Тромбоз глубоких вен, индуцированных застой в мышей, под контролем УЗИ высокой частоты

Резюме

Настоящий Протокол описывает шаги для получения венозного тромбоза с использованием модели застой. Кроме того мы используем неинвазивный метод измерения тромбообразованию и резолюции с течением времени.

Аннотация

Тромбоз является общим условием, влияющих на 1-2% населения, Ежегодная заболеваемость 1 в 500. Тромбоз вен может привести к смерти через легочную эмболию или результаты в постсоветском тромботических синдром, характеризуется хроническим ногу боль, отек и изъязвления, или хронической легочной гипертензии, что приводит к значительным хронических респираторных компромисс. Это наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний после инфаркта миокарда и ишемического инсульта и клинической проблемой для всех медицинских дисциплин, как это может осложнить ход других расстройств, таких как рак, системные заболевания, хирургии и основные травмы.

Экспериментальные модели необходимы для изучения этих механизмов. Стасис модель индуцирует последовательной тромб размер и количественной количество тромбов. Однако необходимо систематически перевязать боковые ветви нижней полой вены, чтобы избежать изменчивость тромб размеров и любой интерпретации ошибочных данных. Мы разработали неинвазивный способ измерить размер тромба, с помощью УЗИ. Используя эту технику, мы можем оценить развитие тромба и резолюции со временем в то же самое животное. Данный подход ограничивает количество мышей, необходимых для количественной оценки венозного тромбоза в соответствии с принципом замещения, сокращение и уточнение животных в научных исследованиях. Мы продемонстрировали, что вес тромбов и гистологический анализ тромб размер коррелируют с измерением полученных с УЗИ. Таким образом нынешнее исследование описывает способы побудить тромбоз глубоких вен у мышей с использованием модели нижней полой вены стаза и контролировать его с помощью высокой частоты ультразвука.

Введение

Венозной тромбоэмболии (ВТЭ), который состоит из тромбоз глубоких вен (ТГВ) и эмболии легочной артерии, является третьей по значимости причиной сердечно-сосудистой смертности после инфаркта миокарда и инсульта. Это является общим условием, влияющих на 1-2% населения, Ежегодная заболеваемость 1 в 500¹. ВТЭ может привести к: 1) смерть через легочную эмболию; 2) после тромботических синдром, характеризуется хронической нога боли, отек и язв; или 3) хронической легочной гипертензии, что приводит к значительным хронических респираторных компромисса. ВТЭ является многофакторных заболеваний и может быть результатом застоя кровотока, повреждения сосудистой стенки, и/или гиперкоагуляции государств из-за нарушения баланса между коагуляции и фибринолитической системы, как это было описано более ста лет назад по Вирхов и известен как Вирхов триады.

Потому что в большинстве случаев это невозможно получить образцы человеческого ТГВ, исследователи разработали экспериментальных животных моделей ТГВ. Были использованы несколько животных, включая²крысы, мыши³, кролик⁴, свинья⁵, собака⁶и нечеловеческих приматов⁷ . Мышь может быть генетически модифицированные и являются наиболее часто используемых животных для изучения ТГВ. Однако как и все животные, спонтанное тромбоза глубоких вен не наблюдается у мышей. Таким образом физические или химические изменения стенки вен используются для создания тромбоза у мышей. Ранее мы использовали модель хлорного побудить тромбоза в нижней полой вены (IVC) мышах^8,9,10. Эта модель имеет преимущество надежно производить окклюзионной тромбов в течение нескольких минут и может использоваться для изучения роли анти коагулянта и анти-тромбоцитарный лекарств во время острого тромбоза глубоких вен. Однако это процедура, терминал. Таким образом изучение острых и хронических ТГВ, застой модель является более подходящим. В этой модели образование тромбов индуцируется полного прерывания потока крови в МКВ, одним из факторов в триады Вирхов для развития тромбоза глубоких вен. Эта модель может использоваться для изучения формирования ТГВ и резолюции, что является преимуществом по сравнению с FeCl₃ модель¹¹.

Мы разработали неинвазивный метод следовать образование тромбов и резолюции течением времени с помощью системы микро изображений высокой частоты ультразвука¹². Ранее мы показали, что измерение венозного тромбоза ультразвуковым положительно коррелирует с тромбов, полученные патологически. В двух последующих исследованиях мы подтвердили, что измерения, полученные с УЗИ коррелируют с весом тромбов и тромбов области количественной гистохимии^9,10. Что еще более важно мы показали, что ультразвук высокой частоты может использоваться для мониторинга формирования тромбоз глубоких вен в мышей¹². Он также может использоваться для количественного определения тромб резолюции неинвазивным способом.

