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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Combinaisons de drogues synergiques sont difficile et fastidieux d’identifier empiriquement. Nous décrivons ici une méthode pour identifier et valider synergiques petites molécules.

Résumé

Bien que les médicaments antimicrobiens ont considérablement augmenté la durée de vie et de la qualité de vie au 20ème siècle, la résistance aux antimicrobien menace capacité de notre société tout entière pour traiter les infections systémiques. Dans les seuls États-Unis, les infections résistantes aux antibiotiques tuent environ 23 000 personnes par an et le coût environ 20 milliards USD en soins de santé supplémentaires. Une approche pour lutter contre la résistance aux antimicrobien est la thérapie de combinaison, qui est particulièrement utile dans la phase critique au début de l’infection, avant que le micro-organisme infectieux et son profil de résistance de drogue ont été identifiés. De nombreux traitements antimicrobiens recours à des thérapies de combinaison. Cependant, la plupart de ces combinaisons sont additifs, ce qui signifie que l’efficacité combinée est identique à la somme de l’efficacité des antibiotiques. Certaines thérapies de combinaison sont synergiques : l’efficacité combinée est beaucoup plus grande que l’additif. Combinaisons synergiques sont particulièrement utiles car ils peuvent inhiber la croissance des souches résistantes aux médicaments antimicrobiens. Cependant, ces combinaisons sont rares et difficiles à identifier. C’est en raison du nombre considérable de molécules nécessaires pour être analysées d’une manière par paires : une bibliothèque de 1 000 molécules a 1 million de combinaisons possibles. Ainsi, s’est efforcé de prédire des molécules de synergie. Cet article décrit notre méthode de haut-débit pour la prévision des paires synergique petite molécule appelées le chevauchement2 méthode (O2M). O2M utilise des modèles d’ensembles de données chimiques et génétiques pour identifier les mutants qui sont hypersensibles à chaque molécule dans une paire synergique mais pas à d’autres molécules. Le laboratoire brun exploite cette différence de croissance en effectuant un écran haut débit de molécules qui inhibent la croissance du mutant mais pas sauvage-type cellules. Travaux du laboratoire a déjà identifié des molécules qui agir en synergie avec l’antibiotique triméthoprime et le médicament antifongique fluconazole à l’aide de cette stratégie. Ici, les auteurs présentent une méthode à l’écran pour des combinaisons nouvelles synergiques, qui peut être modifié pour les micro-organismes multiples.

Introduction

Bactéries résistantes aux antibiotiques causent plus de 2 millions d’infections et de 23 000 décès chaque année aux États-Unis selon la CDC1. Nouveaux traitements sont nécessaires pour surmonter ces infections. Stratégies pour identifier ces nouveaux traitements comprennent le développement de nouveaux médicaments antimicrobiens ou la réutilisation des petites molécules approuvés pour d’autres conditions traiter les infections microbiennes2,3,4. Toutefois, la découverte de nouveaux médicaments est très coûteux et long. Réaffectation des médicaments peut ne pas identifier de nouveaux médicaments ou drogues vise5,6. Notre laboratoire se concentre sur une troisième stratégie dite de thérapies de combinaison synergique. Combinaison synergique se produire lorsque deux petites molécules ensemble, ont une efficacité supérieure à l’effet additif de leur efficacité individuelle7. En outre, les combinaisons synergétiques peuvent être efficaces contre un pathogène résistant à l’une des petites molécules dans la paire en plus d’avoir moins d’indésirables effets hors cible, rendant le grand potentiel de8,9, 10.

