伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

要約

後根神経節 (DRG) の初代培養は、生理機能や感覚ニューロンの病理に関連するイベントを研究するよく使用されます。ここでは、我々 は FF 神経ペプチド受容体選択的なアゴニスト 2 刺激を入力後、神経伝達物質の放出を検出するための腰部後根神経節文化の使用を示します。

要約

後根神経節 (DRG) では、感覚ニューロンの細胞体が含まれています。ニューロンのこのタイプは、皮膚、筋肉、内臓、中枢神経系の脊髄後角などの末梢組織を支配する 2 つの軸索と、擬似単極です。感覚ニューロンは、体性感覚、タッチ、痛み、熱、および自己感応の感覚を送信します。したがって、DRG 初代培養は、侵害受容の分子機構、感覚ニューロンと神経系の発達の生理機能を研究に活躍しています。培養神経細胞は、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質のリリース、またはカルシウム イメージングを含む研究で適用できます。DRG 初代培養、科学者が単一の生化学の変化を監視する解離の DRG ニューロンの文化や生体内で実験に関連付けられている複数のセルは、多くの制約を克服します。市販に比べて利用 DRG ハイブリドーマ細胞不死化後根神経節神経細胞、組成や一次電池の特性より組織の感覚ニューロンに似ています。ただし、1 つの動物から分離できる培養後根神経節細胞の数が限られたため薬物標的の探索のハイスループット画面を実行することは困難です。現在の記事では、DRG のコレクションおよび文化のための手順を示します。さらに、FF の神経ペプチド受容体 2 型のアゴニストと後根神経節細胞 (カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CRGP) と P 物質 (SP)) ペプチド神経伝達物質の放出を誘発する (NPFFR2) の治療を紹介します。

概要

感覚ニューロンの細胞体は後根神経節内に含まれます。これらのニューロンは擬似単極、末梢組織と中枢神経系を支配します。感覚ニューロンの末梢神経終末は、筋肉、皮膚、内臓器官や骨、他の組織.の間であります。体性感覚^1,の²つの昇順経路を介して脳に転送される脊髄後角、および信号の終末神経の末梢の感覚信号します。体性感覚を可能に (すなわちタッチ、痛み、および熱感覚) を感じ、知覚運動と空間的な向き (固有受容感覚)^1,の³体。4 がある骨格筋、皮膚の受容に応答グループ II (a β) 繊維の感覚に対応し、グループ III (Aδ) (核内局在) 繊維と痛みに応答グループ V (C) 繊維を含むプライマリの求心性軸索のサブクラス群と温度。C 線維のみ、残りが異なる度に有髄髄、おりません。

侵害受容器は、組織の損傷の可能性を運ぶ侵害刺激 (機械的、熱的、化学的刺激) によって活性化される第一次感覚ニューロンです。これらのニューロンは、Aδ 有髄線維と無髄の C 線維^1,4で構成されます。Aδ 繊維エクスプレスの SP、CGRP、神経成長因子 (NGF 受容体 trkA) 受容体C 線維は、ペプチドおよび非ペプチド作動性の C 線維に分類されます。その一方で、非ペプチド作動性 C 線維はグリア由来神経栄養因子 (GDNF、RET、GFR 受容体)、isolectin、IB4 と ATP 依存性イオン チャネルのサブタイプ (P2X3)^5,6、7のための受容器を表現します。侵害受容器のイオン チャネルの発現によって区別、神経栄養因子による活性化サイトカイン、神経ペプチド、ATP、または他の化学化合物⁸することができます。刺激、CGRP、SP、グルタミン酸などの神経伝達物質は、侵害受容性信号²を送信する脊髄後角における感覚ニューロンの端末からリリースされるかもしれない。DRG はだけニューロンから成るとはありませんが、また衛星グリア細胞を含みます。衛星細胞感覚ニューロンを囲む、機械的および代謝サポート^9,10。興味深いことに、痛み感覚¹¹の調節に DRG 衛星グリア細胞が侵されることを示す証拠の成長するボディがあります。

感覚ニューロンは最も頻繁に第一次神経細胞¹²を使用、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質放出の研究に利用されているが報告されています。神経の開発、炎症性疼痛、神経因性疼痛、(かゆみ) のような皮膚感覚軸索伸長^12,13,14,15の細胞メカニズムを探るにもよく使用されます。DRG 初代培養は、実験科目では実行できない研究を実行する単一または複数のセルの生化学的変化を評価するために解離ニューロンとして培養することができます。最近、後根神経節が大きくトランスレーショナルリサーチ¹⁶に恩恵を受ける可能性があります人間の臓器提供者から養殖に成功しました。その一方で、後根神経節外植片として感覚ニューロンは培養も。DRG 植ニューロン、シュワン細胞と衛星グリア細胞を含む元の組織構造を維持、神経および非神経細胞¹⁷間の相互作用の研究に特に有用です。DRG 初代培養は、2.5 h の内で簡単に用意できます。細胞の組成と性質は後根神経節、ソースの反射率の高い、実験の要求に応じて特定後根神経節 (腰部や胸部の DRG) を収集できるよう。胎児・新生児の DRG ニューロンの文化必要軸索伸長を誘発して生き残るために NGF が大人ニューロンの文化メディア^12,17に神経栄養因子の添加を必要としません。ND7/23 と F11、実験動物の使用を必要としないなどの市販の DRG ハイブリドーマ細胞株もあります。ただし、一時的な受容器の潜在的な陽イオンの欠如チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) 式 (小さな侵害受容ニューロンの重要なマーカー) と不適合遺伝子発現プロファイルの制限、アプリケーション¹⁸。最近では、行は、ラット (50B11)¹⁹から派生されている不死の後根神経節神経細胞およびマウス (MED17.11)²⁰に適しているはターゲティング研究の高スループット画面で使用します。しかし、これらの細胞株の遺伝子発現はまだ実行します。したがって、感覚ニューロンへこれらの不死化細胞の比較検証実験はまだ進行中です。

NPFFR2 は、後根神経節で合成、脊髄後角²¹の感覚神経終末に移行します。この記事で私たちは腰部後根神経節細胞を培養し、CGRP と SP の神経伝達物質の放出を誘発する NPFFR2 のアゴニストとそれらを扱うのためのプロトコルを提供します。NPFFR2 への依存は、NPFFR2 小さい干渉 RNA (siRNA) 培養後根神経節細胞にトランスフェクション可能性がありますを使用してさらにテストされます。