Здесь мы будем описывать протокол, позволяющий тромбообразованию, используя модель мыши стазис индуцированной тромбоза и как образование тромбов могут контролироваться неинвазивно со временем с помощью высокой частоты ультразвука.

протокол

Все процедуры были одобрены институциональные животное уход Комитета МакГилл Университет Монреаля, QC, Канада. Все оборудование, необходимое, перечисленных в таблице I.

1. мышиным (C57BL/6J) IVC Stasis протокол

1. Подготовка хирургии
   Примечание: Это выживание хирургии и таким образом, правильная техника асептических необходимо следовать во все времена. Это включает в себя убедившись, что все материалы находятся под рукой, очистки и стерилизации инструментов до и между использованием и назначение стерильные площади на рабочей поверхности для всех стерильного материала.
   1. Стерилизуйте хирургические инструменты и материалы в автоклаве. Стеклянный шарик стерилизатор достаточно, чтобы стерилизовать советы инструмент между животными, если более чем одна процедура делается в одно время.
   2. Анестезировать 8-10 недельных самцов мышей C57Bl/6 со смесью 100% кислорода и 2,5% изофлюрановая.
      Примечание: Отрегулируйте поток кислорода и изофлюрановая при необходимости.
   3. Подтвердите анестезии, щипать задние лапы животного между пальцами с щипцами. Нет ответа от пинча указывает, что животное находится под наркозом.
   4. Управлять медленно релиз обезболивающее (бупренорфин) через подкожные инъекции. Дать мышей в дозе 1 мг обезболивающее на 1 кг веса тела (1 мг/кг).
   5. Место глазную мазь на обоих глазах животного, чтобы обеспечить не роговицы сушка для продолжительности процедуры.
   6. Администрирование в 0,2 - 0,5 мл изотонические жидкости на 10 г веса подкожно.
   7. Исправьте животное на месте в хирургии таблицу с использованием хирургическая лента. Место животного в лежачем положении, чтобы разоблачить живота. Выполните операцию на грелку для предотвращения переохлаждения.
   8. Удаление волос из живота мыши приложением удаления волос Крем для 1-2 мин Wipe брюшной области чистой марлей и дистиллированной воды, при необходимости.
   9. Кроме того удалите волосы из живота после бритья с небольшой электрической бритвой.
   10. Стерилизуйте живота с Baxedin (BP раствора хлоргексидина глюконат) до любого разрезов. Примените этанола слегка марлей, чтобы избежать чрезмерного тепла потери, вызванные испарения спирта.
2. Выдержка из нижней полой вены (IVC)
   1. С помощью Ножницы хирургические, выполните лапаротомия открыть брюшной полости.
      1. Снять кожу с щипцами в нижней части живота и сделать вертикальный разрез параллельно с обеих сторон linea alba. Сделать первый разрез слева или справа от linea alba, в зависимости от handedness оператора. Разрез от средней линии для оказания помощи в ультразвуковых изображений позже.
      2. Сделайте второй, горизонтальный разрез в верхней части живота.
         Примечание: После проникновения в брюшную полость, мускулатура следует «палаточных» и затем вторглись с Ножницы хирургические для предотвращения повреждений органов брюшной полости.
      3. Повторите вертикальных и горизонтальных разрезов на слой мышц брюшной животного. Убедитесь, что палатка мускулатуры во время проникновения в брюшную полость, чтобы не повредить органов под.
         Предупреждение: Поднимите кожи и мышц от кишечника и других внутренних органов при разрезов чтобы не прокалывать их.
   2. Сложите кожи и мышц от разреза подвергать брюшной полости.
   3. Применить марлей, смоченной изотонический раствор, по бокам открытия раны и воплощать кишечника. Приложите давление к обе стороны живота оказать экстернализации кишечника. Используйте нежные движения с аппликатором отзыв хлопок для перемещения кишечника. Смочите марлевые в изотонический раствор и поместите его над externalized кишечника.
      1. Марля, следует предварительно смоченной до размещения на ткани.
   4. Двигаться в сторону любого брюшной жир и разоблачить IVC между почек и подвздошных вен.
   5. Сделайте первоначальный выявление очевидно боковых ветвей. Стороне филиал будет выглядеть как меньше, но значительные вен, что ветви от мкВ, между почек и подвздошных вен. Сосудистую может сильно различаться между мышей. Мышей может иметь боковые ветви настоящее на одной или обеих сторонах мкВ.
3. Лигирование боковых ветвей
   Примечание: Если боковые ветви присутствуют, следующая процедура применяется для каждого из них. Если нет, переходите к шагу 4: первоначальный шовные размещение под мкВ. Перешнуровка сайт IVC будет немедленно дистальнее левой почечной Вены, независимо от наличия боковых ветвей.
   1. Выполняйте тупым рассечение на каждой стороне стороне ветви. Тупой рассечение — это процесс неоднократно открытия тупым щипцы с нежным давлением, чтобы прорваться через фасции без повреждения окружающих судов.
      Осторожностью: Не прокола или повреждение вены.
   2. Поднимите филиала и передать часть 6-0 Шелкового шва под вен. Всегда будьте осторожны при отмене или движущихся судов. Это лучше, чтобы захватить жир вокруг судов, в противном случае существует риск повреждения судна.
   3. Используя пинцет шовный материал, сделайте хирургического лигирования вокруг стороне ветви с помощью стандартных хирургических узел, связывая технику. Полной перевязки делается для обеспечения 100% окклюзии вен. Используйте по крайней мере три связывая броски для обеспечения безопасности перевязки.
   4. Повторите шаг 1.3 для любых оставшихся боковых ветвей.
4. Вскрытие брюшной аорты из МКВ
   1. Выполните тупым рассечение вокруг немедленно дистальной мкВ от левой почечной Вены. Брюшной аорты прилагается к IVC через фасции, поэтому выполнять первоначальные тупым рассечение вокруг МКВ и брюшной аорты.
      Предостережение: Избегайте проколов или повреждение вены. Не разрыв или прокол либо судна. Это наиболее важной частью процедуры, с высоким риском повреждения судна.
   2. Продолжать применять мягкое давление через тупым рассечение, до тех пор, пока между аорты и IVC делается прозрачное окно.
5. Шовный материал размещения и IVC лигирование
   1. Пройти часть 6-0 Шелкового шва под МКВ и брюшной аорты.
   2. Найдите шов через окно, созданное между МКВ и аорты. Используйте пинцет шовный материал и потоков между брюшной аорты и IVC. Нить шов через осторожно, стараясь не тянуть/пункция брюшной аорты и IVC.
   3. Сделайте хирургического лигирования вокруг мкВ с пинцет шовный материал, обеспечение полной окклюзии вен. Опять же сделайте перевязку немедленно дистальной от левой почечной Вены.
   4. Сделайте три шва бросков для обеспечения перевязки.
      Примечание: Это также можно пройти шов под МКВ и аорты до отделения два, как альтернативный вариант. Кроме того 7-0 Пролен швы могут использоваться для перевязки боковых ветвей и мкВ.
6. Закрытие раны и послеоперационный уход
   1. Убедитесь, что брюшной аорты была оставлена непрерывный и что все боковые ветви были лигируют. IVC будет отображаться расширены дистальное лигирование сайта и без крови поток будет видимым.
   2. Поместите все брюшной жир и кишечника обратно в брюшной полости.
   3. Закройте рану, используя пинцет шовный материал и Шелкового шва 6-0. Использовать запуск шовные (простой непрерывный) и убедитесь, что шов не будет слишком туго. Плотный шов будет разрыв, когда животное просыпается и движется вокруг своей клетке.
      1. Кроме того используйте клипы PDS, Ethilon, Викрил, Dexon или из нержавеющей стали для закрытия раны.
   4. Шовные слой мышц живота, сначала с помощью соответствующих шов, связывая технику.
   5. Повторите шовный метод для кожи и проверить закрытие раны является достаточным.
      Примечание: При использовании же шва иглу и нить для нескольких животных, стерилизуйте как в 70% этанол до каждого использования.
   6. Удаление животное из анестезирующий газ и поместите их в инкубаторе 34 ° C для по крайней мере 30 минут.
   7. Опять же подкожно администрировать 0,2 - 0,5 мл изотонические жидкости на 10 г веса тела. Жидкости может предоставляться в следующих дней поддерживать вес предоперационное тела, при необходимости.
   8. Мониторинг животных до восстановления для обеспечения успешной операции и оценить общее состояние здоровья животного.
      Осторожностью: Ожидать небольшое Сгорбленная осанка для инвазивных процедур, как это, но животное будет вести себя нормально, как в начале 30 минут после операции.
   9. Место животное в клетке, свой собственный и не размещайте его с другими животными, до тех пор, пока полностью выздоровел.
   10. Повторно применять болеутоляющие ежедневно для до 48 h определена.
   11. Поместите продукты на пол клетки для животных время восстановления. Другие специальные уход обычно не требуется.
   12. Просмотрите сайт рану для покраснение, опухоль, или разгрузки и любые другие признаки инфекции.
   13. При необходимости удалите швы после 7-10 дней.
   14. Выполнять эвтаназии сразу же, если операция завершается неудачно (например, потери повреждение и/или крови значительное судна) или животного не улучшается с послеоперационного ухода. Эвтаназии обычно выполняется на 48 ч определена. Для больше экспериментов используйте 7-0 Пролен чтобы перевязать боковых ветвей и МКВ и 5-0 Викрил швы для закрытия брюшной полости.
       1. Выполните эвтаназии, анестезии животного в индукции как описывалось ранее, за исключением в 5% изофлюрановая. Это сопровождается удушение с 100% CO₂ в то время как под наркозом.
       2. После подтверждения эвтаназии, асфиксия (потеря не дыхание и сердцебиение) выполняют шейки матки дислокации для обеспечения полной эвтаназии.

