Análisis de N- glicanos de Raphanus sativus variedades usando PNGasa H+

Resumen

Describimos un método simple y rápido para la preparación y análisis de N- glicanos de diferentes variedades de rábano (Raphanus sativus).

Resumen

En los últimos años, las moléculas de hidratos de carbono de las plantas han recibido considerable atención, ya que son una fuente potencial de respuesta inmune cruz-reactivo, que provoca la alergia. Además, estructuras de hidratos de carbono también juegan un papel fundamental en el metabolismo vegetal. Aquí, presentamos un método simple y rápido para la preparación y análisis de N- glicanos de diferentes variedades de rábano (Raphanus sativus) con un N- glycanase específico para la liberación de las estructuras de carbohidratos de origen vegetal. Para lograr esto, los precipitados de homogenados de rábano crudo ácido tricloroacético fueron tratados con PNGasa H⁺y etiquetados utilizando 2-Aminobenzamida como una etiqueta fluorescente. Las etiqueta N- glycan muestras posteriormente fueron analizadas por ultra rendimiento cromatografía líquida (UPLC) separación e ionización-tiempo de desorción láser asistida por matriz de la espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF) para un detallado estructural evaluación y cuantificar abundancies relativos de las estructuras derivadas de rábano N- glicanos. Este protocolo también puede utilizarse para el análisis de N- glicanos de varias otras especies de plantas y puede ser útil para la investigación adicional de la función y los efectos de N- glicanos en la salud humana.

Introducción

N- glycans en plantas han atraído la atención creciente en los últimos años, como la investigación anterior ha puesto de manifiesto N- glicanos como una fuente potencial de reacciones cruzadas inmunológicas que pueden provocar las respuestas alérgicas^1,2 . Se ha demostrado previamente que N- glycans en glicoproteínas vegetales pueden afectar actividad catalítica^3,4, termoestabilidad y plegable de^5,6 o localización subcelular y secreción⁷. Con el fin de correlacionar las estructuras glicanos con sus respectivas funciones, N- glycans debe primero liberarse de glicoproteínas enzimático o químicamente. El método químico clásico para la liberación de N- y O- glicanos es β-eliminación, en la cual tratamiento alcalino de la muestra se acompaña de reducción con hidruro de boro para producir un alditol⁸. Sin embargo, este procedimiento impide etiquetar con un fluoróforo y causa decaimiento significativo de unidades de monosacárido del extremo reductor de la estructura de glicanos. Deglycosylation química basada en el tratamiento de carbonato de hidróxido de amonio es también un método alternativo utilizado⁹. Ninguno de estos métodos de liberación químico degrada proteínas intactas, que permite el análisis de espectrometría de masa de glicanos piscinas sin la interferencia de los fragmentos de péptido en el mismo rango de masa. Sin embargo, una desventaja de estos métodos es la tasa de degradación creciente de α1, 3 fucosylated N- glycans, una estructura común de carbohidratos encontrados en las plantas¹⁰. Como alternativa, métodos de liberación enzimática utilizando péptidos:N- glicanasas (PNGases, EC 3.5.1.52) se aplican también extensamente. Recombinante PNGasa F (de Flavobacterium meningosepticum) es la opción más común y permite la liberación de todos los tipos de N- glicanos, excepto las estructuras teniendo un núcleo α1, fucosa 3^11,12. Por lo tanto, A PNGasa (aislada de semillas de almendra) se utiliza generalmente para el análisis de planta N- glycans¹³. Sin embargo, esta enzima deglycosylates sólo proteolytically derivados de glicopéptidos y es incapaz de deglycosylate nativo glicoproteínas¹⁴. Por lo tanto, es necesaria un workup muestra varios pasos antes de análisis, que causa pérdida extensa de glycans, especialmente aquellos de baja abundancia¹⁵. El objetivo del método es presentar un flujo de trabajo optimizado para el lanzamiento de N- glicanos y fluorescencia de etiquetado de una manera sencilla y robusta. La lógica subyacente es que PNGasa H⁺, que fue descubierto recientemente en Terriglobus roseus y puede ser por vía recombinante expresada en e. coli, puede hidrolizar N- glycans directamente desde el andamio de proteínas en ácidos condiciones¹⁶. Una ventaja clave de usar PNGasa H⁺ sobre métodos alternativos es que reacciones Etiquetadoras fluorescentes se pueden realizar en el mismo tubo de reacción sin modificar la reacción buffers^17,18. Las condiciones de preparación simple y alta recuperación de baja abundancia oligosacáridos hacen este método una valiosa herramienta en el análisis de N- glicanos. Este protocolo es adecuado para el análisis de N- glicanos de varias especies de plantas.

Protocolo

1. muestras

1. Adquirir diferentes variedades de fresco rábano (Raphanus sativus L.).

2. aislamiento de proteína de rábano

1. Homogeneizar aproximadamente 100 g de rábanos frescos con una licuadora de cocina durante 10 minutos.
2. Transferir la mezcla a un tubo de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 20 min eliminar el material insoluble.
3. Transferir el sobrenadante con cuidado en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL y añadir un volumen igual de solución de ácido tricloroacético (TCA) de 2 M.
   Nota: Agregar TCA precipita soluble (glico) proteínas.
4. Centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 30 min y retire el sobrenadante de las concentrados (glico) proteínas.
5. Lavar el precipitado con 20 mL de agua desionizada y centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 5 min eliminar polisacáridos y oligosacáridos solubles.
6. Repita el paso 2.5. cuatro veces.
7. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de agua desionizada y transfiéralo a un tubo de centrífuga 1.5ml fresco.

3. preparación de N- glicanos

1. Mezcle 50 μl de solución de proteína de paso 2.7. (equivalente a 5 g de rábanos frescos) con 0,2 mU de recombinante PNGasa H⁺ en 10 mM de ácido acético.
2. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C por 12 h. Después de la incubación, centrifugar a 14.000 × g por 5 minutos quitar la proteína adicional y enzima.
3. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga 1.5ml fresco.

4. purificación de N- glicanos

1. Preparar la columna de extracción en fase sólida (SPE) para enriquecer los N- glicanos y quitar sales y otras impurezas de la mezcla de reacción, aumentando la selectividad del fluorógenos 2-Aminobenzamida (2-AB) etiquetado agente de N- glicanos derivatización.
   1. Añadir 3 mL de agua desionizada para lavar la columna.
   2. Añadir 3 mL de acetonitrilo 80% solución de ácido trifluoroacético (TFA, 0.1% v/v) para activar la columna SPE.
   3. Añadir 3 mL de agua desionizada para equilibrar la columna SPE.
2. Transferir la muestra en el paso 3.3 a la columna y descartar el flujo a través.
3. Añadir 1,5 mL de agua desionizada para lavar la columna y descartar el flujo a través.
4. Eluir los N- glicanos liberados de la columna con 1,5 mL de solución acuosa de acetonitrilo 20%, que contiene 0.1% TFA (v/v) en un tubo de centrífuga de 2 mL.
5. Quitar el solvente por evaporación centrífugo a temperatura ambiente. Evaporar hasta que la muestra esté completamente seca.

5. fluorescencia derivatización de N- glicanos

1. Preparar 1 mL de solución 2-AB, que consta de 35 mM 2-AB y 0.1 M cianoborohidruro de sodio en solución de ácido acético/sulfóxido de dimetil (7:3, v/v).
2. Añadir 5 μl de solución 2-AB para las muestras secadas (paso 4.5.) deriva de seis diferentes rábanos. Vortex cada muestra hasta que totalmente disuelto.
3. Incubar la mezcla por 2 h a 65 ° C.
4. Deje enfriar el muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos y añadir 5 μl de agua desionizada y 40 μl de acetonitrilo. Centrifugar los tubos a 14.000 x g durante 3 minutos.
5. Transferir 48 μl del sobrenadante en un frasco HPLC de alta recuperación μl 300. Almacenar las derivatizados N- glycan muestras a-20 ° C hasta por un mes.

6. HILIC UPLC perfiles de N- glicanos

1. Analizar las muestras usando un sistema UPLC estándar conectado a un detectorset de fluorescencia en línea en las longitudes de onda de excitación/emisión de 330 nm/420 nm, respectivamente.
2. Utiliza una cromatografía de líquidos de interacción hidrofóbica (HILIC)-columna de glicanos UPLC a una temperatura de columna de 60 ° C para el análisis.
3. Preparar A solvente diluyendo 50 mL de solución madre (solución de formiato de amonio de 1 M, pH 4,5) con 950 mL de líquido cromatografía-espectrometría de masas (LCMS)-grado de agua. Prepare la solución como sigue:
   1. Añadir 43 mL de ácido fórmico a 700 mL de LCMS-grado H₂O.
   2. Ajustar el pH a 4.5 por adición gota a gota de solución de amoníaco acuosa (25% w/w).
   3. Transferir el solvente a una probeta y llenar hasta 1000 mL con LCMS-grado H₂O. almacenar a 4-6 ° C hasta por 3 meses.
4. Utilizar acetonitrilo grado LCMS como solvente B.
5. N- glycans se separan con la siguiente elución gradiente:
   1. Comience agregando el 95% de disolvente B en solvente A. Ajuste la velocidad de flujo de 0,5 mL/min de 0 min 44,5.
   2. Del minuto 0 al minuto 6, disminuyen progresivamente la proporción del disolvente B % to78 gradiente lineal.
   3. De 6 min a min 44,5, disminuyen progresivamente la proporción del disolvente B con un degradado lineal a 55,9%.
   4. De min min 46,5 44,5, rápidamente disminuir la proporción de solvente B con un degradado lineal de 55,9% a 0% y mantener en 0% por 2 min e iniciar lavado de la columna. Reducir la tasa de flujo de 0.25 mL/min de 44,5 a 55 min.
   5. Lavar la columna adicional incrementando el disolvente B a 95% de min min 50,5 48,5 y sostenga en el 95% de 4.5 min.
   6. Volver a equilibrar la columna para las condiciones iniciales de 95% de disolvente B en 0.5 mL/min de 50.5 a min 57.
6. Inyectar al sistema UPLC 45 μl de la muestra.
7. Eluir los N- glicanos por UPLC con tiempos de retención entre 15 y 40 minutos.
8. Recoger cada fracción de pico UPLC observado usando tubos de centrífuga de 2 mL y secar las muestras por evaporación centrífugo.
9. Inyectar aproximadamente 1 pmol de etiquetado estándar de dextrano (2−20 unidades de glucosa) para calibrar la plantaN- glycan perfiles y asignar los tiempos de elución en unidades de glucosa estandarizada 2-AB.

7. uso de MALDI-TOF MS análisis

1. Disuelva las muestras de paso 6.8 en 5 μl de LCMS-agua de grado. Mezclar 1 μl de la solución de muestra y 1 μl de la solución de (ATT) (0,3% w/v en acetonitrilo acuoso 70% v/v) 6-aza-2-thiothymine y pipeta de la mezcla en el portamuestra de MALDI-TOF.
2. Analizar las muestras usando un instrumento de espectrómetro de masas MALDI-TOF en ion positivo modo presionando el botón Start .
3. Analizar los espectros de masas mediante el software de análisis de MALDI-TOF-MS que lo acompaña.
4. Interpretar los espectros utilizando un código abierto glycan interpretación software¹⁹. Definir los parámetros de búsqueda para 2-AB etiquetado [M + Na]⁺y establecer el parámetro de exactitud Da 2.0.

Resultados

La figura 1 muestra una descripción esquemática del protocolo descrito, incluyendo el aislamiento de (glico) proteínas de rábano, la preparación de N- glicanos, el análisis UPLC y el MALDI-TOF-MS en análisis de estos componentes. La figura 2 muestra representativos cromatogramas UPLC de N- glycans derivatizados de los cultivares analizados rábano. La figura 3 muestra los res...

Discusión

El protocolo que hemos presentado aquí permite la comparación de los N- glicanos perfiles de distintas variedades de rábano. Una importante ventaja de este método en comparación con los protocolos existentes es que no hay cambios de tampón entre la liberación enzimática de N- glicanos y la reacción de derivatización con 2 AB son necesarios. El paso más crítico de este procedimiento es la purificación de N- glycans utilizando la columna SPE, como fracaso para eliminar las sales o im...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080