Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Resumen

Cultivos primarios de raíz dorsal (GRD) de los ganglios se utilizan con frecuencia para estudiar las funciones fisiológicas o eventos relacionados con patología en las neuronas sensoriales. Aquí, se demuestra el uso de culturas DRG lumbares para detectar la liberación de neurotransmisores después de receptor del neuropéptido FF tipo 2 estimulación con un agonista selectivo.

Resumen

Ganglios de raíz dorsal (GRD) contienen cuerpos celulares de neuronas sensoriales. Este tipo de neurona es pseudo-unipolar, con dos axones que inervan los tejidos periféricos, tales como piel, músculo y órganos viscerales, así como el cuerno dorsal espinal del sistema nervioso central. Las neuronas sensoriales transmiten sensación somática, como tacto, dolor, sensaciones térmicas y propioceptivas. Por lo tanto, cultivos primarios DRG son ampliamente utilizados para estudiar los mecanismos celulares del nociception, funciones fisiológicas de las neuronas sensoriales y desarrollo neuronal. Las neuronas cultivadas pueden aplicarse en estudios de electrofisiología, transduction de la señal, liberación de neurotransmisor o proyección de imagen de calcio. Con cultivos primarios de DRG, los científicos pueden cultura disociada las neuronas DRG para monitorear los cambios bioquímicos en solo o varias celdas, superando muchas de las limitaciones asociadas con experimentos en vivo . En comparación con comercialmente disponibles líneas celulares de hibridoma DRG o inmortalizadas las líneas de células neuronales de DRG, la composición y propiedades de las células primarias son mucho más similares a las neuronas sensoriales en el tejido. Sin embargo, debido al limitado número de DRG primaria las células cultivadas que pueden ser aislados de un solo animal, es difícil realizar pantallas de alto rendimiento de drogas dirigidas a estudios. En el actual artículo, se describen los procedimientos para la colección de DRG y la cultura. Además, demostramos que el tratamiento de células cultivadas de DRG con un agonista del receptor del neuropéptido FF tipo 2 (NPFFR2) para inducir la liberación de neurotransmisores péptido (péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CRGP) y sustancia P (SP)).

Introducción

Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales están contenidos dentro de DRG. Estas neuronas son pseudo-unipolares e inervan los tejidos periféricos y el sistema nervioso central. Las terminaciones nerviosas periféricas de las neuronas sensoriales se encuentran en el músculo, piel, órganos viscerales y óseas, entre otros tejidos. Transmiten las señales de sensación periférica nervio conclusiones en el cuerno dorsal espinal y las señales se transmiten luego al cerebro a través de diferentes vías ascendentes de la sensibilidad somática^1,2. Sensación somática permite al cuerpo a sentir (es decir, tacto, dolor y sensaciones térmicas) y percibir el movimiento y orientación espacial (sensaciones propioceptivas)^1,3. Hay cuatro subclases de axones aferentes primarios, incluyendo el grupo I (Aα) fibras que responden a la propiocepción de los músculos esqueléticos, fibras de II (Aβ) grupo que responden a los mecanorreceptores de la piel, y grupo III (Aδ) y fibras de V (C) grupo que responden al dolor y temperatura. Sólo las fibras C son amielínicas, mientras que el resto son myelinated en diferentes grados.

Nociceptores son las neuronas sensoriales primarias, que son activadas por estímulos nocivos (estímulo mecánico, térmico y químico) que llevan la posibilidad de daño tisular. Estas neuronas están compuestos por fibras Aδ myelinated y unmyelinated fibras de C^1,4. Las fibras Aδ expresan los receptores para el factor de crecimiento nervioso (NGF, trkA receptor), CGRP y SP. Las fibras C se clasifican como fibras C o peptidérgicos y no peptidérgicos. Por otra parte, las fibras de C peptidérgicos no expresan los receptores para el factor neurotrophic glial-derivado (GDNF, RET y GFR receptores), proteína IB4 y ATP-gated ion canal subtipo (P2X3)^5,6,7. Nociceptores pueden ser distinguidos por la expresión de canales iónicos y activados por factores neurotróficos, citoquinas, neuropéptidos, ATP u otro producto químico compuestos de⁸. Sobre el estímulo, se pueden liberar neurotransmisores, como glutamato, CGRP y SP de los terminales de la neurona sensorial en el cuerno dorsal espinal para transmitir las señales nociceptivas². DRG no sólo están compuesta de neuronas, pero también contienen células glial satélite. Las células satélites rodean las neuronas sensoriales y proporcionar soporte mecánico y metabólico^9,10. Curiosamente, hay un creciente cuerpo de evidencia que indica que las células glial satélite en el DRG podrían estar implicadas en la regulación de la sensación de dolor¹¹.

Las neuronas sensoriales se han divulgado más con frecuencia utilizan las células neuronales primarias¹² y se han utilizado para estudios de liberación de neurotransmisor, electrofisiología y transducción de la señal. Comúnmente se utilizan para explorar los mecanismos celulares del desarrollo neuronal, dolor inflamatorio, dolor neuropático, sensación de la piel (como pica) y axón resultado^12,13,14,15. Cultivos primarios de DRG pueden cultivarse como neuronas disociadas para evaluar los cambios bioquímicos en uno o varias celdas, permitiendo a los científicos realizar estudios que no se puede realizar en sujetos experimentales. Recientemente, DRG fueron cultivadas con éxito de los donantes de órganos humanos que podrían beneficiarse enormemente la investigación traslacional¹⁶. Por otra parte, las neuronas sensoriales pueden cultivarse también como explantes de DRG. Los explantes DRG preservar la arquitectura original del tejido de las neuronas, incluyendo las células de Schwann y células gliales por satélite y son especialmente útiles para estudiar las interacciones entre las células neuronales y no neuronales¹⁷. Cultivos primarios DRG pueden prepararse fácilmente en 2,5 horas. Las propiedades y composición de la célula son altamente reflectantes de la fuente DRG, y como tal, GRD específico (DRG lumbar o torácica) se recogerán según demandas experimentales. Cultivos de neuronas DRG embrionarias y neonatales requieren NGF sobrevivir e inducir consecuencia de axon, pero cultivos de neuronas adultas no requieren la adición de factores neurotróficos a los medios de comunicación^12,17. También hay disponibles comercialmente líneas celulares de hibridoma DRG como ND7/23 y F11, que no requieren el uso de animales de experimentación. Sin embargo, la falta de la cación potencial transitorio del receptor canal de miembros de la subfamilia V 1 (TRPV1) expresión (un marcador importante para pequeñas sensoriales neuronas nociceptivas) y perfiles de expresión génica incongruente limitan sus aplicaciones¹⁸. Recientemente, inmortalizado células neuronales DRG líneas han sido derivadas de rata (50B11)¹⁹ y²⁰de ratón (MED17.11), que son convenientes para usan en pantallas de alto rendimiento de drogas dirigidas a estudios. Sin embargo, la expresión génica perfiles para estas líneas celulares aún no ha realizarse. Así, los experimentos de validación comparando estas células inmortalizadas en las neuronas sensoriales están aún en curso.

NPFFR2 es sintetizado en el DRG y trasladadas a las terminales nerviosas sensoriales en el cuerno dorsal espinal²¹. En este artículo, proporcionamos un protocolo para el cultivo de células DRG lumbares y tratamiento con un agonista de los NPFFR2 para inducir la liberación de neurotransmisores, CGRP y SP. La dependencia de NPFFR2 más se prueba usando NPFFR2 pequeña interferencia RNA (siRNA), que puede transfected en las células cultivadas de la DRG.

Protocolo

Todos los métodos descritos que utilizan animales de experimentación fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Chang Gung University (CGU 13-014).

1. recoger DRG Lumbar de las ratas experimentales

1. Utilizar 2 a 3 ratas de Sprague-Dawley (SD) semana para colección de DRG lumbar.
   Nota: Las neuronas DRG obtenidas de ratas durante 4 semanas de edad no crecen bien bajo las condiciones de cultivo descritas.
2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en una autoclave.
3. Anestesiar la rata con una mezcla 1:1 de tiletamina y zolazepam (20 mg/kg, inyección intraperitoneal (IP)) y espere hasta que el animal no muestre ninguna respuesta de retirada de pie en una prueba del pellizco del dedo del pie.
   Nota: La anestesia diferentes estrategias pueden ser usadas con éxito en el presente Protocolo.
4. La rata de sacrificio por decapitación con una guillotina comercial.
5. Use la guillotina para aislar el tronco del cuerpo de la rata entre el miembro anterior y el fémur. Ver figura 1A para un diagrama de la región para ser recogidos.
   Nota: La línea de corte de caudal debe ser justo rostral al fémur. El DRG L6 lumbar será suprimido si el sitio de corte está demasiado alto en la columna vertebral.
6. Corte a lo largo del esternón y retire todos los órganos/tejidos con tijeras de disección (figura 2A-a).
7. Corte a lo largo de la parte del tronco para recoger la parte dorsal de la rata y retirar la piel. Ver figura 1B para una fotografía del tronco dorsal disecado.
8. Preparar el tejido en el hielo antes de recoger la DRG. Limpiar la piel y la sangre de guantes y esterilizarlas con etanol al 75% antes de proceder al siguiente paso.
9. Quitar los músculos que cubren la espina dorsal lumbar. En primer lugar, hacer dos cortes a lo largo de los lados de la columna vertebral (izquierda y derecha) y un corte lateral para marcar la parte rostral de la columna lumbar. Luego, quite los músculos dorsales de la columna vertebral con pinzas de corte de hueso (figura 2A-b).
10. Retire la porción dorsal de las vértebras con pinzas para cortar hueso y exponer la médula espinal.
11. Quitar la médula espinal con tijeras de disección (figura 2A-c) y pinzas (figura 2A-d).
12. Identificar el DRG lumbar contando las vértebras de la última costilla (13 de vértebra torácica). Ver figura 1 para un diagrama de las posiciones de las vértebras.
13. Recoger el DRG bilateral lumbar (L1-L6) con micro-tijeras (figura 2A-f) en una placa de cultivo de 35 mm con medio libre de suero helado de 2 mL. Retire las fibras neuronales (como se indica en la figura 1) conexión DRG, luego transferir a la placa de cultivo para mejorar la pureza de las culturas.
    Nota: El DRG recogido puede conservarse en el medio en el hielo durante aproximadamente 1 hora. Mientras tanto, varias ratas pueden ser sacrificadas para crear un conjunto más amplio de la DRG.

2. primaria cultura de rata madera GRD

Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en campana de flujo laminar.

1. Preparar medio de cultivo con 10% suero fetal bovino, piruvato de sodio 100 mM y penicilina/estreptomicina de 1 x 1 x DMEM-F12.
2. Capa de cultivo celular tratamiento placa de 24 pozos con 200 μg/mL poli-l-lisina por 2 h y luego lavado con agua esterilizada.
3. Pre-incubar la placa de cultivo con 1 mL medio de cultivo en un incubador de 37 º C CO₂ antes de usar por lo menos 30 min.
4. Transferir el plato de 35 mm que contiene el DRG una campana laminar y el GRD con medio libre de suero 3 veces con la pipeta.
   Nota: La parte exterior del plato debe limpiarse con etanol al 75% antes de transferir a la campana. El plato de 35 mm puede contener DRG de un número de ratas (esto dependerá de las exigencias del diseño experimental).
5. Mover el DRG (de una rata sola o en combinación de varias ratas) a una nueva placa de cultivo de 35 mm, que contiene 2 mL de tipo colagenasa IA (1 mg/mL en medio libre de suero) con pinzas estériles (figura 2A-e).
   Nota: La solución de colagenasa debe esterilizarse al pasar por un filtro de jeringa 0,22 μm.
6. Digerir el DRG en la solución de colagenasa en una incubadora de 37 ° C CO₂ durante 30 minutos.
7. Retirar la solución de la colagenasa y lavado el DRG 3 veces en 2 mL Hank equilibrada solución de sal (HBSS).
   Nota: Puede haber fibras residuales o tejidos que se desprenden del DRG en la solución. Retírelas con una pipeta con la solución de lavado.
8. Añadir 2 mL previamente calentado con 0.05% tripsina-EDTA en el plato de 35 mm que contiene el DRG y digerir el DRG en una incubadora de 37 ° C CO₂ durante 30 minutos.
9. Transferir 2 mL de solución que contiene el DRG a un tubo de centrífuga de 15 mL con una pipeta de vidrio.
   Nota: El DRG podría pegarse a la pipeta de cristal para que este paso debe realizarse con cuidado. Pérdida DRG puede evitarse manteniendo la solución que contiene el DRG el extremo ahusado de una pipeta de vidrio (aproximadamente 0,5 mL) y transferir la solución en el tubo de centrífuga lentamente pero sin pausa.
10. Centrifugue la solución a 290 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y añadir otro medio libre de suero de 2 mL para Resuspender el DRG.
11. Repita el paso 2.10 2 veces pero cambio el medio libre de suero al medio de cultivo precalentada en el último tiempo.
12. Triturate manualmente el DRG aproximadamente 60 veces utilizando una pipeta Pasteur llama pulido (longitud 230 mm y punta de cabeza diámetro interior 1 mm). Ver figura 2B para una foto comparando el orificio de una pipeta Pasteur pulido a llama a una pipeta no pulido.
    Nota: El interior diámetro de la pipeta de Pasteur llama pulido es aproximadamente 10% más pequeño que la pipeta de control y el interior del extremo cónico debe ser más suave. Tenga cuidado de no crear burbujas cuando la trituración de las células.
13. Quitar el plato de poly-L-lisina-revestida de la incubadora de CO₂ . Aspire el medio de cultivo incubado desde el plato y las células disociadas en el plato cubierto de semillas.
14. Las células de la DRG de una rata (colección bilateral de L1-L6, para 12 DRG total) de la semilla en cuatro pocillos de una placa de 24 pozos; Hay aproximadamente 5 x 10⁴ células en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
    Nota: Esta densidad es conveniente para la detección de los liberados CGRP o SP y también conveniente para la inmunotinción. Por Western blot o la extracción de RNA, de la semilla las células DRG de una rata (bilateral L1-L6) en un pocillo de una placa de 6 pozos.
15. Reemplazar el medio de cultivo al día siguiente con la incorporación de 10 μm citarabina (ara-c) y 100 ng/mL NGF y refrescar el medio cada dos días después de eso.
    Nota: El DRG torácico también puede también ser cultivado por este protocolo, si han sido recogidos de la espina dorsal torácica.

3. transfección de NPFFR2 siRNA en células de DRG

1. Realizar la transfección del siRNA de NPFFR2 y control de siRNA según protocolo del fabricante.
   Nota: El protocolo tendrá que ser adaptado si el reactivo de transfección elegido es diferente del que hemos utilizado (véase la Tabla de materiales).
2. El día 3 después de la galjanoplastia de la célula, cambia el medio al medio libre de suero pre-warm de 0.5 mL e incubar el DRG en una incubadora de 37 ° C CO₂ durante 1 hora.
3. Añadir 50 nM de siRNA (en agua libre de ARNasa 1 de μL) en 12,5 μl de medio sin suero.
4. Añadir 2,5 μl de reactivo de transfección en 10 μl de medio sin suero.
5. Mezcle la solución de solución pasos 3.3 y 3.4 por pipeta e incubar este mezclado de la transfección por 10 min a temperatura ambiente.
6. Añadir la solución de transfección en una placa de 24 pocillos que contienen DRG y mezclar la solución con medio por agitación suave.
   Nota: Múltiples soluciones de transfección deben desplegarse al mismo tiempo si pozos múltiples necesitan ser transfectadas.
7. Incubar el DRG en una incubadora de 37 ° C CO₂ durante 6 h.
8. Agregar 0.5 mL o bien del medio de cultivo que contiene 20% de suero fetal bovino, piruvato de sodio 100 mM y penicilina/estreptomicina de 1 x 1 x DMEM-F12, con la adición de 10 μm Ara-C y 100 ng/mL de NGF, en la placa de 24 pocillos.
9. Incubar el DRG en una incubadora de 37 ° C CO₂ para otro 66 h (actualizar el medio a las 48 h).

4. liberación de neurotransmisores de las células primarias DRG

1. El día 6 después de que las células fueron plateadas (72 h después de la transfección de siRNA), cambiar el medio de cultivo a 200 μL de medio sin suero e incubar las células en una incubadora de 37 ° C CO₂ durante 30 minutos.
2. Añadir 1 μl estímulo químico y suavemente mezclar los medios de comunicación mediante pipeteo. Incubar el plato en una incubadora de 37 ° C CO₂ durante el tiempo designado.
   Nota: En este artículo, las células cultivadas fueron estimuladas con el agonista NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH₂, 5 nmol), durante 1 hora.
3. Obtener el medio de cultivo de la placa de cultivo y centrifugar a 5.000 x g durante 5 min a 4 ° C para eliminar las impurezas suspendidas.
4. Recoger el sobrenadante de la centrifugación y diluir las muestras con solución salina tamponada con fosfato (PBS), según sea necesario. Análisis de los niveles de neurotransmisores con kits de enzima inmunoensayo (EIA).
   Nota: Aquí, los sobrenadantes fueron diluidos 1: 100 antes de analizar el nivel de CGRP. El sobrenadante se diluyó no antes de analizar el nivel de SP.

5. CGRP y SP EIA

1. Analizar las muestras inmediatamente según protocolo CGRP o SP EIA kit del fabricante.
   Nota: El protocolo varía dependiendo el kit utilizado.
2. Lavar los pozos de CGRP EIA 5 veces con tampón de lavado suministrado en el kit.
3. 100 muestras μl con 100 indicador de acetilcolinesterasa (AChE) de anti-CGRP μL en los pocillos de CGRP EIA y añadir 50 μl las muestras, trazador de AChE de anti-SP de μl 50 y antisuero anti-SP de 50 μl a los pozos de EIA SP.
4. Sellar los pozos CGRP y SP con la película plástica que viene en los kits.
5. Incubar los pocillos durante la noche a 4 ° C.
6. Lavar los pocillos 5 veces con CGRP o SP tapón de lavaje y quitar el resto de la solución de los pozos.
7. Añadir reactivo de Ellman 200 μl a los pocillos CGRP o SP que se suministra dentro de los kits EIA correspondientes.
8. Incube los pocillos CGRP durante 30 min a temperatura ambiente e incubar los pocillos SP durante 90 minutos a temperatura ambiente. Proteger los pozos de luz para ambos ensayos.
9. Leer las placas a longitud de onda 414 nm y calcular los resultados según el instrumento EIA correspondiente.
   Nota: Evite tocar la parte inferior de los pozos a mano todo el tiempo y limpiar las manchas de agua de la parte inferior bien por limpieza toallitas húmedas antes de agregar el reactivo de Ellman.

Resultados

Rata lumbar DRG neuronas cultivadas en un plato 24-well, fueron cultivadas en medio de cultivo con Ara-C adicional para inhibir la proliferación de células gliales y NGF para apoyar el crecimiento neuronal. La morfología de la vida se observaron células DRG. Como se muestra en la figura 3, el cuerpo celular de una neurona sola fue atado en el fondo de un plato en 1 día y seleccionado para la observación. Crecimiento del Axon fue monitoreado desde el dí...

Discusión

En el presente artículo, nos muestran la colección, disociación de la enzima y la cultura de lumbar de la rata DRG. Con el apoyo de neurotróficos de NGF, los axones de las neuronas DRG extendido dentro de 3 días después de la siembra de células. Los axones extendidos fueron claramente observables después de que las células se tiñeron para proteína CGRP, que es sintetizada en el soma celular y transportada a lo largo de las fibras de axones. Los procesos de células satélite también extendidos, permitiendo qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)	Virbac	Zoletil 50	anaesthetic
Fetal bovine serum	Biological Industries	04-001-1	Culture Medium
sodium pyruvate	Sigma	S8636	Culture Medium
penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-033-1	Culture Medium
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Culture Medium
Poly-l-lysine	Sigma	P9011	Coating dish
Collagenase IA	Sigma	9001-12-1	Enzyme digestion
Hank's balanced salt solution	Invitrogen	14170-112	Culture Medium
Trypsin EDTA	Biological Industries	03-051-5	Enzyme digestion
Pasteur pipette	Hilgenberg	3150102	Cell trituration
Cytarabine (Ara-C)	Sigma	C6645	Culture Medium
NGF	Millipore	NC011	Culture Medium
NPFFR2 siRNA	Dharmacon	L-099691-02-0005	Transfection
Non-targeting siRNA	Dharmacon	L-001810-10-05	Transfection
NeuroPORTER Reagent	Genlantis	T400150	Transfection reagent
dNPA	Genemed Synthesis	N/A	NPFFR2 agonist
CGRP ELISA	Cayman	589001	EIA
SP ELISA	Cayman	583751	EIA
CGRP antibody	Calbiochem	PC205L	IHC
DAPI	Roche	10236276001	IHC