2. Высокая частота ультразвуковых протокол

Примечание: Этот протокол приспособлен от леди Дэвис институт грызунов фенотипирование Core СОП для высокой частоты УЗИ. Этот протокол осуществляется 24 h послеоперационный, но может быть сделано раньше, до тех пор, как животное реагирует хорошо операции. Протокол может осуществляться в любое время на здоровых мышей и часто делается это сравнить до и после операции.

1. Подготовка животного
   1. Животное в камеру всасывание и анестезировать животное с смесь 100% кислорода и 2,5% изофлюрановая.
   2. Включите монитор температуры и частоты сердечных сокращений. Светильник жары в позиции над столом, чтобы согреться животного во время процедуры.
   3. Удалите животное из камеры для индукции и применять глаза смазкой для предотвращения высыхания роговицы. Поместите животное на анализ платформы и наносить обезболивающий трубки для рта/носа животного.
   4. Теплый УЗИ гель до 37 ° C и поместите гель на брюшке животного. Гель для УЗИ нагревается с помощью системы водяного отопления, насосы теплой водой через катушки, которые завернуты вокруг бутылка геля.
   5. Для измерения пульса (при необходимости) положить Электродный гель на 4 электродов анализ платформы и исправить лапы животного для платформы/электроды с хирургическая лента. Место животного в лежачем положении для визуализации мкВ. Ультразвуковой визуализации система включает в себя анализ платформы, которая нагревается и содержит электроды для мониторинга животного.
   6. Для измерения температуры положить Электродный гель на термометр и вставить в анальное отверстие животного.
   7. Отрегулируйте тепла лампы и изофлюрановая, необходимые для обеспечения что животное комфортно, есть дыхание между 30-70 bpm и хранится при температуре 37 ° C.
   8. При необходимости, брить живот животного или удаления волос крем удаления волос. Подать заявку на 1-2 минуты и протрите чистой марлей и дистиллированной воды.
      Примечание: Слишком много волос может повлиять на качество изображения.
   9. Поместите марлю под или в сторону животного, чтобы поймать любой избыток УЗИ гель.
2. IVC и тромбов
   1. Включите изображений программное обеспечение и начать новое исследование.
   2. Выберите соответствующие scanhead для обработки изображений. Scanhead, используемый здесь является для органов брюшной полости (частота: 35 МГц, фокусное расстояние: 12,8 мм).
   3. Запишите любую соответствующую информацию о животных. Это может включать в себя животное ID, пола, веса, Дата рождения, деформации, и т.д.
   4. Нижняя scanhead вниз до тех пор, пока это трогательно УЗИ гель на животных.
   5. Начало scanhead зонд, чтобы начать изображения 2-D животного. В этом режиме изображения представлены в двух измерениях, в различные оттенки серого.
   6. Найдите МКВ и брюшной аорты, перемещая мышь платформы во всем x - или y самолет, а также перемещение scanhead через z плоскость.
      Примечание: Крови судов будет отображаться с их белые стены и кровь внутри почти черной. Брюшной аорты будет интенсивно пульсирует и толстые стены, в то время как IVC будет иметь тонкие стены и сжимать/расширять легко на изображение экрана когда scanhead перемещается и вниз. Перешнуровка сайт будет ясно, как будут расширены Вены и стенки вен будет прийти к точке. Любые тромб, сформированы внутри будет твердым под УЗИ и не будет легко сжимать как делает стенки вен. Вену будет сжимать только выше перевязки, где не тромб образуется.
   7. При поиске МКВ и перевязка сайта, центр их на координационным центром УЗИ, чтобы достичь наиболее точных изображений.
      1. Если изображение слишком темно, чтобы видеть ясно, отрегулировать гель и удалить все пузырьки воздуха с аппликатором отзыв хлопок.
      2. При необходимости, наклона 45° влево или вправо scanhead и скорректировать животных платформы ясно увидеть Вену. Это делается в случае вмешательства с scanhead. В этом случае вен необходимо быть imaged на стороне угол избежать шовный материал.
         Примечание: Изображение вмешательства чаще всего вызвано темные пятна на коже животного, плохого заживления швов размещение или пузырьков в гель для УЗИ.
   8. С помощью программного обеспечения, фотографировать любой желаемой структуры и измерений с помощью любых инструментов измерения. Общие измерения включают площадь поперечного сечения тромба или ширина сайта перевязки.
   9. Измените режим визуализации на импульсно волнового Доплера для измерения потока крови. Этот режим позволяет визуализация сосудистого кровотока и измерение скорости потока, среди прочих переменных.
   10. Наклоните анализ платформы снизить заднего конца животного.
   11. Измените угол/положение scanhead, таким образом, чтобы он свяжется геля на угол около 30° от заднего конца животного.
   12. Переместите животных платформы и scanhead. При необходимости переместите МКВ и перевязки.
   13. Сделать измерения потока крови вокруг лигирование сайта для подтверждения застой и принимать любые изображения желаемого. Общие измерения потока крови включают средняя скорость, пик скорости или средней скорости.
   14. Сохраните любые измерения или снимки.
3. Clean-up и животных восстановления
   1. Повысить scanhead в исходное положение и положение животных платформы в исходное положение, а также.
   2. Удалите избыток геля у животных с марлей. Сделать это аккуратно, так, чтобы шов раны не быть разрыв.
   3. Извлеките термометр из животного кишки и взять животное с платформы.
   4. Место животное в его клетке и 34 ° C инкубатора.
   5. Мониторинг животных до выздоровления. Процедура является весьма незначительные и неинвазивные. Животное будет просыпаться быстро. Продолжить мониторинг животного в последующие дни в соответствии с разделом 1.6 настоящего Протокола.
   6. Очистите животных платформы с марлей и дезинфицирующих средств.
   7. Протрите scanhead с марлей и дистиллированной воды.
      Осторожностью: Очистить scanhead очень осторожно и только с дистиллированной водой.
   8. Повторите шаг 2 для следующего животного.
      1. Если сделано со всеми субъектами, убедитесь, что все изображения и записи были спасены. Затем выключите все оборудование и программное обеспечение.

