD₆₀₀ para las 24 horas de lectura.
      Nota: Uso apropiado crecimiento condiciones para otros organismos de interés.
   8. Calcular el crecimiento neto de cada bien utilizando un programa de hoja de cálculo.
   9. Promedio el crecimiento neto de columna 12 para no obtener el promedio crecimiento de la droga. Normalizar los otros pozos a la media de no crecimiento de drogas usando un software de hoja de cálculo. Busque cualquier pozo con menos de 10% crecimiento para identificar el MIC90. Cualquier bien con menos del 50% crecimiento indica el MIC50. Calcular la concentración de pequeñas moléculas en los pozos.
2. Ensayos de tablero de ajedrez para las interacciones sinérgicas
   1. Cultivar una cultura de la noche de e. coli en los media mínimo M9 como antes.
      Nota: Las condiciones para otros organismos de cultivo de uso apropiado.
   2. Añadir 100 μl de medio M9 a cada pocillo de una placa bien 96 y un extra de 100 μL en la columna 1.
   3. Añadir la molécula pequeña de prueba (~ 8 x MIC) a cada bien en la columna 1 y añadir el doble de la concentración (~ 16 x MIC) a1 bien (una pequeña molécula probado por placa).
      Nota: Esta cantidad se determina desde el previo de la prueba completado de MIC y difiere para cada potencial synergizer.
   4. Crear una gradiente dilución en el eje x tomando 100 μl de la columna 1 y transferir a la columna 2. Continúe este proceso hasta que se añade 100 μl a la columna 11. Mezclar, luego tomar 100 μl de la columna 11 y deseche. No añadir ningún medicamento a la columna 12 (figura 1A).
   5. Configurar el segundo gradiente de drogas a través del eje y de la droga de entrada. Añadir 100 μl de los medios de comunicación que contenga 2 x micrófono de la molécula de entrada de fila A. mezcla y diluir como antes, tomando 100 μl de la fila A y colocar en B. continuar hasta 100 μl se coloca en fila G. mezcla, tomar 100 μl y deseche, asegurándose de no para agregar cualquier droga de entrada en la fila H. Esto permite la fila H y la columna de 12 que contienen micrófonos individuales de la pareja de fármacos probado (figura 1B).
   6. Inocular la placa. Añadir 2 μl de un cultivo de e. coli de OD₆₀₀ 0.002 a cada pocillo (a 1.000 células por pocillo).
   7. Mida OD₆₀₀ de cada pocillo de la placa para la lectura de 0 h.
   8. Incubar la placa de 24 h a 37 ° C.
   9. Mida OD₆₀₀ de cada pozo en 24 h.
3. Calcular el índice de concentración inhibitoria fraccionada (FICI) de contornar
   1. Restando el OD₆₀₀ a 0 h de OD₆₀₀ en 24 h en un programa de hoja de cálculo para calcular el crecimiento neto para cada pocillo de la placa.
   2. Normalizar el crecimiento del software dividiendo cada pozo por pozo H12, que no contiene ninguna molécula pequeña.
   3. Encontrar el MIC90 de la molécula de entrada en la columna 12 y el MIC90 de la potencial sinergista en la fila H.
   4. Buscar todos los pozos que inhiben el 90% de crecimiento.
   5. Calcular el FICI90 para el pozo que es sea el más bajo por debajo (sinérgica) o más arriba (antagónicos) ambos valores de MIC90, utilizando la ecuación:
      
   6. Considerar cualquier FICI ≤ 0,5 como sinérgicos y FICI ≥ 4 como antagonistas (figura 2).
      Nota: Esto se puede también hacer con MIC50 (50% de inhibición del crecimiento) para conseguir una FICI50 basada en los valores MIC.
4. Ensayo de la independencia de dicha
   Nota: Dicha independencia se ejecuta con cualquier potencial sinérgico que no tenía un micrófono en su propio.
   1. Cultivar una cultura de la noche de e. coli en medio M9 a 37 ° C, como antes.
      Nota: Una vez más, condiciones de cultivo apropiadas para otros organismos de interés pueden utilizarse en este paso.
   2. Preparar placas de 96 pocillos para probar el potencial sinérgica molécula, la molécula de entrada, la combinación y un control sin tratamiento.
   3. Crear la placa producto sinérgico potencial mediante la adición de 50 μl de medio M9 a cada pocillo. Añadir 50 μl de medios que contienen una concentración set (10 μm o 100 μm) de la potencial sinergista a cada pocillo de una fila. Prueba 8 moléculas por placa.
   4. Crear la placa de entrada de la molécula mediante la adición de 50 μl de los medios de comunicación a cada pocillo. Añada de 50 μl que contiene 4 x MIC de la droga de entrada a cada bien en la columna 1. Crear una dilución gradiente a lo largo del eje x similar a placas de MIC, tomar 50 μl de la columna 1, dispersión y mezcla en la columna 2. Continúe este proceso hasta que la columna 12, desechar 50 μl de la columna 12. Añadir un adicional 50 μl de los medios de comunicación a cada bien sea el total final de cada pocillo 100 μl.
   5. Creación de la placa de combinación usando una placa bien 96, añadir 50 μl de los medios de comunicación a cada pocillo. Añada de 50 μl que contiene 4 x MIC de la droga de entrada a cada bien en la columna 1. Diluir a lo largo del eje x similar a placas de MIC, tomar 50 μl de la columna 1, dispersión y mezcla en la columna 2. Seguir todo el camino a la columna 12, desechar 50 μl de la columna 12. Añadir 50 μl de los medios de comunicación que contiene al potencial sinergista en el μm 10 o 100 μm en cada pocillo de una fila. Una vez más, debe haber una concentración o drogas por fila.
   6. Crear el control no tratadas mediante la adición de 100 μl de medio M9 en todos los pocillos de la placa.
   7. Inocular las placas de todos agregando 2 μl de cultivo bacteriano con un OD₆₀₀ de 0.002 o 1.000 células a cada pozo como antes.
   8. Mida OD₆₀₀ de cada pozo en 0 y 24 h.
5. Cálculo de la calificación de independencia de dicha
   1. Restando el OD₆₀₀ a 0 h de crecimiento a las 24 h, usando un programa de hoja de cálculo para calcular el crecimiento neto para cada pocillo de la placa.
   2. Normalizar los pozos a la media de crecimiento de la placa de no drogas en un programa de hoja de cálculo.
   3. Software de hoja de cálculo, calcular la inhibición restando el crecimiento neto de 1.
   4. Promedio de las columnas de la placa de control que contiene sólo el gradiente de entrada en el software de hoja de cálculo.
   5. Calcular la puntuación de la felicidad para cada bien por la ecuación:
      Dicha puntuación = (bien X + columna de entrada X) -combinado X bien
   6. Buscan puntuaciones negativas en los pozos por debajo de la MIC90 de la entrada.
      Nota: Puntuaciones negativas a través de las múltiples concentraciones indica una interacción sinérgica.

4. alto rendimiento pantalla con sinergia mutantes de predicción para identificar nuevos pares sinérgicos

1. Identificar a mutantes de predicción de sinergia
   Nota: Paso 1.5 identifica a mutantes de predicción supuesta sinergia. Aquí, determinamos que estos mutantes funcionará mejor en una pantalla de alto rendimiento para fármacos sinérgicos. Se realizó este ensayo en una máquina de Bioscreen, pero 96 lectores de placa bien también deberían ser aceptables.
   1. Crecer cada supuesta sinergia predicción mutantes y las células de tipo salvaje en los media mínimo M9.
   2. Configurar el 100 del panal bien placa (o 96 bien) con el medio de crecimiento apropiado, medio de crecimiento drogas entrada, medio de cultivo + conocido socio sinérgico de la entrada droga y medio de crecimiento + conocida droga no sinérgico. Asegúrese de incluir el control del vehículo.
      Nota: Se recomienda que cuatro replicar pozos para cada cepa / / concentración de la droga.
