Trombosis venosa profunda inducida por estasis en los ratones controlados por sonografía de alta frecuencia

Resumen

El presente Protocolo describe los pasos para obtener mediante un modelo de estancamiento de la trombosis venosa. Además, estamos utilizando un método no invasivo para medir la formación de trombos y resolución con el tiempo.

Resumen

La trombosis venosa es una condición común que afecta a 1-2% de la población, con una incidencia anual de 1 en 500. La trombosis venosa puede conducir a la muerte por embolia pulmonar o resultados en el síndrome post-trombótico, caracterizada por la ulceración, inflamación y dolor crónico de la pierna, o en la hipertensión pulmonar crónica dando por resultado significativa crónica respiratoria compromiso. Esto es la enfermedad cardiovascular más común después de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular isquémico y es un desafío clínico para todas las disciplinas médicas, como puede complicar el curso de otros trastornos como cáncer, enfermedad sistémica, cirugía y trauma mayor.

Modelos experimentales son necesarios para el estudio de estos mecanismos. El modelo de estasis induce tamaño del trombo consistente y una cantidad cuantificable de trombo. Sin embargo, es necesario ligar sistemáticamente ramas laterales de la vena cava inferior para evitar la variabilidad en el tamaño del trombo y cualquier interpretación de datos erróneos. Hemos desarrollado una técnica no invasiva para medir el tamaño del trombo utilizando ecografía. Usando esta técnica, podemos evaluar desarrollo de trombos y resolución con el tiempo en el mismo animal. Este enfoque limita el número de ratones que se requiere para la cuantificación de la trombosis venosa consistente con el principio de sustitución, reducción y refinamiento de los animales en la investigación. Hemos demostrado que peso del trombo y el análisis histológico de trombo tamaño correlativo con la medida obtienen con la ecografía. Por lo tanto, el estudio actual describe cómo inducir trombosis venosa profunda en ratones utilizando el modelo de estasis de la vena cava inferior y seguimiento con ultrasonido de alta frecuencia.

Introducción

Tromboembolismo venoso (TEV), que se compone de trombosis venosa profunda (TVP) y embolia pulmonar, es la tercera causa de muerte cardiovascular después de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Es una condición común que afecta a 1-2% de la población, con una incidencia anual de¹de 1 en 500. VTE puede conducir a: 1) la muerte por embolia pulmonar; 2) postrombótico síndrome, caracterizado por dolor crónico, inflamación y ulceración; o 3) hipertensión pulmonar crónica dando por resultado significativo compromiso respiratorio crónico. TEV es una enfermedad multifactorial y puede resultar de estasis sanguíneo, daño a las paredes del vaso, o los Estados hypercoagulable debido a una interrupción del equilibrio entre la coagulación y los sistemas fibrinolíticos, como se ha descrito hace más de cien años por Virchow y se conoce como tríada de Virchow.

Porque en la mayoría de los casos es imposible obtener muestras humanas de la trombosis venosa profunda, los investigadores han desarrollado modelos animales experimentales de trombosis venosa profunda. Se han utilizado varios animales incluyendo rata², ratón³, conejo⁴, cerdo⁵, perro⁶y⁷ de primates no humanos. Ratones genéticamente modificables y son los animales más utilizados para el estudio de trombosis venosa profunda. Sin embargo, como en todos los animales, no se observó TVP espontánea en ratones. Por lo tanto, alteraciones físicas o químicas de la pared de la vena se utilizan para crear trombosis en ratones. Previamente hemos utilizado el modelo de cloruro férrico para inducir trombosis en la vena cava inferior (IVC) de ratones^8,9,10. Este modelo tiene la ventaja de producir confiablemente trombos oclusivos en minutos y se puede utilizar para investigar el papel de los medicamentos anticoagulantes y antiplaquetarios en TVP aguda. Sin embargo, es un procedimiento terminal. Así, para estudiar la TVP aguda y crónica, es más conveniente el modelo de estasis. En este modelo, la formación del trombo es inducida por la interrupción completa del flujo sanguíneo en la vena cava inferior, uno de los factores de la tríada de Virchow para el desarrollo de trombosis venosa profunda. Este modelo puede utilizarse para estudiar la formación de trombosis venosa profunda y resolución, la cual es una ventaja en comparación con las FECLAS₃ modelo¹¹.