Результаты

Стасис венозного тромбоза модель

В стазис модели мышей находятся под наркозом, и надрез производится подвергать нижней полой вены (IVC). Разрез делается на левой или правой стороне мыши вместо срединная лапаротомия таким образ?...

Обсуждение

Есть несколько важнейших шагах для его успешной венозной тромбообразованию, с использованием модели застой. Индукции тромбоза вен является более сложным, в старых мышей за счет накопления жира вокруг аорты и нижней полой вены. В идеале мышей, переживает эта процедура должна быть 8 - 10-не...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 perma-hand silk suture	Ethicon	706G
Surgical Scissors	Fine Science Tools	20830-00
Suture tying forceps	Fine Science Tools	20830-00
blunt forceps (straight and curved)	Fine Science Tools	20830-00
Needle Driver	Fine Science Tools	13002-10
Moria Spring Scissors	Fine Science Tools	15396-00
1ml syringes	BD Biosciences
26G needles	Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System	Visualsonics	No longer sold
SR Buprenorphine	ZooPharm		Given to LDI by Vet
Surgery Microscope	Leica	Leica M651
Systan eye oinment	Alcon	288/28062-0
2x2 sterile Gauze	CDMV	#104148
Cotton Tip Applicators			from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape	CDMV	#7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100)	Dufort & Lavigne	#AKEN4061
Incubator			From JGH
Isoflurane	Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment	Dispomed
Hair remover	Nair
Water heated hard pad	Braintree Scientific, Inc.	#HHP-2
Gaymar heater water pump TP500	MATVET Inc.	#R-500305
Infra-red heating lamp	electrimat inc.	#1R175R-PAR
Mouse rectal temperature prope	emkaTECHNOLOGIES
Sterile water			From JGH