   3. Inocular 1.000 células por pocillo, incluyendo pozos de control en blanco.
   4. Crecen 48 h a 37 ° C, con agitación y leer OD₆₀₀ cada 20 minutos.
   5. Determinar el punto de concentración y tiempo de droga que muestra la mayor diferencia de crecimiento entre el tipo salvaje y sinergia las células mutantes predicción en presencia de la droga de entrada y sus socios sinérgicos conocidos. En el punto óptimo tiempo y concentración, no debe haber mucha diferencia de crecimiento entre el tipo salvaje y sinergia predicción las células mutantes cuando se cultivan en presencia de fármacos que no actúan de forma sinérgica con la droga de entrada (figura 3).
2. Pantalla de alto rendimiento para fármacos sinérgicos
   1. Crecen las células de tipo salvaje y las células mutantes sinergia predicción en los media mínimo M9.
      Nota: Utilice el medio de cultivo adecuado para organismo de interés.
   2. Añadir medicamentos de la biblioteca a los medios de comunicación por lo que cada bien que contiene 100 μl con moléculas pequeñas en conjunto concentración que determinó en el paso anterior. Incluyen pozos en blanco (sin células) y pozos con controles del vehículo (e.g., DMSO) para tener en cuenta cualquier inhibición del crecimiento por el vehículo de dilución de la droga.
      1. Preparar al menos cuatro pozos de control de vehículos por placa, idealmente repartidas por toda la placa para tener en cuenta para efectos de posición bien. Si los ensayos son variables, entonces incluya al menos un control del vehículo bien por fila o columna y utilice el control de cada fila o columna así como el control para el cálculo de puntuaciones Z para cada fila o columna en lugar de una placa entera (paso 4.2.5).
   3. Añadir 2 μl de la cultura a cada bien como antes. (Una placa de bacterias de tipo silvestre y una placa de bacterias mutantes sinergia predicha).
   4. Evaluar el OD₆₀₀ 0 y 18 h de e. coli o 48 h para C. neoformans.
   5. Software de hoja de cálculo, calcular el crecimiento neto restando el OD₆₀₀ de pocillos del blanco de los pozos de control de vehículo. Identificar pozos con un Z-score de -2.5 (puntaje Z = media - 2.5 * desviación estándar). Estos pozos contienen una molécula pequeña de potencial sinergista.
   6. Validar los éxitos de la pantalla usando los métodos descritos en el paso 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Ensayos de tablero de ajedrez son un método semi-cuantitativo para la medición de las interacciones sinérgicas. El resultado final de la salida, FICI, determina si una combinación de fármacos se considera sinérgico (FICI ≤0. 5), no-que obran recíprocamente (0.5 < FICI < 4), o antagonistas (FICI ≥4.0). La figura 1 ilustra cómo establecer los gradientes de la droga en un ensayo de tablero de ajedrez. La figura 2 ilustra...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Pares sinérgicos molécula pequeña pueden ser una poderosa herramienta en el tratamiento de las infecciones microbianas, pero no han alcanzado su potencial clínica completa porque pares sinérgicos son difíciles de identificar. Este artículo describe un método para identificar pares sinérgicos mucho más rápidos que las combinaciones pares simple. Mediante el uso de conjuntos de datos de genética química, O2M identifica a mutantes con knockouts de genes que luego pueden ser utilizados como una lectura a las bib...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioscreen C	instrument	Growth Curves USA
Synergy H1	instrument	BioTek
M9 broth	reagent	Amresco	J863-500G
Casamino Acids	reagent	Fisher Scientific	BP1424-500
Glucose	reagent	Sigma	G7021-10KG
Nicotinic Acid	reagent	Alfa Aesar	A12683
Thiamine	reagent	Acros Organics	148991000
CaCl2 Dihydrate	reagent	Fisher	C79-500
MgSO4 Heptahydrate	reagent	Fisher	M63-500
chemical-genetics dataset	dataset	examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.
trimethoprim (example input drug; any can be used)	reagent	Fisher Scientific	ICN19552701
sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)	reagent	Fisher Scientific	ICN15671125