Hemos desarrollado un método no invasivo para seguir la formación de trombos y la resolución en el tiempo con un sistema de micro-proyección de imagen de ultrasonido de alta frecuencia¹². Previamente hemos demostrado que medición de la trombosis venosa por ultrasonido se correlaciona favorablemente con trombos obtenidos patológico. En dos estudios posteriores hemos comprobado que las medidas obtenidas con ultrasonido se correlacionan con el peso del trombo y trombo área cuantificada por histoquímica^9,10. Más importante aún, hemos demostramos que ultrasonido de alta frecuencia puede utilizarse para supervisar la formación de trombosis venosa profunda en ratones¹². También puede utilizarse para cuantificar la resolución del trombo en forma no invasiva.

Aquí, describimos el protocolo que permite la formación del trombo utilizando el modelo de ratón de trombosis inducida por estasis y como formación de trombos puede ser supervisada no invasiva sobre tiempo utilizando ultrasonido de alta frecuencia.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el institucional Animal cuidado Comité de McGill University Montreal, QC, Canadá. Todo el equipo requerido se muestra en tabla I.

1. murino (C57BL/6J) IVC estasis protocolo

1. Preparación de la cirugía
   Nota: Esta es una cirugía de supervivencia y por lo tanto, la técnica aséptica apropiada debe seguirse en todo momento. Esto incluye asegurándose de que todos los materiales están a mano, limpieza y esterilización instrumentos antes y entre uso y designar una zona estéril en la superficie de trabajo para todo el material estéril.
   1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y materiales en autoclave. Un esterilizador de bolas de vidrio es suficiente para esterilizar puntas de instrumento entre los animales, si más de un procedimiento se está haciendo a la vez.
   2. Anestesiar ratones machos de C57Bl/6 de 8-10 semanas de edad con una mezcla de 100% oxígeno y 2.5% de isoflurano.
      Nota: Ajuste el flujo de oxígeno y el isoflurane según sea necesario.
   3. Confirmar anestesia pellizcando la pata trasera del animal entre los dedos con pinzas. Ninguna respuesta de la presión indica que el animal está anestesiado.
   4. Administrar el analgésico de liberación lenta (buprenorfina) mediante inyección subcutánea. A ratones una dosis de 1 mg de analgésico por 1 kg de peso corporal (1 mg/kg).
   5. Colocar ungüento oftálmico en ambos ojos del animal para no desecación corneal durante la duración del procedimiento.
   6. Administrar por vía subcutánea 0.2 - 0.5 mL de líquido isotónico por 10 g de peso corporal.
   7. Fijar el animal a la mesa de cirugía con cinta quirúrgica. Coloque el animal en posición decúbito dorsal para exponer el abdomen. Realizar cirugía en un cojín de calefacción para prevenir la hipotermia.
   8. Eliminar el vello del abdomen del ratón mediante la aplicación de una depilación crema 1-2 minutos Limpie la zona abdominal limpiar con una gasa y agua destilada, si es necesario.
   9. Como alternativa, eliminar el vello del abdomen por afeitarse con una afeitadora eléctrica pequeña.
   10. Esterilizar el abdomen con Baxedin (gluconato de clorhexidina en solución de BP) antes de hacer incisiones. Aplicar etanol ligeramente con una gasa para evitar la pérdida de calor causada por la evaporación del alcohol.
2. Exposición de la Vena Cava Inferior (IVC)
   1. El uso de tijeras quirúrgicas, realizar una laparotomía para abrir la cavidad abdominal.
      1. Levante la piel con pinzas en la parte inferior del abdomen y haga una incisión vertical paralela a ambos lados de la linea alba. Hacer la primera incisión a la izquierda o derecha de la linea alba, dependiendo del uso de las manos del operador. La incisión de la línea media para asistir en imágenes por ultrasonido.
      2. Hacer una incisión horizontal, segundo en la parte superior del abdomen.
         Nota: A la penetración en el abdomen, la musculatura debe ser "tented" y luego penetró con tijeras quirúrgicas para prevenir cualquier daño a los órganos abdominales.
      3. Repita las incisiones verticales y horizontales en la capa de músculo abdominal del animal. Asegúrese de la musculatura durante la penetración en el abdomen para no dañar los órganos debajo de la tienda.
         PRECAUCIÓN: Levantar piel y músculo de los intestinos y otros órganos internos al hacer incisiones para que no se les pinchaduras.
   2. Pliegue de la piel y el músculo de la incisión para exponer la cavidad abdominal.
   3. Aplique una gasa, humedecida con una solución isotónica, a los lados de la abertura de la herida y extraer los intestinos. Aplique presión en ambos lados del abdomen para ayudar a la externalización de los intestinos. Use movimientos suaves con un aplicador de punta de algodón para mover los intestinos. Empapar una gasa en solución isotónica y coloque sobre los intestinos externalizados.
      1. Gasas se deben humedecer previamente antes de la colocación en el tejido.
   4. Mover a un lado cualquier grasa peritoneal y exponer la vena cava inferior entre las venas ilíacas y renales.
   5. Hacer una identificación inicial de ramas laterales evidentes. Un rama lateral aparecerán como más pequeño, pero las venas vena importante que ramas de la vena cava inferior, entre la renal y la ilíaca. Vasculatura puede variar grandemente entre ratones. Ratones pueden tener ramas laterales presentes en uno o ambos lados de la vena cava inferior.
3. Ligadura de ramas laterales
   Nota: Si existen ramas laterales, se sigue el procedimiento siguiente para cada uno. Si no está presente, vaya al paso 4: colocación de sutura inicial debajo de la vena cava inferior. El sitio de la ligadura de la vena cava inferior será inmediatamente distal a la vena renal izquierda, independientemente de la presencia de ramas laterales.
   1. Realizar disección Roma a cada lado de la rama lateral. Disección Roma es el proceso de apertura repetidamente fórceps romos con una ligera presión, con el fin de romper la fascia sin dañar vasos circundantes.
      PRECAUCIÓN: Evitar pinchar o dañar la vena.
   2. Levante la rama y pasar de una sección de la sutura de seda 6-0 por debajo de la vena. Siempre tenga cuidado al levantar o mover los recipientes. Es mejor agarrar la grasa alrededor de los vasos, de lo contrario se corre el riesgo de dañar la nave.
   3. Usando pinzas de sutura, hacer una ligadura quirúrgica alrededor de la rama lateral utilizando nudo quirúrgico estándar atar técnica. Ligadura completa se hace para asegurar 100% de oclusión de la vena. Utilizar al menos tres tiros que para asegurar que la ligadura es segura.
   4. Repita el paso 1.3 para las restantes sucursales de lado.
4. Disección de la aorta abdominal de la vena cava inferior
   1. Realizar disección Roma alrededor de la vena cava inferior inmediatamente distal de la vena renal izquierda. La aorta abdominal se une a la vena cava inferior a través de la fascia, por lo tanto realizar disección Roma inicial alrededor de la vena cava inferior y aorta abdominal.
      PRECAUCIÓN: Evitar pinchar o dañar la vena. No romper o pinchar cualquiera de los dos vasos. Esta es la parte más crítica del procedimiento, con el mayor riesgo de daño a los vasos.
   2. Continúe aplicando presión suave mediante disección Roma hasta una ventana clara entre la aorta y vena cava inferior.
5. Colocación de sutura y ligadura de la vena cava inferior
   1. Pasar de una sección de la sutura de seda 6-0 por debajo de la vena cava inferior y aorta abdominal.
   2. Localice la sutura a través de la ventana creada entre la vena cava inferior y la aorta. Utilice pinzas para tirar de la sutura y el hilo entre la aorta abdominal y vena cava inferior. Pase la sutura a través de cuidadosamente, tratando de no tirar o perforar la vena cava inferior y aorta abdominal.
   3. Hacer una ligadura quirúrgica alrededor de la vena cava inferior con la pinza de sutura, asegurando una total obstrucción de la vena. Otra vez, hacer la ligadura inmediatamente distal de la vena renal izquierda.
   4. Hacer tres tiros de sutura para asegurar la ligadura.
      Nota: También es posible pasar la sutura por debajo de la vena cava inferior y la aorta antes de la separación de los dos como una opción alternativa. Alternativamente, pueden utilizarse las suturas de Prolene 7-0 para ligadura de las ramas laterales y la vena cava inferior.
6. Encierro de la herida y cuidados posoperatorios
   1. Verificar que la aorta abdominal se ha quedado sin interrupciones y que todas las ramas laterales han sido ligadas. La vena cava inferior aparecerá dilatada distal desde el sitio de la ligadura y no sangre flujo será visible.
   2. Vuelva a colocar toda la grasa peritoneal y los intestinos en la cavidad abdominal.
   3. Cerrar la herida con pinzas de sutura y sutura de seda 6-0. Utilice una sutura corriente (simple continuo) y asegúrese de que la sutura no será demasiado apretada. Una sutura apretada se rompen cuando el animal se despierta y se mueve alrededor de su jaula.
      1. Alternativamente, use clips de PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon o acero inoxidable para el cierre de la herida.
   4. La capa de músculo abdominal primero usando sutura adecuada vinculación técnica de la sutura.
   5. Repita la técnica de sutura de la piel y verificar el cierre de la herida es suficiente.
      Nota: Si utiliza la misma aguja de sutura e hilo para varios animales, esterilizar tanto en etanol al 70% antes de cada uso.
   6. Quitar el animal de gas anestésico y colocarlos en una incubadora de 34 ° C durante al menos 30 minutos.
   7. Otra vez, administrar 0.2 - 0.5 mL de líquido isotónico por 10 g de peso corporal por vía subcutánea. Fluidos pueden administrarse en días posteriores para mantener el peso corporal preoperatoria, si es necesario.
   8. Seguimiento del animal hasta la recuperación para garantizar la exitosa cirugía y evaluar la salud general del animal.
      PRECAUCIÓN: Esperan una leve postura jorobada de un procedimiento invasivo como este, pero el animal se comportará normalmente tan pronto como 30 minutos después.
   9. Coloque el animal en su jaula y no lo coloque con otros animales hasta que se recuperó completamente.
   10. Volver a administrar analgésico diario para hasta 48 h postoperatoria.
   11. Coloque los alimentos sobre el piso de la jaula para los animal mientras que en la recuperación. Otro cuidado especial generalmente no es necesaria.
   12. Examinar el sitio de la herida para enrojecimiento, hinchazón, o descarga y cualquier otro signo de infección.
   13. Si es necesario, retire las suturas después de 7-10 días.
   14. Realizar la eutanasia inmediatamente si la cirugía no tiene éxito (por ejemplo, vasos importantes daños y/o sangre pérdida) o animal no mejora con los cuidados postoperatorios. Eutanasia se realiza generalmente en el posoperatorio de 48 h. Para más experimentos, utilizar Prolene 7-0 para ligar las ramas laterales y la vena cava inferior y las suturas de Vicryl 5-0 para cerrar la cavidad abdominal.
       1. Realizar eutanasia por anestesia del animal en una inducción como se describió anteriormente, excepto en el 5% de isoflurano. Esto es seguido por asfixia con 100% CO₂ y anestesiados.
       2. Después de la confirmación de la eutanasia por asfixia (pérdida de latidos del corazón y sin respiración), realizar la dislocación cervical para asegurar completo eutanasia.

2. Protocolo de ecografía de alta frecuencia de

Nota: Este protocolo es adaptado de la señora Davis Instituto roedor Phenotyping núcleo SOP para la proyección de imagen de ultrasonido de alta frecuencia. Este protocolo se lleva a cabo en el post-operatorio 24 h, pero se puede hacer antes siempre y cuando el animal está respondiendo bien a la cirugía. El protocolo se puede realizar en cualquier momento en ratones sanos y a menudo es hecho para comparar antes y después de la cirugía.

1. Preparación del Animal
   1. Coloque el animal en una cámara de inducción y anestesiar el animal con una mezcla de 100% oxígeno y 2.5% de isoflurano.
   2. Encienda de pulso y monitor de temperatura. Lámpara de calor de posición sobre la tabla para mantener el animal caliente durante el procedimiento.
   3. Retire el animal de la cámara de inducción y aplicar lubricante ocular para evitar la desecación corneal. Coloque el animal en la plataforma de análisis y fije el tubo anestésico a boca/nariz del animal.
   4. Ultrasonido caliente gel a 37 ° C y coloque el gel en el abdomen del animal. El gel de ultrasonido se calienta mediante un sistema de calentamiento de agua que bombas de agua a través de bobinas que se envuelven alrededor de la botella de gel caliente.
   5. Para la medición de la frecuencia cardíaca (si es necesario), poner gel de electrodo en los 4 electrodos de la plataforma de análisis y fijar las patas del animal a los electrodos de plataforma con cinta quirúrgica. Coloque el animal en una posición supina para la proyección de imagen de la vena cava inferior. El ultrasonido sistema de imagen incluye una plataforma de análisis que es calentada y contiene electrodos para monitoreo de los animales.
   6. Para mediciones de temperatura, poner gel de electrodo termómetro e inserte en el recto del animal.
   7. Ajustar la lámpara de calor y el isoflurano como sea necesario para asegurarse de que animal es cómodo, tiene una respiración entre 30-70 bpm y se mantiene a 37 ° C.
   8. Si es necesario, afeitar el abdomen del animal o eliminar el vello con crema depilatoria. Aplique de 1 a 2 minutos y limpie con una gasa y agua destilada.
      Nota: Demasiado pelo puede afectar la calidad de las imágenes.
   9. Colocar gasa debajo o al lado del animal para atrapar cualquier gel de ultrasonido exceso.
2. Proyección de imagen del IVC y trombo
   1. Abra el software de proyección de imagen y comenzar un nuevo estudio.
   2. Seleccione un scanhead apropiado para la proyección de imagen. Scanhead usada aquí es de órganos abdominales (frecuencia: 35 MHz, distancia focal: 12,8 mm).
   3. Registrar cualquier información relevante sobre el animal. Esto puede incluir animales ID, sexo, peso, fecha de nacimiento, cepa, etcetera.
   4. Baje el scanhead hasta que esté en contacto con el gel de ultrasonido en el animal.
   5. Comience el sondeo scanhead para comenzar 2-D la proyección de imagen del animal. En este modo, las imágenes se presentan como dos dimensiones, en diferentes tonos de gris.
   6. Localizar la vena cava inferior y aorta abdominal moviendo la plataforma de ratón a lo largo de x - y plano y, mientras se mueve también el scanhead a través del plano z.
      Nota: Sangre vasos aparecerán con el blanco de sus paredes y la sangre dentro casi negro. La aorta abdominal se pulsan intensamente y tienen paredes más gruesas, mientras que la vena cava inferior se tienen paredes más delgadas y comprimir/expandir fácilmente por la imagen de la pantalla cuando la scanhead se mueve hacia arriba y hacia abajo. El sitio de ligadura será aparente, ya que la vena se dilata la pared de la vena se llegado a un punto. Cualquier trombo que se forma en el interior será sólido en proyección de imagen de ultrasonido y no se comprime fácilmente como lo hace la pared de la vena. La vena se comprimirá sólo por encima de la ligadura, donde no hay trombo se forma.
   7. Al localizar la vena cava inferior y el sitio de la ligadura, en el centro en el punto focal de la ecografía, con el fin de conseguir la imagen más precisa.
      1. Si la imagen es demasiado oscura para ver con claridad, ajustar el gel y eliminar las posibles burbujas de aire con un aplicador de punta de algodón.
      2. Si es necesario, inclinar el scanhead 45° hacia la izquierda o derecha y reajustar la plataforma animal para ver claramente la vena. Esto se hace si hay interferencia con la scanhead. En este escenario, la vena debe ser reflejada en un ángulo de lado para evitar que la sutura.
         Nota: Imagen interferencia es causada a menudo por manchas oscuras de la piel en el animal, colocación de sutura herida pobre o burbujas en el gel de ultrasonido.
   8. Uso del software, tomar fotos de cualquier estructura deseada y realizar mediciones utilizando las herramientas de medición. Las medidas comunes incluyen área de sección transversal del trombo o la anchura del sitio de la ligadura.
   9. Cambiar el modo de proyección de imagen de Doppler de la onda de pulso para realizar mediciones de flujo de sangre. Este modo permite la proyección de imagen del flujo sanguíneo vascular y la medición de la velocidad de flujo, entre otras variables.
   10. Inclinación de la plataforma de análisis para bajar el extremo posterior del animal.
   11. Cambiar de posición y ángulo de la scanhead por lo que pondrá en contacto con el gel en un ángulo de 30° desde el extremo posterior del animal.
   12. Vuelva a colocar la plataforma animal y scanhead. Reubicar el IVC y la ligadura, si es necesario.
   13. Hacer mediciones del flujo de sangre alrededor del sitio de la ligadura para confirmar estasis y tomar cualquier imagen deseada. Las medidas comunes del flujo de sangre incluyen velocidad media, velocidad pico o velocidad media.
   14. Excepto cualquier medidas o imágenes tomadas.
3. Recuperación de animales y de limpiar
   1. Levante el scanhead para inicial la posición y la posición de plataforma animal a su posición inicial, así.
   2. Retirar el gel sobrante fuera del animal con una gasa. Hacerlo suavemente para que la sutura de la herida no se rompió.
   3. Retirar el termómetro recto del animal y tomar el animal fuera de la plataforma.
   4. Coloque el animal en su jaula y una incubadora de 34 ° C.
   5. Seguimiento del animal hasta la recuperación. El procedimiento es muy menor y no invasivo. El animal se despertará rápidamente. Continuar la vigilancia animal en los siguientes días conforme al artículo 1.6 de este protocolo.
   6. Limpiar la plataforma animal con gasa y desinfectante.
   7. El scanhead Limpie con gasa y agua destilada.
      PRECAUCIÓN: Limpiar el scanhead muy suavemente y sólo con agua destilada.
   8. Repita el paso 2 para el próximo animal.
      1. Si se hace con todos los temas, verificar que todas las imágenes y grabaciones se han salvado. Luego apague todos los equipos y software.

Resultados

Modelo de la trombosis venosa por estasis

En el modelo de estasis, ratones están anestesiados, y se hace una incisión para exponer la vena cava inferior (IVC). La incisión se realiza en el lado izquierdo o derecho del ratón en lugar de una laparotomía media de manera que no interfiera con la sonda de ultrasonido. Los músculos abdominales y la piel son doblez hacia atrás para exponer la vena cava inferior ...

Discusión

Hay varios pasos fundamentales para la formación del trombo venoso exitosa utilizando el modelo de estasis. Inducción de trombosis de la vena es más difícil en los ratones viejos debido a la acumulación de grasa alrededor de la vena cava inferior y la aorta. Idealmente, los ratones sometidos a este procedimiento deben ser 8 - 10 semanas de edad. Debe tenerse gran cuidado no para inducir daño endotelial en la vena cava inferior durante la disección Roma y ligadura. Además, es crucial para mantener el animal en una...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 perma-hand silk suture	Ethicon	706G
Surgical Scissors	Fine Science Tools	20830-00
Suture tying forceps	Fine Science Tools	20830-00
blunt forceps (straight and curved)	Fine Science Tools	20830-00
Needle Driver	Fine Science Tools	13002-10
Moria Spring Scissors	Fine Science Tools	15396-00
1ml syringes	BD Biosciences
26G needles	Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System	Visualsonics	No longer sold
SR Buprenorphine	ZooPharm		Given to LDI by Vet
Surgery Microscope	Leica	Leica M651
Systan eye oinment	Alcon	288/28062-0
2x2 sterile Gauze	CDMV	#104148
Cotton Tip Applicators			from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape	CDMV	#7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100)	Dufort & Lavigne	#AKEN4061
Incubator			From JGH
Isoflurane	Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment	Dispomed
Hair remover	Nair
Water heated hard pad	Braintree Scientific, Inc.	#HHP-2
Gaymar heater water pump TP500	MATVET Inc.	#R-500305
Infra-red heating lamp	electrimat inc.	#1R175R-PAR
Mouse rectal temperature prope	emkaTECHNOLOGIES
Sterile water			From JGH