쥐 모델에 수정 사용 하 여 중앙 피로의 여러 플랫폼 메서드

요약

여기, 선물이 수정 사용 하 여 중앙 피로의 쥐 모델을 소개 하는 프로토콜 여러 플랫폼 메서드 (MMPM).

초록

이 문서에서는, 우리는 수정 사용 하 여 중앙 피로의 쥐 모델을 도입 여러 플랫폼 메서드 (MMPM). 여러 플랫폼 상자는 물 탱크 바닥에 좁은 플랫폼으로 설계 되었습니다. 모델 쥐 탱크에 투입 되었고 빈 제어 그룹 대비 설정 연속 된 21 일 동안 하루 14 h (18시-8:00)에 대 한 플랫폼에 서 서. 모델링의 끝에, 모델 그룹에서 쥐 명백한 피로 모습을 보여주었다. 모델을 평가 하기 위해 여러 가지 행동 테스트를 수행 했습니다, 오픈 필드를 포함 하 여 테스트 (자주)는 높은 플러스 미로 (EPM) 테스트, 그리고 철저 한 수영 (ES) 테스트. 결과 그 불안, 공간 인식 장애, 불 쌍 한 근육 성능과 거부 자발적인 활동 모델 쥐에 중앙 피로의 진단을 확인 보여주었다. 중앙 신경 전달 물질의 변화는 또한 결과 확인합니다. 결론적으로, 모델은 성공적으로 중앙 피로, 시뮬레이션 및 모델 미래 연구는 질병의 병 적인 메커니즘을 공개 도움이 될 수 있습니다.

서문

피로¹인간의 건강 위협 하는 주요 요인 중 하나 이다. 지난 수십 년간에서 다양 한 연구는 피로 주변 실행 하지만 중앙 기반, 그리고 항상 감정과 인지 장애와 함께 입증 해야 합니다. 이탈리아 생리학자 A. Mosso 먼저 단어 중앙 피로²제안. 그것은 제한 된 자발적인 활동 및 중앙 신경 조직 (CNS)³의 충 동 장애 때문 인지 장애로 일반적으로 정의 된다. 주변 근육 피로와 비교해, 중앙 피로 CNS, 필연적인 감정/행동 장애, 우울증, 불안, 인지 장애, 그리고 기억 상실을 포함 하 여에 있는 변화를 강조 합니다. 한 연구는 많은 요인은 과도 한 신체 활동 및 정신적인 스트레스는 매우 필수적인⁴중앙 피로 일으킬 수 보여줍니다. 병 인에 관해서는 트립토판 kynurenine 통로 가설⁵ 같은 이론 설명; 특정 경로에 변화 그러나, 더 깊이 있는 연구는 여전히 중앙 피로의 중앙 주변 상관 관계를 공개 해야 합니다.

중앙 피로의 기본 메커니즘은 아직 불분명로 효과적인 동물 모델 추가 연구에 대 한 확실히 중요 하다. 기존 피로 모델은 주로 러닝⁶ 과 체중 로드 수영⁷, 정신적 요인에 작은 우려와 같은 과도 한 운동에 의해 유발 됩니다. 더 나은 중앙 피로의 개발 시뮬레이션, 우리의 그룹은 MMPM 쥐 모델 개발. 모델링 하는 동안 쥐의 수 면 시간 부분을 포함 하 여 긴 시간에 대 한 다중 플랫폼 상자에서 좁은 플랫폼에 서 서 남아 있습니다. 과도 한 운동 모델에서 다른 MMPM 모델 중앙 피로의 복잡 한 병 인을 고려 하 여 정신적인 요인으로 부분 수 면 부족을 사용합니다.

모델 평가 대 한 우리는 불안 분위기와 자발적인 활동을 결정 하는 자주 및 EPM 테스트를 사용 합니다. ES 시험 주변 근육 성능을 측정 하기 위해 수행 됩니다. 또한, 우리 쥐의 뇌를가지고 고 도파민 (DA) 감지 / 중앙 신경 전달 물질의 차이 관찰 하 두 hypothalamuses에서 세로토닌 (5-HT) 콘텐츠.

프로토콜 아래는 모델 중앙 피로 반복된 신체 활동 및 수 면, 인간의 인생에서 일반적인 상태를 흉내 낸의 부족에 의해 유도 된 설계 되었습니다. 그러나, 모델 기간을 조정 하 여 그것은 사용할 수 있습니다 다른 많은 분야에서 처럼 수 면 관측 및 스트레스 연구에서. 미래에 연구, 우리이 모델 더 CNS 변화와 중앙 피로의 pathogenesis 메커니즘을 주변 시스템과 그들의 연결을 발견 도움이 될 것입니다 바랍니다.

프로토콜

모든 동물 지침에 따라 중국 입법에 윤리적인 사용 및 실험실 동물 들에 의해 유지 되었다.

1. 사전 모델링 준비

1. 실험실 준비
   1. 실험 전에 적어도 30 분 동안 UV 램프를 실행 합니다.
   2. 실험실 온도 25 ± 3 ° C, 상대 습도 30%의 주위에 통제 한다.
   3. 6:00 빛 연구소에 돌아서 18:00 12 h/12 h 명암 주기 설정 하에 그것을 해제.
2. 여러 플랫폼 상자 건설
   1. 110 × 60 × 40 cm³의 표지 없이 불투명 한 플라스틱 탱크를 생성 합니다.
   2. 15 원형 플랫폼 수정 (h = 8 m, d = 6.5 c m)는 탱크의 바닥에 어떤 질서에 세 개의 행과 다섯 개의 열 배포. 열과 행 13 cm 10 cm이 약 각 플랫폼 사이 두고 충분 한 공간.
   3. 탱크의 측면 쪽에 물 출구를 설정 하 고 수도 꼭지를 설치.
   4. 그것에 걸려 음식 상자와 탱크에 대 한 철 철사 그물 세공 커버를 확인 합니다.
3. 그룹화 및 주택 쥐
   참고: 8 주 정도, 무게 약 200-210 g의 Wistar 남성 쥐 실험에 사용 됩니다. 쥐는 모델링 과정 그룹에 살고 있습니다.
   1. 마커 펜으로 쥐의 꼬리 뿌리를 번호.
   2. 쥐 무게, 매우 가벼운 또는 무거운 것 들을 제외 하 고 모델 및 제어 그룹으로 나머지를 임의로 분할.
   3. 부드럽게 깨끗 한 연습장에 쥐를 넣어 하 고 적어도 3 일 동안 연구실에 적응 하도록 허용. 충분 한 물과 식량 공급을 제공 합니다.

2입니다. 모델링 MMPM

참고: 과정 18시 시작 하 고 8 시 다음 날, 21 일 이상, 하루 14 h의 총에 끝납니다. 방해 요소를 방지 하려면 동일한 사람이 동일한 실험실 외 투를 입고 있는 동안 전체 실험을 수행 하는 데 필요한입니다. 10 Wistar 쥐 실험에 사용 됩니다.

1. 평평한 표면, 예를 들면, 바닥에 탱크를 배치 합니다. 다음 따뜻한 (25 ± 3 ° C) 물, 플랫 플랫폼 아래 약 1 ㎝의 약 7 cm로 탱크를 채우십시오.
2. 1 일에 대 한 탱크에 있는 모든 쥐에 대 한 충분 한 음식과 음료를 준비 합니다. 사료와 물을 음식 상자에 넣고 덮개에 걸어.
   참고: 일부 스마트 쥐 음식 상자에 배워야 했다. 만약 그렇다면, 탱크에 다시 그들을 드라이브.
3. 감 금 소에서 모델 그룹 쥐를가지고, 그들을 잡아, 꼬리 그리고 탱크에 부드럽게 넣어. 그들의 공포 물의 동기를 플랫폼 대신 물에 모든 쥐를 시작 합니다. 모든 쥐 쥐 제어 그룹의 충분 한 음식과 물을 함께 원래 그들의 감 금 소에 체류 하는 동안에, 서 서 플랫폼을 얻을 다는 것을 확인 하십시오.
4. 탱크 커버. 실수로 부상을 피하기 위해 쥐를 모니터링 합니다. 쥐 플랫폼에 등반 하지 않고 1 시간 이상 물에 유지, 탱크에서 그것을 선택 하 고 테스트에서 그것을 제거.
5. 14 h, 후 모델 쥐 탱크 중 고 건조 기를 가진 그들의 머리를 건조. 그것은 퇴색 하는 경우 쥐의 꼬리를 다시 표시 합니다. 그들의 원래 감 금 소에는 쥐를 반환 하 고 충분 한 음식과 물을 함께 그들을 제공.
6. 탱크의 구석구석을 플러시. 탱크의 한쪽을 상승 하 고는 하 수를 유출 하는 수도 꼭지를 엽니다.
7. 75% 에탄올 스프레이 탱크를 소독 하 고 UV 빛에 노출.

3. 모델: 행동 테스트

참고: 모든 테스트 행동 실험실에서 수행 됩니다. 잡음과 여분의 빛 허용 되지 않습니다 테스트 하는 동안 방해를 피하기 위해. 가능 하면 같은 사람을 사용 하 여 각 테스트를 실시. 어두운 코트와 장갑은 그레이 스케일 이미지 처리에 인식 필요 합니다. 자주 수행 먼저 쥐 행동에 최소 영향.

1. 자주
   1. 워크스테이션에 올바르게 연결 되어 있고 상자의 모든 코너 커버 확인을 열기 필드 상자에 레코더를 확인 합니다. 상자에서 그림자를 제거 하기 위해 조명을 조정 합니다.
   2. 그들의 원래 장에 행동 실험실에 쥐를 이동 합니다. 그들이 테스트를 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 적응 수 있습니다.
   3. 깨끗 하 고 아무 배설물 또는 냄새 이전 실험에서 왼쪽을 75% 에탄올과 상자를 청소.
   4. 그 뒤로 여 케이지에서 쥐를 제거 하 고 부드럽게 상자의 중앙 영역에 그것을 넣어. 신속 하 게 차단 주사를 하지 상자에서 무기를 후퇴.
   5. 쥐의 숫자를 입력 하 고 녹음을 시작 합니다. 계산 하 고 양육 하 고 등반을 포함 하 여 쥐의 수직 활동의 주파수를 기록 합니다.
   6. 5 분 후 녹음을 중지 하 고 상자에 쥐를 데리고 감 금 소에 그것을 반환 합니다.
   7. 단계 3.1.3-3.1.6 모든 쥐 테스트 완료 될 때까지 반복 합니다.
2. EPM
   1. 자주 (단계 3.1.1 ~ 3.1.2)를 사전 확인 하 고 새 환경 순응 단계를 수행 합니다.
   2. 그것의 뒤에 의해 감 금에서 쥐를 제거 하 고 부드럽게 두 팔의 접합 부분에 그것을 넣어. 왼쪽된 오픈 팔 쪽으로 쥐 고 신속 하 게 두고 총을 차단할 수 없습니다.
   3. 쥐의 숫자를 입력 하 고 녹음을 시작 합니다. 계산 하 고 다른 팔 입구의 주파수를 기록 합니다. 쥐 테스트에 미로에서 떨어지면, 그것을 데리 고 미로 다시 보낼. 데이터 분석에 대 한 자세한 정보를 기록 합니다.
   4. 5 분 후 녹음을 중지 하 고, 쥐를가지고 한 감 금 소를 반환 합니다.
   5. 배설물을 제거 하 고 75% 에탄올 전 쥐의 냄새를 제거 하는 미로 닦아냅니다.
   6. 단계 3.2.2-3.2.5 모든 쥐 테스트 완료 될 때까지 반복 합니다.
3. ES 시험
   1. 80 cm (25 ± 3 ° C) 따뜻한 물로 수영 탱크 (70 × 30 × 110 c m³)를 채우십시오.
      참고: 경우 탱크에는 온도, 물 온도 설정 되어야 합니다 약 37 ° C, 쥐의 체온에 비슷합니다. 그렇지 않으면, 그것을 일정 하 게 유지 하는 실내 온도에 그것을 설정 합니다.
   2. 핀 각 쥐 움 큼에 대 한 부하를 만들고 그것의 꼬리에 그것을 부드럽게 넥타이. 부하 쥐의 체중의 10% 무게.
   3. 꼬리는 쥐를 잡아 고 수영 탱크에 그것을 던져. 쥐 모이 또는 벽에 집착 하는 경우 떨어져 그들을 설정 하 고 다시 물으로 그들을 드라이브.
   4. 타이밍을 시작 쥐 중지 타이밍 모두 소진 되 면 물에 넣으면 순간에는 입과 코 이상 10 물 아래와 물 투쟁 실패로 설명 된다 s.
      참고: 때때로, 피로 익사 발생 갑자기. 기록 하 고 동시에 동물을 저장할 충분 한 경험을가지고 해야 합니다.
   5. 다른 사람을 방해 하지 않고 물 소진된 쥐를 제거 합니다. 그들의 머리를 건조 하 고 다시 그들의 숫자를 표시 한 케이지로 다시 보내.
   6. 한 그룹 완료 후 탱크에 물의 변경 합니다. 모든 쥐, 완료 후 수영 탱크, 빈 하 고 깨끗 하 고 에탄올 및 자외선 소독.

4. 모델 평가: 중앙 신경 전달 물질 검출

1. 그것은 의식이 될 때까지 10 %chloral 하이드 레이트 (3 mL/kg)의 복 막 내 주입으로 쥐를 anesthetize.
2. 쥐 목을 벨.
3. -중간 라인을 따라 절 개를 경도, 양쪽 모두에 두개골을 열고 고 뇌를 노출 시킵니다. 두개골을 넘겨, 두뇌, 제거 하 고 얼음 가방에 두뇌를 넣어.
4. 하 고 주변 조직으로 명확한 경계는 두뇌의 중앙 부분에 다이아몬드 모양 지역 이다 시상 하 부를 제거 합니다. 무 균 튜브에 그것을 배치 하 고 액체 질소 동결. -80 ° C 냉장고에서 모든 샘플을 저장 합니다.
5. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)⁸를 사용 하 여 시상 하 부에 다와 5-HT의 콘텐츠를 검색.

결과

우리는 MMPM를 사용 하 여 중앙 피로의 쥐 모델을 설명 합니다. 24 Wistar 쥐 임의로 제어 그룹 및 각 그룹에 12 쥐 모델 그룹으로 나누어집니다. 모델 장치는 물 탱크 하단 (그림 1)에 좁은 플랫폼으로 설계 되었습니다. 모델 쥐 21 일 (그림 2)에 대 한 부분적인 수 면 시간을 포함 하 여 하루 14 h에 대 한 플랫폼에 서 서.

토론

MMPM 원래 수 면 박탈⁹에 대 한 설계 되었습니다. 쥐 플랫폼 바닥에 고정 물 탱크에 착수 한다. 물의 본능적 인 두려움에 의해 구동, 쥐 플랫폼에 서 서 유지 하 고 아니 수 면 발생 합니다. 연구는 수 면 부족의 다른 시간 쥐 행동 및 인식 장애¹⁰, 부정적인 감정을¹¹및 중앙 피로 포함 하 여, 분위기에 다양 한 변화를 이끌어 보여줍니다. 일부 연구 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.