Synergiques paires sont rares, survenant chez environ 4 à 10 % des drogues combinaisons11,12,13. Ainsi, des techniques traditionnelles telles que les écrans sont difficiles et longues, avec des milliers de combinaisons possibles d’une petite bibliothèque d’une centaine de molécules. De plus, des interactions synergiques généralement est imprévisible de l’activité des composés14. Cependant, les auteurs ont développé une approche de haut débit pour dépister les paires synergiques, appelé le chevauchement2 méthode (O2M)12. Cette méthode, décrite ici, permet l’identification plus rapide et plus efficace de ces paires synergiques. O2M nécessite l’utilisation d’une paire de synergique connue et un ensemble de données de produits chimiques-génétique. Produit chimique-génétique des ensembles de données sont générées lorsqu’une bibliothèque de mutants de knock-out est cultivée en présence de nombreuses petites molécules différentes. Si une molécule dans une paire synergique connue induit le même phénotype d’un mutant de knockout particulière que la deuxième molécule synergique, toute autre petite molécule qui provoque le phénotype de ce même mutant doit aussi agir en synergie avec chaque membre de la dite paire de synergique. Ce raisonnement a été utilisé dans le laboratoire de brun pour identifier synergique antibiotique actif contre Escherichia coli (e. coli) et antifongique synergique en paires actives contre le champignon pathogène Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M est non seulement adaptable pour différents agents pathogènes, mais permet le dépistage des grandes bibliothèques de molécules pour identifier des paires synergiques facilement et rapidement. Projection avec le mutant génétique identifié par O2M permet de ne valider que ces petites molécules prévues de synergie. Ainsi, tester une bibliothèque 2 000 molécules pairwise prendrait mois, considérant que s’il y avait seulement 20 molécules dans cette bibliothèque prévue à agir en synergie, maintenant l’essai de synergie a été une question de jours. O2M ne nécessite pas de compétences en programmation, et l’équipement nécessaire est disponible dans la plupart des laboratoires ou des installations de base. En plus de chercheurs qui s’intéressent à des combinaisons de médicaments, analyse O2M est d’intérêt pour toute personne qui a complété un dépistage de drogues et veut étendre leurs succès en identifiant des interactions médicamenteuses importantes. Voici le protocole d’identification synergiques petites molécules chez les bactéries, mais aussi de valider les interactions synergiques prédites dans les dosages connus15,16.

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Protocole

1. identifier la synergie des Mutants de prédiction du Dataset génétique chimique par la méthode2 de chevauchement (O2M)

NOTE : Ceci est la méthode d’identification des mutants de prédiction de synergie à l’aide de l’ensemble de données publiée de Nichols et al.. 17 chez e. coli. Toutefois, cela peut être fait sur n’importe quel dataset chimique-génétique et de microorganismes. Ces ensembles de données contiennent une bibliothèque de mutants knockout cultivées en présence de plus de 100 petites molécules, ce qui donne un score de croissance quantitative pour chaque mutant dans chaque petite molécule. Une paire de synergie doit être connue, et il devrait y avoir des scores de croissance pour les deux petites molécules incluses dans le dataset.

  1. Calculer le score de croissance moyenne et la déviation standard pour tous les mutants cultivées en présence d’une concentration unique de chaque petite molécule.
    Remarque : Cela peut être fait à l’aide de n’importe quel tableur. Le laboratoire brun utilise Excel et les fonctions =AVERAGE(B3:B3981) et =STDEV(B3:B3981) pour les calculs de chaque colonne de petites molécules.
    1. Calculer les moyennes et les écarts de chaque colonne de petites molécules, bien que cette orientation peut varier si vous utilisez un dataset différent.
  2. Calculer les scores Z pour chaque concentration de petites molécules à l’aide du même dataset de Nichols et coll.. 17 dans un tableur. Pour ce faire, les scores z négatif sera Z(2.5) = moyenne - 2.5 * écart type et scores z positif sera Z(2.5) = moyenne + 2.5 * écart-type.
  3. Déterminer quels gènes mutants contiennent des scores Z dans les petites molécules qui composent la paire synergique connue, en veillant à regarder toutes les concentrations de ces molécules. Si la croissance score d’un mutant est inférieure à la Z négatif (2.5) marque ou dépasse le score Z (2.5) positif pour cette petite molécule, il est considéré comme significatif.
  4. Déterminer si un de ces mutants du gène important appartiennent à un opéron.
    Remarque : Pour e. coli, les auteurs recommandent de vérification « Ecoli wiki » pour plus d’informations concernant si les gènes sont transcrits dans le cadre d’un polycistronique RNA.
  5. Identifier les mutants de gène/opéron qui sont communs à la plupart des petites molécules d’intérêt à différentes concentrations (e.g., lorsque la recherche de molécules qui agir en synergie avec l’antibiotiques trimethoprim, identifier des mutants qui montrent une importante Z Note lorsque cultivées en présence de triméthoprime et de ses partenaires synergiques connus comme sulfamethizole ou sulfaméthoxazole). Ce sont des mutants de prédiction synergie putatif.

2. prédiction de Synergizers dans le Dataset de produit chimique-génétique par O2M

  1. De retour au dataset17, identifier chaque concentration de petite molécule qui obtient un score de croissance significative du mutant prédiction synergie. Cela se fait en regardant les scores Z calculées pour chaque concentration de petites molécules. Encore une fois, un score significatif de la croissance est inférieure ou supérieure à la note Z positive pour que la concentration des petites molécules le score Z négatif.
    Remarque : Si une molécule apparaît en un seul de ses concentrations, la molécule est considérée comme une synergizer estimée. N’importe quelle molécule qui ne pas permis d’obtenir un score de croissance significative est un non-synergizer prédite.

3. validation des Interactions synergiques prédites

  1. Trouver la concentration minimale inhibitrice (CMI) de synergizers prédites.
    1. Développer une culture nuitée d’Escherichia coli en milieu minimal M9 à 37 ° C.
      Remarque : Toute une culture peut être cultivée dans un milieu bien défini pour l’organisme d’intérêt. Le laboratoire brun ne recommande pas de rich média comme LB ou la DPJ. M9 milieu minimal se compose de 10,5 g/L de bouillon de M9, acides casamino de 0,2 %, 0,1 M CaCl2, 0.4 % de glucose, 1 M MgSO4, acide nicotinique de 0,25 % et 0,33 % de thiamine dans H2O.
    2. Si aucune donnée MIC pour pathogène d’intérêt se trouve dans la littérature après avoir reçu les petites molécules, se dissoudre dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration élevée (> 10 mg/mL).
    3. À l’aide d’une plaque à 96 puits, ajouter 100 µL de médias M9 dans chaque puits. Ajouter un extra 100 µL de médias M9 à la colonne 1 donc il contient un total de 200 µL.
    4. Ajouter une quantité arbitraire (~ 10 µL) de solution concentrée de petites molécules dans la colonne 1. Une petite molécule / puits de la colonne 1 (8 petites molécules par plaque).
      NOTE : Ce sont les petites molécules d’intérêt, qui sont prévus pour mettre en synergie. Le laboratoire brun ajoute généralement 10 µL de solution très concentrée de petites molécules, ce qui est inférieur au montant de DMSO 100 % qui peut inhiber l’e. coli.
    5. Une fois que les petites molécules ont été ajoutés, diluer les petites molécules dans l’ensemble de l’axe des abscisses de la plaque. Prenez 100 µL de solution de la colonne 1, placer dans la colonne 2 et mélanger. Prenez 100 µL dans la colonne 2, placer dans la colonne 3 et mélanger. Continuez ce processus jusqu'à ce que 100 µL sont placées dans la colonne 11. Mélanger la colonne 11, puis prendre 100 µL dans cette colonne et jeter. Laissez la colonne 12 avec quelques médias pour normaliser les données.
    6. L’ensemencer. Obtenir la densité optique (OD600) d’une culture d’une nuit ou plus. Préparer une solution avec la culture et des médias de M9 à une OD600 de 0,002 (ou concentration qui représente 500 cellules/µL pour l’organisme désiré d’intérêt le cas). Pipeter 2 µL de solution nutritive dans chaque puits de la plaque, donc il y a 1 000 cellules par puits.
    7. Agiter la plaque doucement et obtenir l' OD600 pour la 0 h de lecture. Laissez la plaque de croissance à 37 ° C pendant 24 h. obtenir l' OD600 pour les 24 h de lecture.
