Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans

Résumé

Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.

Résumé

Dans ce protocole, une protéine de fusion de protéine (GFP) fluorescence verte et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration sont utilisés pour suivre les changements de localisation subcellulaire de protéine ; en particulier, une translocation nucléaire sous une chaleur stress condition. Les protéines réagissent signaux proportionnellement aux internes et externes. Un mécanisme commun est de changer sa localisation subcellulaire. Cet article décrit un protocole afin de suivre la localisation des protéines qui ne nécessite pas un anticorps, marquage radioactif ou un microscope confocal. Dans cet article, GFP est utilisé pour marquer la protéine cible EXL-1 chez c. elegans, un membre de la famille de protéines (CLICs) intracellulaire canal chlorure, y compris les mammifères CLIC4. Une lignée transgénique intégré translationnelle exl-1::gfp (avec un promoteur et une séquence de gène complet) a été créée par la transformation et le rayonnement γ et stablement exprime le gène et la gfp. Des recherches récentes ont montré que, lors de stress thermique, stress oxydatif pas, EXL-1::GFP s’accumule dans le noyau. Chevauchement avec la structure des noyaux et le DAPI, le signal de GFP signaux confirme les changements de localisation sous-cellulaire EXL-1 sous contrainte. Ce protocole présente deux méthodes différentes de fixation pour la coloration DAPI : fixation de l’éthanol et la fixation de l’acétone. Le protocole de coloration DAPI présenté dans cet article est rapide et efficace et préserve aussi bien le signal de la GFP et les changements de localisation sous-cellulaire des protéines. Cette méthode nécessite seulement un microscope à fluorescence avec Nomarski, un filtre FITC et un filtre DAPI. Il est adapté pour le petit laboratoire, étudiant en Master recherche, recherche étudiant de lycée et classes de biotechnologie.

Introduction

Un changement de localisation subcellulaire des protéines est un mécanisme commun en réponse aux signaux internes ou externes, tels que le stress thermique, famine, stress oxydatif, l’apoptose, la phosphorylation des protéines et d’autres. Par exemple, un stress thermique induit un membre FOXO DAF-16 translocation nucléaire^1,2et la protéine BCL-2 pro-apoptotiques que BID translocation vers les mitochondries à mort récepteur signalisation^3,4. Il existe plusieurs techniques détecter ces changements. Une combinaison de western blot et biochimiquement isoler des structures subcellulaires (p. ex., les mitochondries ou les noyaux) pourrait bien atteindre l’objectif³. Cependant, elle nécessite un anticorps spécifique contre la protéine d’intérêt. Ainsi, un anticorps bien établi devient la clé de la réussite. Une autre approche consiste à étiqueter les différentes structures subcellulaires ou organites avec des marqueurs différents tels que la protéine de fluorescence verte (GFP), protéine de fluorescence rouge (DP), protéine de fluorescence jaune (YFP) et mCherry et l’étiquette dans le même temps la protéine de intérêt avec les autres marqueurs. Ensuite, les observer sous un microscope confocal de localiser les cibles^5,6. Isotopes radioactifs sont une alternative de choix pour l’étiquetage des protéines cibles et détection puis leur localisation subcellulaire⁷. Toutefois, cette méthode requiert une formation adéquate et la gestion des déchets radioactifs. Dans des circonstances telles que l’absence d’un anticorps spécifique, l’absence d’un bon marqueur, ou le manque d’équipement, comme un microscope confocal, une autre approche doit être examinée. Pour identifier une translocation nucléaire de protéine, il est attirant pour marquer uniquement les protéines cibles avec un marqueur et pour colorer les noyaux avec le réactif chimique 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) puisqu’il suffit d’un microscope à fluorescence ordinaire.

Immunomarquage c. elegans avec des anticorps est un défi en raison de la faible perméabilité de la cuticule de collagène qui entourent l’animal ou la coquille de l’oeuf. Pendant ce temps, étant donné que les protéines de c. elegans sont significativement différentes des leurs orthologues vertébrés, quelques sociétés commerciales fournissent c. elegans avec des produits spécifiques. Il est difficile pour un petit laboratoire à produire des anticorps de c. elegans pour eux-mêmes. Chercheurs dans la communauté utilisent souvent les protéines étiquetées comme marqueurs pour démontrer une expression de localisation ou de gène de protéine. Cet article utilise EXL-1::GFP par exemple pour suivre une translocation nucléaire de protéines sous stress de chaleur⁸. Une translation intégré exl-1::gfp dans le génome de l’animal sert à stablement expriment le gène de fusion de gfp . Recherche a montré que exl-1 est exprimé dans l’intestin, muscle de la paroi corporelle et autres structures subcellulaires⁸. Ce protocole montre comment synchroniser vers le quatrième stade larvaire (L4), effectuer une chaleur stress experiment et conduite coloration DAPI, éthanol de fixation, fixation de l’acétone et l’imagerie sous un microscope à fluorescence ordinaire.

Protocole

1. les solutions

1. Plaques NGM
   1. Dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L, ajouter 3 g de NaCl, 17 g de gélose, 2,5 g de Peptone et 975 mL de dH₂O. la couverture de l’embouchure de la fiole avec du papier aluminium. Autoclave le flacon pour 50 min. refroidir pendant 20 à 30 min.
   2. Ajouter ensuite des solutions stérilisées : 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL dans de l’éthanol, 1 mL de 1 M MgSO₄et 25 mL de tampon de₄ (pH 6.0) KPO 1 M. Agiter les solutions pour bien les mélanger.
   3. En utilisant un distributeur de liquide, ajouter la solution NGM pour plats de Pétri de 60 mm. Remplissage des plaques de 2/3 plein d’agar. Entreposez-les dans un contenant hermétique à 4 ° C pour une utilisation future.
2. Tampon de₄ M 1 KPO (pH 6.0)
   1. Dissoudre 10,83 KH₂PO₄ et 3,56 g K₂HPO₄ dH₂O, puis ajustez le volume total à 100 mL. Autoclave la solution pendant 15 minutes.
3. M9
   1. Dissoudre 3 g de KH₂PO_4, 6 g de Na₂HPO₄, 5 g de NaCl dans dH₂O, ajouter 1 mL de 1 M MgSO₄et ajuster le volume total de 1 L.
4. 10 µg/mL DAPI
   1. Ajouter 1 µL de 10 mg/mL DAPI dans 999 µL de dH₂O.
5. alcool à 95 % (v/v)
   1. Mesurer 95 mL d’alcool à 100 % et ajouter de l’eau distillée pour régler le volume à 100 mL.
6. acétone 30 % (v/v)
   1. Ajouter 30 mL d’acétone à dH₂O et ajuster le volume à 100 mL.

2. Stress thermique

1. Générer une ligne de tableau extrachromosomique dont une construction translationnelle des gènes de cible^9,10. Également obtenir ces lignes de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG), qui est une ressource publique pour la recherche de c. elegans , ou d’un laboratoire de recherche déjà publiés.
2. Intégrer les lignes extrachromosomiques dans le génome en exposant les vers à 3 800 rayonnement γ Rad⁹. Ensuite, sélectionnez les lignes stablement expresses afin que chaque animal exprime une protéine marqueur tel qu’un GFP ou rouleau.
3. Pour supprimer les mutations générées pendant le rayonnement, croiser les lignes au moins 2 x. Cette lignée transgénique permet de détecter les changements de modèle expression protéiques sous contrainte.
4. Préparer les plaques ver NGM comme indiqué au point 1.1. Ensemencer un clone OP50 et culture de la bactérie dans un bouillon LB liquide du jour au lendemain. Graines les plaques NGM avec liquide OP50 culture et incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit à cultiver une pelouse de bactéries comme source de nourriture pour les vers. Refroidir les plaques à température ambiante pendant au moins 30 min avant utilisation.
5. Cultiver la lignée transgénique à 20 ° C sans faim au moins 2 générations avant le test de stress de chaleur.
6. Choisissez 8 à 10 jeunes adultes gravides (utérus rempli d’oeufs) pour une nouvelle plaque de ver, puis laissez les pondent des œufs pendant environ 3 à 5 h et retirer les plaques de tous les adultes.
7. Pour synchroniser les vers, laissez les œufs éclosent et poussent les larves pendant environ 48 h au quatrième stade larvaire (L4). Examiner leur structure de la vulve (une structure de demi-lune) afin d’identifier le L4 stade (Figure 1, flèche)¹¹.
8. Placer les plaques de ver avec la larve L4 dans une étuve à 35 ° C pendant 2 à 5 h atteindre le stress thermique. Placez un thermomètre dans la couveuse pour mesurer avec précision la température.

3. la coloration DAPI

1. Fixation de l’éthanol
   1. Ajouter 10 µL de tampon M9 dans le centre d’une lame de verre.
   2. Choisir les vers un choc thermique de l’étape 2.8 et placez-les dans le tampon de M9 sur la lame de verre.
      1. Vous pouvez également laver la plaque avec le M9, il centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Ajouter les vers à la lame de verre.
   3. Utiliser un linge doux pour vider tout le liquide en excès. Regarder cette étape sous un microscope à dissection.
   4. Ajouter 10 µL d’alcool à 95 % sur les vers et les laisser sécher à l’air. Regarder le processus sous un microscope à dissection et ne laissez pas les animaux deviennent trop secs. Immédiatement après que l’éthanol est évaporé des animaux, passez à l’étape suivante.
      Remarque : L’éthanol s’évapore très rapidement.
   5. Répétez l’étape 3.1.4 deux fois afin que les vers sont fixes.
      Remarque : Il est normal que les animaux semblent plus sombres et déformée.
   6. Ajouter 10 µL de DAPI (10 µg/mL) à la worms. Immédiatement, recouvrir d’un lamelle couvre-objet et sceller la diapositive avec gel vernis à ongles transparent.
   7. Découvre les animaux après environ 10 min sur un microscope à fluorescence.
2. Fixation de l’acétone (une autre approche)
   1. Laver la plaque de choc thermique de l’étape 2.8 avec M9, il centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Laver le culot avec 1 mL de dH₂O, percevoir le culot et éliminer le surnageant.
   2. Ajouter 400 µL d’acétone 30 % pendant 15 min. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Permet de laver les animaux 2 500 µL de dH₂O x. Jeter le surnageant.
   3. Ajouter 200 µL de DAPI (10 µg/mL), ou 4 fois le montant du volume du ver total, dans le tube pendant 15 min.
   4. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min et éliminer le surnageant. Laver le culot 2 x avec 500 µL de dH₂O. Placer les vers sur lames de verre, couvrez-les avec lamelles couvre-objet, sceller la diapositive avec le vernis à ongles transparent gel et observer les animaux sous un microscope à fluorescence.

4. microscopique imagerie

1. Allumez la source de lumière UV et un microscope à fluorescence. Allumez l’ordinateur connecté au microscope.
2. Chargez la lame sur le microscope à fluorescence. Un objectif de faible puissance (10 X) permet de localiser les vers, augmenter la puissance de grossissement 400 X et se concentrer sur le spécimen.
3. Ouvrez le logiciel fourni avec le microscope. Cliquez sur « Acquisition » dans le menu ; Cliquez sur « Appareil photo » et sélectionnez la caméra connectée au microscope ; Cela permet à la caméra sélectionnée communiquer avec le logiciel.
   Remarque : Les différents microscopes peuvent varier dans l’opération.
4. Sous la même « Acquisition », cliquez sur « Acquisition multidimensionnelle ». Cela ouvre une nouvelle fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle ». Cliquez sur le bouton « Multicanal », et tous les canaux disponibles apparaîtra.
5. Choisissez le bleu, le vert et DIC (contraste interférentiel différentiel) pour observer l’échantillon. Dans la fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle », laissez le « Blue-DAPI », « Vert-GFP » et « Gris-DIC », « Nomarski » canaux Faites un clic droit sur d’autres chaînes, telles que « Red-rhodamine » et « champ blanc brillant », pour les fermer.
6. Tout d’abord, mesurer le temps d’exposition pour chaque canal :
   1. Cliquez sur le canal « Bleu-DAPI » pour le sélectionner puis cliquez sur « Mesure » afin de prendre une image en direct sous la manche DAPI avec la durée d’exposition automatique. Une nouvelle fenêtre avec une image en direct apparaîtra.
   2. Sur le côté gauche de la fenêtre de l’image en direct, ajuster manuellement la durée d’exposition si nécessaire pour rendre l’image comme vous le souhaitez.
   3. Enfin, cliquez sur " "OK » dans la fenêtre de l’image en direct. Ceci définit le temps d’exposition sous le canal DAPI.
7. Répétez l’étape 4.6 pour les autres chaînes, « Green-GFP » et « Gris-DIC », « Nomarski », de mettre en place les temps d’exposition pour ces chaînes.
8. Dans la fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle », cliquez sur « Démarrer » pour recueillir automatiquement des 3 images sous les 3 différents canaux dans l’ordre (voir ci-dessus) avec des durées d’exposition spécifiques énoncés.
9. Pour enregistrer le fichier, allez dans le menu principal, cliquez sur « Fichier » puis sur « Enregistrer sous ». Nom du fichier d’entrée et le nom du dossier. Enregistrez le fichier sous le format de fichier par défaut pour conserver les informations détaillées d’imagerie pour référence ultérieure.
10. Pour exporter le fichier dans d’autres formats :
    1. Allez dans « Fichier » et cliquez sur « Export ». Cela va ouvrir une fenêtre de réglage d’exportation.
    2. Définissez le nom de fichier et de dossier. Cochez « Créer un dossier de projet » afin de mieux organise les données. Le logiciel permet également l’utilisateur de spécifier 4 autres options : « Generate fusionnée images », « Utiliser la couleur pour les images de canal », « Utiliser des noms de canal » et « L’image fusionnée seulement ».
    3. Choisissez un type de fichier souhaité dans le menu déroulant, comme « TIF », « BMP », « PSD », ou « JPG » et d’autres types. Cliquez ensuite sur « Start » pour l’exportation.

Résultats

Les protéines intracellulaires canal chlorure (CLIC) sont des protéines multifonctionnelles qui sont hautement conservées entre espèces¹². Beaucoup de recherches montre que les CLICs régulent le stress cellulaire, autophagie, apoptose, carcinogenèse, l’angiogenèse et la réponse immunitaire innée de macrophages dans le système des mammifères^13,14,15,...

Discussion

Cet article présente une méthode rapide et efficace pour vérifier les modifications subcellulaire protéique du cytoplasme au noyau. L’expression de la protéine a été montrée par une fusion de GFP, tandis que la structure du noyau a été vérifiée par DAPI coloration (Figure 3). Immunomarquage c. elegans protéines étant difficile, la plupart localisations subcellulaires de la protéine c. elegans sont caractérisées par leur marquage avec des protéines de mar...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Biotium	40043	both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50	CGC	OP50	https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC)			https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe	Kimberly-Clark Corporation		soft tissue
Zeiss  AX10	Zeiss		fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8	Zeiss		microscope software
AxioCam MR Rev3	Zeiss		digital camera
Incubator
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick