Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

Resumen

Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.

Resumen

En este protocolo, una proteína de fusión de fluorescencia verde (GFP) de proteína y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción se utilizan para el seguimiento de los cambios de localización subcelular de proteínas; en particular, una translocación nuclear bajo un calor estrés condición. Las proteínas reaccionan señales correspondientemente a internos y externas. Un mecanismo común es cambiar su localización subcelular. Este artículo describe un protocolo para el seguimiento de localización de la proteína que no requieren un anticuerpo etiquetado radiactivo y un microscopio confocal. En este artículo, GFP se utiliza para etiquetar la proteína diana EXL-1 de C. elegans, un miembro de la familia de proteínas (Predescargado) cloruro canal intracelular, incluyendo CLIC4 mamíferos. Una línea transgénica de traslación integrado exl-1::gfp (con un promotor y una secuencia del gen completo) fue creada por transformación y γ-radiación y estable expresa el gene y gfp. Recientes investigaciones demostraron que al estrés por calor, el estrés oxidativo no, EXL-1::GFP se acumula en el núcleo. Superposición de la señal GFP con la estructura de los núcleos y el DAPI señales confirma los cambios de la localización subcelular de EXL-1 bajo estrés. Este protocolo presenta dos métodos de fijación diferentes para tinción DAPI: fijación fijación del etanol y acetona. El protocolo de tinción DAPI presentado en este artículo es rápido y eficiente y conserva la señal GFP y los cambios de localización subcelular de la proteína. Este método sólo requiere un microscopio de epifluorescencia con un filtro DAPI, Nomarski y un filtro FITC. Es conveniente para un ambiente pequeño laboratorio, investigación de estudiante de pregrado, investigación de estudiante de secundaria y aulas de biotecnología.

Introducción

Un cambio de la localización subcelular de la proteína es un mecanismo común en respuesta a señales internas o externas como el estrés por calor, hambre, estrés oxidativo, apoptosis, fosforilación de proteínas y otros. Por ejemplo, estrés por calor induce un miembro FOXO DAF-16 translocación nuclear^1,2y la proteína del BCL-2 pro-apoptótica que BID se transloca a la mitocondria a muerte recibe señalización^3,4. Varias técnicas están disponibles para detectar estos cambios. Una combinación de western blot y aislar bioquímicamente estructuras subcelulares (p. ej., mitocondrias o el núcleo) bien podría alcanzar la meta de³. Sin embargo, requiere un anticuerpo específico contra la proteína de interés. Por lo tanto, un anticuerpo bien establecido se convierte en la clave del éxito. Un enfoque alternativo es rotular diferentes estructuras subcelulares u organelos con diversos marcadores como la proteína de fluorescencia verde (GFP), proteína de la fluorescencia roja (RFP), proteína de fluorescencia amarilla (YFP) y mCherry, y mientras tanto la proteína de la etiqueta interés con otros marcadores. Entonces, los observa bajo un microscopio confocal para localizar los objetivos^5,6. Isótopos radiactivos son una alternativa para el etiquetado de las proteínas de la blanco y entonces detectar su localización subcelular⁷. Sin embargo, este método requiere una formación adecuada y el manejo de desechos radiactivos. En circunstancias como la falta de un anticuerpo específico, la ausencia de un marcador adecuado o el scarceness de equipos como el microscopio confocal, un enfoque alternativo debe ser considerado. Para identificar un desplazamiento nuclear de la proteína, es atractivo solamente etiquetar las proteínas de la blanco con un marcador y para teñir los núcleos con el reactivo químico 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ya que esto sólo requiere un microscopio de fluorescencia regular.

C. elegans de la inmunomarcación con anticuerpos es difícil debido a la baja permeabilidad de la cáscara de huevo o de la cutícula colagenosa que rodea el animal. Mientras tanto, ya que las proteínas de C. elegans son significativamente divergentes de sus ortólogos vertebrados, algunas compañías comerciales proporcionan C. elegans con productos específicos. Es difícil para un pequeño laboratorio generar anticuerpos C. elegans por sí mismos. Los investigadores en la comunidad suelen ser etiquetadas proteínas como marcadores para demostrar una expresión de localización o gen de la proteína. Este artículo utiliza EXL-1::GFP como un ejemplo a seguir un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor⁸. Una traslación integrado exl-1::gfp en el genoma de animales se utiliza para expresar estable el gen con la fusión de gfp . La investigación demostró que exl-1 se expresa en intestino, músculo de la pared del cuerpo y otras estructuras subcelulares⁸. Este protocolo muestra cómo sincronizar los gusanos para el cuarto lugar larvario (L4), realice una calor estrés experimento y conducta tinción DAPI, etanol de la fijación, fijación de acetona y la proyección de imagen en un microscopio de fluorescencia regular.