      Remarque : Utilisation appropriée conditions pour d’autres organismes d’intérêt de la croissance.
    8. Calculer la croissance nette pour chaque bien en utilisant un tableur.
    9. Moyenne de la croissance nette de colonne 12 afin de n’obtenir la moyenne aucun accroissement de médicaments. Normaliser les autres puits à la moyenne d’aucun accroissement de médicaments à l’aide d’un tableur. Recherchez un puits avec moins de 10 % la croissance afin d’identifier la CMI90. Tout bien avec moins de 50 % la croissance indique la CMI50. Calculer la concentration de petites molécules dans ces puits.
  2. Damier dosages pour des interactions synergiques
    1. Développer une culture nuitée d’Escherichia coli en milieu minimal M9 comme avant.
      NOTE : Conditions pour d’autres organismes de croissance d’utilisation appropriée.
    2. Ajouter 100 µL de médias M9 dans chaque puits d’une plaque 96 puits et un extra 100 µL dans la colonne 1.
    3. Ajouter la petite molécule de test (à ~ 8 x MIC) à chaque bien dans la colonne 1 et ajouter le double de la concentration (~ 16 x MIC) à puits A1 (une petite molécule testée par plaque).
      Remarque : Ce montant est déterminé par les avant de test terminé MIC et diffère pour chaque potentiel synergizer.
    4. Créer une dégradé dilution sur l’axe des abscisses en prenant 100 µL dans la colonne 1 et en transférant à la colonne 2. Continuez ce processus jusqu'à ce que 100 µL est ajoutée à la colonne 11. Mélanger, puis prendre 100 µL dans colonne 11 et jeter. N’ajoutez pas de n’importe quel médicament à colonne 12 (Figure 1 a).
    5. Mettre en place le second gradient de drogue dans l’ensemble de l’axe des ordonnées pour la drogue saisie. Ajouter 100 µL de milieu contenant 2 x MIC de la molécule d’entrée dans la rangée A. mélange et diluées comme avant, en prenant 100 µL de la ligne A et de placer en B. continuez jusqu'à 100 µL est placé dans la ligne G. Mix, prendre 100 µL et dispose, assurant ne pas pour ajouter n’importe quelle drogue saisie en ligne H. Cela permet la ligne H et la colonne 12 contiennent des micros individuels de la paire de médicaments testée (Figure 1 b).
    6. L’ensemencer. Ajouter 2 µL d’une culture d’e. coli de OD600 0,002 dans chaque cupule (1 000 cellules / puits).
    7. Mesurer l' OD600 de chaque puits de la plaque pour la lecture de 0 h.
    8. Incuber les plaques pendant 24 h à 37 ° C.
    9. Mesurer l' OD600 de chaque puits à 24h.
  3. Calcul de l’indice de concentration inhibitrice fractionnaire (FICI) de damiers
    1. Calculer la croissance nette pour chaque puits de la plaque en soustrayant l' OD600 à 0 h de l' OD600 à 24 h dans un tableur.
    2. Normaliser la croissance dans le logiciel en divisant chaque H12 de puits en puits, qui ne contient aucune petite molécule.
    3. Trouver la CMI90 de la molécule d’entrée dans la colonne 12 et la CMI90 du synergiste potentiel en ligne H.
    4. Recherchez tous les puits qui inhibent les 90 % de la croissance.
    5. Calculer le FICI90 pour le bien, c’est soit le plus bas ci-dessous (synergie) ou plus haut par rapport (antagonistes) les deux valeurs de CMI90, à l’aide de l’équation :
      figure-protocol-9833
    6. Examiner toute FICI ≤ 0,5 comme synergique et FICI ≥ 4 comme antagonistes (Figure 2).
      Remarque : Cela peut aussi être fait avec CMI50 (50 % d’inhibition de croissance) pour obtenir un FICI50 basé sur les valeurs de CMI.
  4. Test d’indépendance de Bliss
    Remarque : L’indépendance Bliss est exécuté avec un synergiste potentiel qui n’a-t-elle pas un micro sur son propre.
    1. Développer une culture nuitée d’Escherichia coli dans les médias de M9 à 37 ° C, comme avant.
      Remarque : Encore une fois, des conditions de croissance appropriées pour d’autres organismes d’intérêt peuvent être utilisées dans cette étape.
    2. Préparer les plaques à 96 puits pour tester la molécule synergique potentielle, la molécule d’entrée, la combinaison et un contrôle non traitées.
    3. Créer la plaque synergiste potentiels en ajoutant 50 µL de médias M9 dans chaque puits. Ajouter 50 µL de milieux contenant une concentration set (10 µM ou 100 µM) du synergiste potentiel dans chaque puits d’une ligne. Test 8 molécules par plaque.
    4. Créer la plaque d’entrée de molécule en ajoutant 50 µL de médias dans chaque puits. Ajouter 50 µL contenant 4 x MIC de la drogue saisie dans chaque puits en colonne 1. Créer une dilution gradient le long de l’axe des abscisses semblables aux plaques de MIC, prenant 50 µL de la colonne 1, dispersion et le mélange dans la colonne 2. Continuez ce processus jusqu'à la colonne 12, disposant de 50 µL de colonne 12. Ajouter une supplémentaire 50 µL de médias dans chaque puits, donc le total de la fin de chaque puits est 100 µL.
    5. Création de la plaque de combinaison à l’aide d’une plaque 96 puits, ajouter 50 µL de médias dans chaque puits. Ajouter 50 µL contenant 4 x MIC de la drogue saisie dans chaque puits en colonne 1. Diluer le long de l’axe des abscisses est similaire aux plaques de MIC, prenant 50 µL de la colonne 1, dispersion et le mélange dans la colonne 2. Cela continue tout le chemin à colonne 12, disposant de 50 µL de colonne 12. Ajouter 50 µL de milieux contenant le synergiste potentiel à 10 µM ou 100 µM pour chaque puits d’une ligne. Encore une fois, il devrait y avoir une concentration ou drogue par rang.
    6. Créer le contrôle non traitées en ajoutant 100 µL de M9 médias à tous les puits de la plaque.
    7. Inoculer les boites en ajoutant 2 µL de culture bactérienne avec une OD600 de 0,002 ou 1 000 cellules dans chaque puits comme avant.
    8. Mesurer l' OD600 de chaque puits à 0 et 24h.
  5. Calcul du Score d’indépendance Bliss
    1. Calculer la croissance nette pour chaque puits de la plaque en soustrayant l' OD600 h 0 de la croissance après 24 h à l’aide d’un tableur.
    2. Normaliser les puits à la croissance moyenne de la plaque d’aucune drogue dans un tableur.
    3. À l’aide du tableur, calculer l’inhibition en soustrayant la croissance nette de 1.
    4. Moyenne des colonnes dans la plaque de contrôle contenant uniquement le gradient d’entrée dans le logiciel de feuille de calcul.
    5. Calculer le score de bonheur pour chaque puits par l’équation :
      Bliss Score = (bien X + colonne d’entrée X) – combinée bien X
    6. Recherchez les scores négatifs dans les puits sous la CMI90 de l’entrée.
      Remarque : Les scores négatifs à travers plusieurs concentrations indiquerait une interaction synergique.

4. high-throughput écran avec synergie Mutants de prévision pour identifier des paires synergiques roman

  1. Identifier les mutants de prédiction de synergie
    NOTE : Étape 1.5 identifié des mutants de prédiction synergie putatif. Ici, nous déterminer lequel de ces mutants fonctionnera mieux dans un écran de haut débit pour les drogues synergiques. Nous avons effectué ce test dans une machine de Bioscreen, mais 96 lecteurs de plaques bien doivent aussi être acceptables.
    1. Grandir chaque synergie putatif prédiction mutants et les cellules de type sauvage en milieu minimal M9.
    2. Mettre en place le 100 bien en nid d’abeille plaque (ou plaque bien 96) avec le milieu de culture approprié, milieu de culture drogue d’entrée, milieu de croissance + partenaire synergique connu de la drogue saisie et le milieu de croissance + médicament non synergique connu. Assurez-vous d’inclure des commandes du véhicule.
      Remarque : Nous recommandons que quatre répliquer les puits pour chaque concentration du médicament/souche /.
    3. Inoculer 1 000 cellules / puits, y compris les puits de contrôle à blanc.
    4. 48 h à 37 ° C, sous agitation, de croître et lu OD600 toutes les 20 min.
    5. Déterminer le point de concentration et du temps de drogue qui montre la plus grande différence de croissance entre le type sauvage et la synergie des cellules mutantes prédiction en présence de la drogue saisie et de ses partenaires synergiques connus. Au moment optimal et concentration, il faudrait pas grande différence de croissance entre sauvage et synergie prédiction cellules mutantes lorsque cultivées en présence de médicaments connus ne pas agir en synergie avec le médicament d’entrée (Figure 3).
  2. Écran haut débit pour les drogues synergiques
    1. Cultiver des cellules de type sauvage et synergie prédiction des cellules mutantes en milieu minimal M9.
      Remarque : Utilisez le milieu de culture approprié pour l’organisme d’intérêt.
    2. Ajouter drogues de la bibliothèque media donc chaque bien qui contient 100 µL support avec petites molécules à concentration set qui a été déterminé à l’étape précédente. Inclure des puits vides (sans cellules) et puits avec les commandes du véhicule (e.g., DMSO) pour tenir compte de toute inhibition de la croissance par le véhicule de dilution du médicament.
      1. Préparer au moins quatre puits de contrôle de véhicule par plaque, idéalement répartis sur la plaque pour tenir compte des effets de position bien. Si les dosages sont variable, puis inclure au moins un contrôle de véhicule bien par ligne/colonne et utilisez chaque contrôle de ligne/colonne ainsi que le contrôle pour calculer les scores Z pour chaque ligne/colonne au lieu de pour une plaque entière (étape 4.2.5).
    3. Ajouter 2 µL de culture dans chaque puits comme avant. (Une assiette pour les bactéries de type sauvage et une plaque pour les bactéries mutantes synergie prédite).
    4. Évaluer l' OD600 à 0 et 18 h pour e. coli ou 48 h pour c. neoformans.
    5. À l’aide du tableur, calculer la croissance nette en soustrayant l' OD600 puits vide par les puits de contrôle du véhicule. Identifier les puits avec un Z-score de -2,5 (score Z = moyenne - 2.5 * écart-type). Ces puits contiennent une molécule de petite synergiste potentiels.
    6. Valider l’écran hits utilisant les méthodes décrites à l’étape 3.

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Résultats

Les dosages de damier sont une méthode semi-quantitative pour mesurer les interactions synergiques. Le score final de sortie, FICI, détermine si une combinaison de médicaments est considérée comme synergique (FICI ≤0, 5), sans interaction (0,5 < FICI < 4), ou antagonistes (FICI ≥4.0). La figure 1 illustre comment configurer les gradients de drogue lors d’un essai de damier. La figure 2 illustre les résultats communs. ...

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Discussion

Synergique petite molécule paires peuvent être un outil puissant dans le traitement des infections microbiennes, et pourtant ils n’ont pas atteint leur potentiel clinique complète car synergiques paires sont difficiles à identifier. Cet article décrit une méthode pour identifier les paires synergiques beaucoup plus rapides que des combinaisons simples par paires. En utilisant des ensembles de données de produits chimiques-génétique, O2M identifie des mutants avec débouchures de gène qui peuvent alors servir ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de démarrage du département de pathologie, Université de l’Utah à J.C.S.B.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioscreen CinstrumentGrowth Curves USA
Synergy H1instrumentBioTek
M9 brothreagentAmrescoJ863-500G
Casamino AcidsreagentFisher ScientificBP1424-500
GlucosereagentSigmaG7021-10KG
Nicotinic AcidreagentAlfa AesarA12683
ThiaminereagentAcros Organics148991000
CaCl2 DihydratereagentFisherC79-500
MgSO4 HeptahydratereagentFisherM63-500
chemical-genetics datasetdatasetexamples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.
trimethoprim (example input drug; any can be used)reagentFisher ScientificICN19552701
sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)reagentFisher ScientificICN15671125

Références

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Réimpressions et Autorisations

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