プロトコル

実験動物を使用するすべてのメソッドに記載は、動物介護制度や長庚大学 (CGU 13-014) の使用委員会 (IACUC) によって承認されました。

1. 実験的ラットの腰部後根神経節を収集します。

1. 腰椎の DRG コレクションの 3 週齢 Sprague-dawley (SD) ラットに 2 を使用します。
   注: 以上 4 週齢ラットから収集した DRG ニューロンは、記載の培養条件下でよく成長はありません。
2. オートクレーブですべての手術器具を滅菌します。
3. チレタミンとチレタミン (20 mg/kg; 腹腔内注入 (IP)) の 1:1 混合物のラットを麻酔し、動物は、つま先ピンチ テストで足撤退応答を示さないまで待ちます。
   注: 異なる麻酔戦略は、このプロトコルでは正常に使用できます。
4. 商業ギロチンで斬首でラットを犠牲に。
5. ギロチンを使用すると、前肢と大腿骨の間ラットの体幹を分離します。収集する地域の図は、図 1 aを参照してください。
   注: 尾側切断線は大腿骨に吻側だけはずです。脊柱のカットのサイトが大きすぎる場合、腰椎の L6 DRG が摘出されます。
6. 胸骨に沿ってカットし、解剖はさみ (図 2 a-) ですべての臓器・組織を削除します。
7. ラットの背の部分を収集し、皮膚を削除するトランクの側面に沿ってカットします。切り裂かれた背のトランクの写真の図 1 bを参照してください。
8. DRG を収集する前に氷の上のティッシュを準備します。毛皮と手袋から血をきれいにし、次のステップに進む前にエタノール 75% とそれらを殺菌します。
9. 腰椎を覆う筋肉を削除します。まず、(左と右) 脊柱の両側に沿って 2 つのカットと腰椎の吻側の範囲をマークする 1 つの水平カットを作る。骨切削鉗子 (図 2 ab) で、脊柱の背側の筋肉を削除します。
10. 骨切削鉗子で脊椎骨の背の部分を削除し、脊髄を公開します。
11. 解剖はさみ (図 2 a-c) と鉗子 (図 2 a-d) 脊髄を削除します。
12. (胸部の椎骨 13) の最後の肋骨から椎体をカウントすることにより腰椎の DRG を識別します。椎骨の位置の図は、図 1を参照してください。
13. 2 mL 冷たい無血清培地で 35 mm 培養皿にマイクロ剪刀 (図 2 a-f) と両側腰部後根神経節 (L1 L6) を収集します。DRG を接続する (図 1に示されている)、神経繊維を削除し、文化の純度を改善するために培養皿にそれを転送します。
    注: 約 1 時間氷上中で収集した DRG を保存できます。一方、DRG の大きいプールを作成する複数のラットを安楽死することができます。

2. 木材ラット後根神経節の培養

注: 次の手順は、層流フードで実行する必要があります。

1. 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン 1、ピルビン酸ナトリウム 100 mM, 10% 牛胎児血清を含む培養液を準備 DMEM F12 x。
2. 細胞培養のコートは、200 μ g/mL ポリ-L-リジンの 2 h の 24 ウェル プレート、滅菌水で洗浄に扱われます。
3. 前、少なくとも 30 分間使用する前に 37 ° C CO₂インキュベーターで 1 mL 培養液で培養皿を孵化させなさい。
4. 層流フードに DRG を含む 35 mm ディッシュを転送し、ピペットで 3 回無血清培地に DRG を洗います。
   注: 皿の外側は、ボンネットに転送する前に 75% エタノールで掃除する必要があります。35 mm ディッシュは、ラット (実験的なデザインの要求に応じて変わります) の数から DRG を含めることができます。
5. DRG を移動 (単一のラットからまたは複数のラットから結合) 滅菌ピンセット (図 2 a-e) でコラゲナーゼ タイプ IA の 2 mL (1 mg/mL 無血清培地) を含む新しい 35 mm ディッシュに。
   注: コラゲナーゼの解決は、0.22 μ m シリンジ フィルターを通してそれを渡すことによって殺菌する必要があります。
6. 30 分の 37 ° C CO₂インキュベーターでコラゲナーゼの解決の後根神経節を消化します。
7. コラゲナーゼの解決を取り外して洗浄 2 mL ハンクの DRG 3 回平衡塩類溶液 (HBSS)。
   注: 可能性があります残留繊維や組織液に DRG オフに来る。ピペット洗浄ソリューションを使用してそれらを削除します。
8. 2 mL で加温 35 mm ディッシュの後根神経節を含むダイジェスト 30 分の 37 ° C CO₂インキュベーターの DRG に 0.05% トリプシン-EDTA を追加します。
9. ガラス ピペットで DRG 含有溶液 2 mL を 15 mL 遠心管に転送します。
   注: DRG に固執するかもしれないガラス ピペット注意してこの手順を実行する必要がありますので。ガラス ピペット (約 0.5 mL) のテーパー端に DRG を含むソリューションを維持し、遠心管にソリューションをゆっくりと転送が一時停止せず、DRG の損失を避けることができます。
10. 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 290 x gでソリューション上澄みを除去し、追加別 2 mL 無血清培地に DRG を再懸濁します。
11. 最後に、変更が 2 回手順 2.10 予め温めておいた培に無血清培地を繰り返します。
12. 手動で約 60 回使用炎研磨パスツール ピペット DRG カップを刻んだ (長さ 230 mm とヒント頭の内側直径 1 mm)。非研磨のピペットに炎研磨パスツール ピペットのオリフィスを比較写真図 2 bを参照してください。
    注: 内部炎研磨パスツール ピペットの直径は約 10% 制御ピペットより小さい、テーパー部分の内側を滑らかにする必要があります。セルを triturating するときに泡を作成しないように注意してください。
13. CO₂インキュベーターからポリ L リジン コーティング皿を削除します。料理から培養培を吸引でコーティングされた皿に解離細胞をシードします。
14. 24 ウェル プレートの 4 つの井戸に 1 匹のラット (12 合計 DRG の L1-L6 から二国間コレクション) から後根神経節細胞を播く24 ウェル プレートのウェル 1 個に約 5 x 10 の⁴セルがあります。
    注: この密度、リリースされた CGRP や SP の検出に適してと免疫染色にも適しています。西部のしみまたは RNA の抽出、6 ウェル プレートのウェル 1 個に 1 匹のラット (二国間 L1 L6) から後根神経節細胞を播きます。
15. 10 μ M シタラビン (ARA-C) を追加して次の日に培養液と 100 ng/mL、NGF を交換し、その後にすべての 2 日間媒体を更新します。
    注: 胸部の DRG もできますまた培養するこのプロトコルによって胸椎から収集されている場合。