Protocolo

1. las soluciones

1. Planchas NGM
   1. En un matraz de Erlenmeyer de 2 L, añadir 3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g de peptona y 975 mL de dH₂O. tapa la boca del matraz con papel de aluminio. Autoclave el matraz durante 50 minutos enfriar durante 20-30 minutos.
   2. Luego añadir soluciones estériles: 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de colesterol 5 mg/mL en etanol, 1 mL de 1 M MgSO₄y 25 mL de tampón de 1 M KPO₄ (pH 6.0). Remolino de las soluciones para mezclarlos bien.
   3. Utilizando un dosificador de líquido, dispensar la solución NGM a placas de Petri de 60 mm. Llenado completo de las placas de 2/3 de agar. Guárdelos en un recipiente hermético a 4 º C para uso futuro.
2. Tampón de₄ de KPO de 1 M (pH 6.0)
   1. 10,83 g de KH₂PO₄ y 3,56 g de K₂HPO₄ en dH₂O se disuelven, luego ajuste el volumen total a 100 mL. Autoclave de la solución durante 15 minutos.
3. M9
   1. Disolver 3 g de KH₂PO_4, 6 g de Na₂HPO₄, 5 g de NaCl en dH₂O, añadir 1 mL de 1 M MgSO₄y ajuste el volumen total a 1 L.
4. DAPI de 10 μg/mL
   1. Añadir 1 μl de 10 mg/mL DAPI en 999 μl de dH₂O.
5. alcohol al 95% (v/v)
   1. Mida 95 mL de alcohol al 100% y añada agua destilada para ajustar el volumen a 100 mL.
6. acetona al 30% (v/v)
   1. Añadir 30 mL de acetona a dH₂O y ajuste el volumen total de 100 mL.

2. calor

1. Generar una matriz Extracromosómica con un constructo traslacional de target genes^9,10. También puede obtener tales líneas de centro de genética de Caenorhabditis (CGC), que es un recurso público para la investigación de C. elegans , o de un laboratorio de investigación previamente publicada.
2. Integrar las líneas extracromosómicas en el genoma al exponer los gusanos a 3.800 Rad γ-radiación⁹. A continuación, seleccione las líneas estable expresadas para que cada animal expresa una proteína del marcador como GFP o rodillo.
3. Para eliminar las mutaciones generadas durante la radiación, outcross las líneas por lo menos 2 x. Utilice esta línea transgénica para detectar cambios de patrones de expresión de la proteína bajo estrés.
4. Preparar platos para NGM gusano como se describe en el paso 1.1. Raya un clon OP50 y cultura la bacteria en caldo LB líquido durante la noche. Semilla de las planchas NGM con líquido OP50 cultivan e incuban las placas en una incubadora de 37 ° C durante la noche para crecer un césped de bacterias como fuente de alimento para los gusanos. Enfriar las placas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de su uso.
5. Crecer la línea transgénica a 20 ° C sin hambre durante al menos 2 generaciones antes de la prueba de estrés de calor.
6. Tomar a 8 a 10 jóvenes grávidas (útero llenado de huevos) que una nueva placa de gusano, luego deje que ellos ponen huevos por unos 3 a 5 h y retire a todos los adultos de las placas.
7. Para sincronizar los gusanos, que los huevos se incuban y crecen las larvas de aproximadamente 48 h para el cuarto estadio larvario (L4). Examinar su vulva estructura una media luna para identificar la etapa (figura 1, flecha) L4 del¹¹.
8. Coloque las placas de gusano con las larvas L4 en una incubadora a 35 ° C por 2 – 5 h para alcanzar la tensión de calor. Coloque un termómetro en la incubadora para medir con precisión la temperatura.

3. tinción DAPI

1. Fijación de etanol
   1. Añadir 10 μl del buffer M9 en el centro de un portaobjetos de vidrio.
   2. Recoger los gusanos dio una sacudida eléctrica el calor de paso 2.8 y ponerlos en el buffer M9 en el portaobjetos de cristal.
      1. Por otra parte, lavar la placa con la M9, centrifugar a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Añadir los gusanos a lo portaobjetos de vidrio.
   3. Utilice un pañuelo de papel suave para drenar el exceso de líquido. Ver este paso con un microscopio de disección.
   4. Añadir 10 μl de alcohol 95% en los gusanos y déjelos secar al aire. Ver el proceso con un microscopio de disección y no permita que los animales se seca demasiado. Inmediatamente después de que el etanol se ha evaporado de los animales, proceder al siguiente paso.
      Nota: Etanol se evapora muy rápidamente.
   5. Repita el paso 3.1.4 dos veces para que los gusanos son fijos.
      Nota: Es normal que los animales parecen más oscuros y torcidos.
   6. Añadir 10 μl de DAPI (10 μg/mL) a los gusanos. Inmediatamente cubrir con un cubreobjetos y sellar la diapositiva con esmalte transparente de uñas de gel.
   7. Ve los animales después de alrededor de 10 min en un microscopio de fluorescencia.
2. Fijación de la acetona (un enfoque alternativo)
   1. Lave la placa de calor-dio una sacudida eléctrica de paso 2.8 con M9, centrifugar a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de dH₂O recoger el diábolo y descarte el sobrenadante.
   2. Añadir 400 μL de acetona al 30% para centrifugar a 15 minutos a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Use 500 μl de dH₂O para lavar los animales 2 x. Deseche el sobrenadante.
   3. Añadir 200 μL de DAPI (10 μg/mL), o 4 x la cantidad de volumen de los gusanos total, en el tubo por 15 min.
   4. Centrifugar a 1.000 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado 2 x con 500 μl de dH₂O. colocar las lombrices sobre portaobjetos de vidrio, cubrir con cubre-objetos, sellar la diapositiva con esmalte transparente de uñas gel y observar los animales bajo un microscopio de fluorescencia.

4. microscopio imágenes

1. Encienda la fuente de luz UV y un microscopio de fluorescencia. Encienda la computadora conectada al microscopio.
2. Coloque el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de baja potencia (10 X) para localizar los gusanos, aumentar el poder de magnificación de 400 X y enfocarse en el espécimen.
3. Abra el software provisto con el microscopio. Haga clic en "Adquisición" en el menú; Haga clic en "Cámara" y seleccione la cámara conectada al microscopio; Esto permite que la cámara seleccionada para comunicarse con el software.
   Nota: Diferentes microscopios pueden variar en funcionamiento.
4. En el mismo "adquisición", haga clic en "Adquisición Multidimensional". Esto abre una nueva ventana de navegación "Adquisición Multidimensional". Haga clic en el botón de "Multicanal", y aparecerán todos los canales disponibles.
5. Elegir azul, verde y DIC (contraste diferencial de interferencia) para observar a la muestra. En la ventana de navegación "Adquisición Multidimensional", deja el "Azul DAPI", "Verde-GFP" y "Gris-DIC", "Nomarski" canales Haga clic en otros canales, tales como "Rojo-rodamina" y "campo blanco brillante", para cerrarlas.
6. En primer lugar, medir el tiempo de exposición para cada canal:
   1. Haga clic en el canal "Azul DAPI" para seleccionarla y luego haga clic en "Medida" para tomar una imagen en vivo en el canal DAPI con el tiempo de exposición automática. Aparecerá una nueva ventana con una imagen en vivo.
   2. En el lado izquierdo de la ventana de la imagen en directo, ajustar manualmente el tiempo de exposición si es necesario para que la imagen deseada.
   3. Por último, haga clic en "OK" en la ventana de la imagen en directo. Esto establece el tiempo de exposición en el canal DAPI.
7. Repita el paso 4.6 para los otros canales "Verde-GFP" y "Gris-DIC", "Nomarski", para establecer los tiempos de exposición para los canales.
8. En la ventana de navegación "Adquisición Multidimensional", haga clic en "Start" para recoger automáticamente 3 imágenes en los 3 distintos canales en orden (véase arriba) con tiempos de exposición específicos como conjunto.
9. Para guardar el archivo, vaya al menú principal, haga clic en "File" luego en "Guardar como". Entrada de nombre de archivo y el nombre de carpeta. Guarde el archivo como el formato de archivo predeterminado para preservar la información detallada de la proyección de imagen para futuras referencias.
10. Para exportar archivos en otros formatos:
    1. Vaya a "Archivo" y haga clic en "Exportar". Se abrirá una ventana de configuración de exportación.
    2. Establecer nombre de archivo y carpeta. Consulte "Crear una carpeta de proyecto" para mejor organiza los datos. El software también permite al usuario especificar 4 otras opciones: "Generar combinado imágenes", "Usar color para imágenes de canal", "Nombres de canales de uso" y "Sólo para la imagen combinada".
    3. Elija un tipo de archivo deseado en el menú desplegable, como "TIF", "BMP", "PSD", o "JPG" y otros tipos. Haga clic en "Start" exportar.

Resultados

Cloruro canal intracelular proteínas (CLIC) son proteínas multifuncionales que están muy conservadas entre especies¹². Muchas investigaciones se muestran que Predescargado regula el estrés celular, autofagia, apoptosis, carcinogénesis, angiogénesis y la respuesta inmune innata de macrófagos en el sistema mamífero^{13,14,15,16 ...}

Discusión

Este artículo presenta un método rápido y eficiente para verificar cambios subcelular de proteínas desde el citoplasma al núcleo. La expresión de la proteína fue demostrada por la fusión de GFP, mientras que la estructura del núcleo se verificó por DAPI tinción (figura 3). Desde proteínas de C. elegans inmunotinción es desafiante, más localizaciones subcelulares proteína de C. elegans se caracterizan por etiquetado con proteínas marcadoras como GFP, Laz, mCh...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Biotium	40043	both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50	CGC	OP50	https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC)			https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe	Kimberly-Clark Corporation		soft tissue
Zeiss  AX10	Zeiss		fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8	Zeiss		microscope software
AxioCam MR Rev3	Zeiss		digital camera
Incubator
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick