Modelo de una rata de la fatiga Central mediante la método de plataforma múltiple

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para introducir un modelo de rata de la fatiga central mediante la modificación del método de plataforma múltiples (MMPM).

Resumen

En este artículo, presentamos un modelo de rata de la fatiga central mediante la modificación del método de plataforma múltiples (MMPM). La caja de plataforma múltiple fue diseñada como un tanque de agua con plataformas estrechas en la parte inferior. Las ratas del modelo se pone en el tanque y estaba paradas en las plataformas de 14 h (18:00-8:00) por día por 21 días consecutivos, con un grupo de control en blanco para el contraste. Al final del modelado, ratas en el grupo modelo mostraron un evidente aspecto fatigado. Para evaluar el modelo, realizamos varias pruebas de comportamiento, incluyendo el campo de prueba (OFT), el elevado además de laberinto (EPM) y la prueba de natación exhaustivo (ES). Los resultados mostraron ansiedad, deterioro de la cognición espacial, rendimiento muscular pobre y disminuyó actividad voluntaria presentada en ratas modelo confirman el diagnóstico de la fatiga central. Cambios de los neurotransmisores centrales también verifica el resultado. En conclusión, el modelo simulado con éxito la fatiga central y estudio con el modelo puede ayudar a revelar el mecanismo patológico de la enfermedad.

Introducción

La fatiga es uno de los principales factores que amenazan la salud humana¹. En las últimas décadas, diversas investigaciones han demostrado que la fatiga es periférico activa pero impulsado por el centro y siempre acompañado con trastornos emocionales y cognitivos. Fisiólogo italiano Mosso A. propuso por primera vez la palabra fatiga Central². Se define generalmente como una actividad voluntaria limitada y deterioro de la cognición debido a la disfunción de la transmisión del impulso en el sistema nervioso central (SNC)³. En comparación con fatiga muscular periférica, fatiga central hace hincapié en cambios en el SNC, así como los consiguientes disturbios emocionales/del comportamiento, incluyendo depresión, ansiedad, deterioro de la cognición y pérdida de la memoria. Un estudio demuestra que muchos factores pueden inducir fatiga central, entre los cuales la actividad física excesiva y estrés mental son absolutamente indispensable⁴. En cuanto a la patogenia, teorías como la quinurenina triptófano vía hipótesis⁵ explican los cambios en ciertas vías; sin embargo, estudios más en profundidad se requiere revelar las correlaciones central periférico de la fatiga central.

Como el mecanismo subyacente de la fatiga central es todavía confuso, un modelo animal eficaz es muy importante para futuras investigaciones. Los modelos existentes de la fatiga en su mayoría son inducidos por ejercicio excesivo, como cintas de correr⁶ y cargado de peso natación⁷, con poco interés en factores mentales. Para mejor simular el desarrollo de la fatiga central, nuestro grupo desarrolló un modelo de rata con el MMPM. Durante el proceso de modelado, las ratas permanecen de pie en las plataformas estrechas en la caja de plataforma múltiple durante largas horas, incluyendo parte del tiempo para dormir. A diferencia de los modelos de ejercicio excesivo, el modelo MMPM utiliza la privación parcial de sueño como un factor mental en la consideración de la compleja patogénesis de la fatiga central.

Para la evaluación del modelo, utilizamos las pruebas OFT y EPM para determinar el estado de ánimo de ansiedad y actividad voluntaria. Se realiza la prueba ES para medir el rendimiento del músculo periférico. Además, tomamos el cerebro de la rata y detectar la dopamina (DA) / contenido de la serotonina (5-HT) en ambos hypothalamuses para observar las diferencias de neurotransmisor central.

El protocolo que se presenta a continuación está diseñado para fatiga central modelo inducido por actividad física repetida y falta de sueño, imitando una condición común en la vida humana. Sin embargo, ajustando la duración del modelo, puede utilizarse en muchos otros campos, como en estudios de observación y de la tensión del sueño. En el futuro investigación, esperamos que este modelo ayudará a descubrir más cambios en la CNS y su conexión con el sistema periférico, para revelar el mecanismo de patogénesis de la fatiga central.

Protocolo

Todos los animales fueron mantenidos siguiendo las directrices de la legislación China sobre el uso ético y cuidado de animales de laboratorio.

1. modelado de la preparación

1. Preparación de laboratorio
   1. Funcionamiento la lámpara UV durante al menos 30 minutos antes del experimento.
   2. Control de la temperatura de laboratorio a 25 ± 3 ° C y humedad relativa alrededor del 30%.
   3. Encienda el luz en 6:00 laboratorio y apague en 18:00 para establecer un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
2. Construcción de caja de plataforma múltiple
   1. La construcción de un tanque plástico opaco sin una cobertura de 110 × 60 × 40 cm³.
   2. Arreglar quince plataformas circulares (h = 8 cm, d = 6,5 cm) en la parte inferior del tanque, que ordenada se distribuyen en tres filas y cinco columnas. Deje espacio suficiente entre cada plataforma, aproximadamente 10 cm entre columnas y 13 cm entre filas.
   3. Establecer una toma de agua en el lado lateral del tanque e instalar un grifo.
   4. Hacer una cubierta de malla de alambre de hierro para el tanque con una caja de alimentos colgando en él.
3. Agrupación y ratas de vivienda
   Nota: Ratas macho Wistar de 8 semanas de edad, pesa aproximadamente 200-210 g, se utilizan en el experimento. Las ratas viven en grupos durante el proceso de modelado.
   1. Número de raíces de cola de las ratas con un rotulador.
   2. Pesar las ratas, excluyen extremadamente ligero o más pesados y el resto se dividen al azar en los grupos modelo y control.
   3. Poner suavemente las ratas en jaulas limpias y que puedan aclimatarse al laboratorio al menos durante 3 días. Proporcionar suficiente suministro de agua y alimentos.

2. modelado con MMPM

Nota: El proceso comienza a las 18:00 y termina a las 8:00 al día siguiente, para un total de 14 horas diarias, durante 21 días. Para evitar factores de interferencia, la misma persona se requiere para llevar a cabo todo el experimento, usando la misma capa del laboratorio. 10 ratas Wistar se utilizan en el experimento.

1. Coloque el tanque sobre una superficie plana, por ejemplo, el piso. Luego llene el tanque con aproximadamente 7 cm de agua tibia (25 ± 3 ° C), aproximadamente 1 cm por debajo de la plataforma plana.
2. Preparar suficiente comida y bebida para todas las ratas en el tanque durante 1 día. Poner el forraje y el agua en la caja de alimentos y colgarlo en la portada.
   Nota: Algunas ratas inteligentes aprenden a descansar en la caja de alimentos. Si es así, conducen hacia el tanque.
3. Sacar a las ratas del grupo de modelo de la jaula, agarra por la cola y puso suavemente en el tanque. Lanzamiento de todas las ratas en el agua en vez de las plataformas para motivar a su miedo del agua. Asegúrese de que cada rata obtiene una plataforma para estar de pie, mientras que las ratas del grupo control permanecen en sus jaulas originales con suficiente comida y agua.
4. Cubrir el depósito. Controlar las ratas para evitar lesiones accidentales. Si una rata se queda en el agua por más de 1 h sin subir a la plataforma, pick sale del tanque y retire de la prueba.
5. Después de 14 horas, saque las ratas modelo del tanque y seque su cabello con un secador. Vuelva a marcar las colas de las ratas si se descolora. Volver a las ratas a sus jaulas originales y darles suficiente comida y agua.
6. Limpie todos los rincones del tanque. Elevar un lado del tanque y abra el grifo para la salida de las aguas residuales.
7. Esterilizar el tanque con un spray de etanol 75% y exponerlo a la luz UV.

3. modelo de evaluación: Prueba de comportamiento

Nota: Todas las pruebas se realizan en el laboratorio de comportamiento. Ruido y luz extra no son permitidos durante la prueba para evitar perturbaciones. Si es posible, utilizar a la misma persona o personas para realizar cada prueba. Una capa oscura y guantes son necesarios para el reconocimiento de escala de grises en procesamiento de imágenes. Realizar la OFT primero ya que tiene el menor efecto sobre el comportamiento de la rata.

1. TANTAS VECES
   1. Compruebe la grabadora de la caja de campo abierto para asegurarse de que está correctamente conectado a la estación de trabajo y cubre todos los rincones de la caja. Ajuste la iluminación para eliminar las sombras en el cuadro.
   2. Mueva las ratas en el laboratorio de comportamiento en sus jaulas originales. Que puedan aclimatarse durante al menos 1 h antes del examen.
   3. Limpie y desinfecte la caja con 75% de etanol para garantizar que no hay excremento u olor a la izquierda del anterior experimento.
   4. Eliminar una rata de la jaula por su espalda y ponga suavemente en la zona central de la caja. Retiro rápidamente los brazos de la caja para no bloquear el tiro.
   5. Entrada de número de la rata y empezar a grabar. Contar y registrar la frecuencia de actividades verticales de la rata, incluyendo de crianza y escalada.
   6. Después de 5 minutos, detenga la grabación, saque a la rata de la caja y volver a la jaula.
   7. Repita los pasos 3.1.3 - 3.1.6 hasta que todas las ratas han terminado la prueba.
2. EPM
   1. Realice los pasos de revisión previa y la aclimatación en cuanto a la OFT (pasos 3.1.1 - 3.1.2).
   2. Eliminar una rata de la jaula por su espalda y puso suavemente sobre la parte de unión de los dos brazos. La rata hacia el brazo izquierdo abra la tierra y salir rápidamente para no bloquear el tiro.
   3. Entrada de número de la rata y empezar a grabar. Contar y registrar la frecuencia de entradas de brazo diferente. Si la rata deja en el laberinto en la prueba, recoger y enviar de vuelta al laberinto. Registrar toda la información para análisis de datos.
   4. Después de 5 minutos, detenga la grabación, tomar la rata hacia fuera y volver a la jaula.
   5. Retire el excremento y el laberinto con etanol al 75% para eliminar el olor de la rata anterior.
   6. Repita los pasos 3.2.2 - 3.2.5 hasta que todas las ratas han terminado la prueba.
3. ES prueba
   1. Llene el tanque de natación (70 × 30 × 110 cm³) con 80 cm de agua caliente (25 ± 3 ° C).
      Nota: Si hay un termostato en el tanque, la temperatura del agua debe establecerse unos 37 ° C, que es similar a la temperatura corporal de la rata. Si no, ajustar a la temperatura para mantenerla constante.
   2. Hacer una carga para cada rata con pin racimos y atar suavemente en su raíz de la cola. La carga pesa 10% del peso de la rata.
   3. Agarrar una rata por la cola y tirar en el tanque de natación. Si las ratas se amontonan o se aferran a la pared, puso aparte y conducir en el agua.
   4. Iniciar sincronización en el momento cuando la rata se pone en el agua y detener la sincronización cuando se agota, que se demuestra como la falta de lucha fuera del agua con la boca y la nariz bajo el agua por más de 10 s.
      Nota: A veces, agotamiento y los ahogamientos ocurren repentinamente. Asegúrese de tener suficiente experimentadores para grabar y guardar el animal al mismo tiempo.
   5. Eliminar las ratas agotadas fuera del agua sin interrumpir a otros. Su cabello seco, vuelva a marcar sus números y enviar a la jaula.
   6. Cambie el agua en el tanque después de que un grupo termine. Después de todas las ratas, vacíe el tanque de natación y limpiar y esterilizar con luz UV y etanol.

4. modelo de evaluación: Neurotransmisor Central detección

1. Anestesiar la rata con la inyección intraperitoneal de hidrato de cloral 10% (3 mL/kg) hasta que quede inconsciente.
2. Decapita a la rata.
3. Haga una incisión longitudinal a lo largo de la línea posterior medial, abrir el cráneo a ambos lados y exponer el cerebro. Voltee el cráneo, quitar el cerebro y poner el cerebro en un bolso del hielo.
4. Separe y retire el hipotálamo, que es el área en forma de diamante en la parte central de la base del cerebro que tiene un límite claro con los tejidos circundantes. Colocar en un tubo estéril y congelarlo con nitrógeno líquido. Almacenar las muestras en un refrigerador de-80 ° C.
5. Detectar el contenido de DA y 5-HT en el hipotálamo mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)⁸.

Resultados

Describimos un modelo de rata de la fatiga central mediante MMPM. 24 ratas Wistar se dividen al azar en el grupo control y el grupo modelo, con 12 ratas en cada grupo. El aparato modelo está diseñado como un tanque de agua con plataformas estrechas en la parte inferior (figura 1). Las ratas modelo soporte en las plataformas de 14 horas diarias, incluyendo el tiempo de sueño parcial, durante 21 días (figura 2).

Discusión

El MMPM se diseña originalmente para la privación de sueño⁹. Las ratas se lanzan en un tanque de agua con plataformas fijadas en la parte inferior. Impulsado por el miedo instintivo del agua, las ratas siguen de pie en las plataformas y no sueño ocurre. El estudio muestra que diferentes horas de privación del sueño conducen a varios cambios en el comportamiento de la rata y estado de ánimo, incluyendo reconocimiento deterioro¹⁰emociones negativas^11<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.