3。 後根神経節細胞における NPFFR2 sirna トランスフェクション

1. NPFFR2 sirna トランスフェクションを実行し、製造元のプロトコルによると siRNA を制御します。
   注: プロトコルが選択したトランスフェクション試薬が我々 が使用するものと異なる場合に適応する必要があります (表の資料を参照してください)。
2. セルめっき後 3 日目 0.5 mL 中古暖かい無血清培地に媒体を変更し、1 h の 37 ° C CO₂インキュベーターに DRG を孵化させなさい。
3. 追加 50 12.5 μ L 無血清培地に (1 μ L RNase フリー水) の siRNA の nM。
4. 2.5 μ L のトランスフェクション試薬を 10 μ L 無血清培地に追加します。
5. 室温で 10 分間の手順 3.3 と 3.4 で、ピペットし、この混合トランスフェクションをインキュベート ソリューションからソリューションをミックスします。
6. 1 つの後根神経節を含む 24 ウェル プレートにトランスフェクション ソリューションを追加し、穏やかな揺れで媒体と混合します。
   注: 複数の井戸を導入する必要がある場合、複数のトランスフェクション ソリューションを同時に展開してください。
7. 6 時間 37 ° C CO₂インキュベーターに DRG を孵化させなさい。
8. 0.5 mL を追加/20% 牛胎児血清、100 mM ピルビン酸ナトリウム、および 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン 1 を含む培養液の 10 μ M Ara C と 100 ng/mL の NGF、24 ウェル プレートに添加 DMEM-f12 キー、x。
9. DRG 別 66 h (更新 48 h で媒体) の 37 ° C CO₂インキュベーターで孵化させなさい。

4 主な後根神経節細胞から神経伝達物質の放出

1. 6 日目 200 μ L 無血清培地の培養液に変更するセル (siRNA トランスフェクション後 72 h) をメッキした後と 30 分の 37 ° C CO₂インキュベーターで細胞をインキュベートします。
2. 1 μ L 刺激 chemical(s) を追加し、軽くピペッティングしてメディアをミックスします。37 ° C CO₂インキュベーターで皿を指定の時間にインキュベートします。
   注: この記事で培養細胞が刺激された NPFFR2 アゴニスト、dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe NH₂, 5 nmol) で 1 時間。
3. 培養皿中断された不純物を取除くための 4 ° C で 5 分間 5,000 × gで遠心分離から培養培地を収集します。
4. 遠心分離から上澄みを収集し、必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) とサンプルを希釈します。酵素免疫測定法 (EIA) キットと神経伝達物質のレベルを測定します。
   注: ここでは、培養上清が薄くされた 1: 100 CGRP のレベルを分析する前に。上清はない SP のレベルを分析する前に希釈しました。

5. CGRP と SP EIA

1. CGRP や SP EIA キット製造元のプロトコルに従ってすぐにサンプルを分析します。
   注: プロトコルは、使用キットによって異なります。
2. キット内の洗浄バッファーで 5 回 CGRP EIA 井戸をすすぎます。
3. CGRP EIA ウェルに 100 μ L 抗 CGRP アセチルコリンエステラーゼ (AChE) トレーサーを 100 μ L のサンプルを追加し、50 μ L のサンプル、50 μ L 抗 SP 痛みトレーサー SP EIA 井戸に 50 μ L 抗 SP 抗血清を追加します。
4. キット内で提供されているプラスチック フィルムと CGRP と SP の井戸を封印します。
5. 4 ° C で一晩ウェルズを孵化させなさい
6. CGRP で 5 回洗浄または SP 洗浄バッファー、井戸からすべての残液を取り外します。
7. 対応する EIA キット内で提供されている CGRP や SP の井戸に 200 μ L ・ イールマン試薬を追加します。
8. CGRP 井戸、室温で 30 分間インキュベートし、室温で 90 分 SP 井戸を孵化させなさい。両方の試金のための光から井戸を保護します。
9. 波長 414 nm 帯板を読み、対応する EIA の楽器によると結果を計算します。
   注: すべての時間手で井戸の底に触れたり、レンズ クリーニング ワイプ、Ellman 試薬を追加する前に、井戸の底から水の汚れをきれい。

結果

24 ウェル プレートで培養ラット腰椎 DRG ニューロンは、グリア細胞の増殖を抑制する追加 Ara C と NGF 神経成長をサポートするための培養培地で栽培されました。生活の形態後根神経節細胞が観察されました。図 3に示すように、単一ニューロンの細胞体は日 1 皿の下部に取り付け、観測用に選択されました。軸索の伸長は 1-3 日目から監視されま...

ディスカッション

本稿ではラット腰椎のコレクション、酵素分解、文化紹介 DRG。NGF 神経栄養サポート、DRG ニューロンの軸索は細胞播種後 3 日以内延長。拡張の軸索細胞で細胞細胞体で合成され、軸索線維に沿って運ばれる CGRP タンパク質染色後明確に観測される.日以内のニューロンを囲むこれらの分割のグリア細胞をできるように、拡張も衛星細胞のプロセス。このプロトコルにより成長したプライマリの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)	Virbac	Zoletil 50	anaesthetic
Fetal bovine serum	Biological Industries	04-001-1	Culture Medium
sodium pyruvate	Sigma	S8636	Culture Medium
penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-033-1	Culture Medium
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Culture Medium
Poly-l-lysine	Sigma	P9011	Coating dish
Collagenase IA	Sigma	9001-12-1	Enzyme digestion
Hank's balanced salt solution	Invitrogen	14170-112	Culture Medium
Trypsin EDTA	Biological Industries	03-051-5	Enzyme digestion
Pasteur pipette	Hilgenberg	3150102	Cell trituration
Cytarabine (Ara-C)	Sigma	C6645	Culture Medium
NGF	Millipore	NC011	Culture Medium
NPFFR2 siRNA	Dharmacon	L-099691-02-0005	Transfection
Non-targeting siRNA	Dharmacon	L-001810-10-05	Transfection
NeuroPORTER Reagent	Genlantis	T400150	Transfection reagent
dNPA	Genemed Synthesis	N/A	NPFFR2 agonist
CGRP ELISA	Cayman	589001	EIA
SP ELISA	Cayman	583751	EIA
CGRP antibody	Calbiochem	PC205L	IHC
DAPI	Roche	10236276001	IHC