Analisi di N- glicani da Raphanus sativus cultivar utilizzando PNGasi H+

Riepilogo

Descriviamo un metodo semplice e veloce per la preparazione e l'analisi di N- glicani da diverse cultivar di ravanello (Raphanus sativus).

Abstract

Negli ultimi anni, le moiety carboidrati delle piante hanno ricevuto una notevole attenzione, sono una fonte potenziale di cross-reattivi, provocando Allergia risposte immunitarie. Inoltre, strutture di carboidrati anche giocare un ruolo critico nel metabolismo vegetale. Qui, presentiamo un metodo semplice e veloce per la preparazione e l'analisi di N- glicani da diverse cultivar di ravanello (Raphanus sativus) usando un N- glycanase specifici per il rilascio delle strutture di carboidrati vegetali. Per raggiungere questo obiettivo, greggio acido tricloroacetico precipitati di ravanello omogeneati erano trattati con PNGasi H⁺ed etichettati utilizzando 2-aminobenzamide come un tag fluorescente. Con etichetta N- glycan campioni sono stati successivamente analizzati da altissime prestazioni cromatografia liquida (UPLC) separazione e matrix-assisted laser desorption ionizzazione-tempo di spettrometria di massa (MALDI-TOF) volo per una dettagliata strutturale valutazione e di quantificare il relativo abundancies di ravanello-derivati N- glycan strutture. Questo protocollo può essere utilizzato anche per l'analisi di N- glicani da varie altre specie di piante e può essere utile per ulteriori indagini della funzione e gli effetti di N- glicani sulla salute umana.

Introduzione

N- glicani in piante hanno attirato l'attenzione aumentata negli ultimi anni, come la ricerca precedente ha evidenziato N- glicani come una potenziale fonte di reazioni crociate immunologiche che può provocare reazioni allergiche^1,2 . È stato dimostrato in precedenza che N- glicani su glicoproteine vegetali può influire sulle attività catalitica^3,4, termostabilità e pieghevole^5,6 o localizzazione subcellulare e secrezione⁷. Al fine di correlare le strutture glycan con le rispettive funzioni, N- glicani deve essere rilasciata prima da glicoproteine chimicamente o enzimaticamente. Il classico metodo chimico per il rilascio di N- e O- glicani è β-eliminazione, in cui il trattamento alcalino campione è accompagnata da riduzione con boroidruro di cedere un alditol⁸. Tuttavia, questa procedura preclude etichettatura con un fluoroforo e causa decadimento significativo di unità monosaccaridiche dall'estremità riducente della struttura glycan. Deglycosylation chimico basato su carbonato di ammonio idrossido/trattamento è anche un metodo alternativo comunemente usato⁹. Nessuno di questi metodi di rilascio chimico degrada le proteine intatte, che permette l'analisi di spettrometria di massa di adenoide glycan piscine senza l'interferenza di frammenti peptidici nello stesso intervallo di massa. Tuttavia, uno svantaggio di questi metodi è il tasso di degradazione aumentata di α1, 3-fucosylated N- glicani, una struttura comune di carboidrato trovata in piante¹⁰. In alternativa, i metodi di rilascio enzimatico utilizzando peptide:N- glycanases (PNGases, CE 3.5.1.52) sono anche ampiamente applicato. Ricombinante PNGasi F (da Flavobacterium meningosepticum) è la scelta più comune e permetta la liberazione di tutti i tipi di N- glicani, tranne le strutture recanti un nucleo α1, fucosio 3^11,12. Pertanto, PNGasi A (isolato da semi di mandorla) viene solitamente utilizzato per l'analisi della pianta N- glicani¹³. Tuttavia, questo enzima deglycosylates solo proteoliticamente-derivati glicopeptidi ed è in grado di deglycosylate nativo glicoproteine¹⁴. Quindi, un workup di multi-step campione è richiesto prima di ulteriori analisi, che provoca perdita di glicani, specialmente quelli di abbondanza bassa¹⁵. L'obiettivo generale del metodo è di presentare un workflow ottimizzato per N- glycan rilascio e fluorescenza etichettatura in modo semplice e robusto. La logica sottostante è che PNGasi H⁺, che è stato recentemente scoperto in Terriglobus roseus e può essere recombinantly espresso in e. coli, possono idrolizzare N- glicani direttamente dal patibolo della proteina in acidi condizioni¹⁶. Un vantaggio chiave di utilizzo rispetto ai metodi alternativi di PNGasi H⁺ è che le reazioni d'etichettatura fluorescente possono essere eseguite nello stesso tubo di reazione senza modificare il buffer di reazione^17,18. Le condizioni di preparazione semplice e alto recupero di basso-abbondanza oligosaccaridi fanno di questo metodo un prezioso strumento nell'analisi di N- glicani. Questo protocollo è adatto per l'analisi di N- glicani da varie specie di piante.

Protocollo

1. raccolta del campione

1. Acquistare diverse cultivar di fresco ravanello (Raphanus sativus L.).

2. isolamento della proteina dal ravanello

1. Omogeneizzare circa 100 g di ravanello fresco con un frullatore di cucina per 10 min.
2. Trasferire l'impasto per un tubo di centrifuga da 50 mL e centrifugare a 14.000 × g a 4 ° C per 20 minuti rimuovere il materiale insolubile.
3. Trasferire il surnatante con attenzione in una nuova provetta da centrifuga 50 mL e aggiungere un volume equivalente di soluzione di acido tricloroacetico (TCA) di 2 M.
   Nota: L'aggiunta di TCA precipiterà solubile (glico) proteine.
4. Centrifugare a 14.000 × g a 4 ° C per 30 min e rimuovere il surnatante da pellettato (glico) proteine.
5. Lavare la pallina con 20 mL di acqua deionizzata e centrifugare a 14.000 × g a 4 ° C per 5 min rimuovere polisaccaridi e oligosaccaridi solubili.
6. Ripetere il punto 2.5. quattro volte.
7. Risospendere il pellet in 1 mL di acqua deionizzata e trasferimento in una provetta da centrifuga fresca 1,5 mL.

3. preparazione di N- glicani

1. Mix 50 µ l della soluzione di proteina dal punto 2.7. (pari a 5 g di ravanello fresco) con 0,2 mU di ricombinante PNGasi H⁺ in acido acetico 10 mM.
2. Incubare a 37 ° C per 12 h, la miscela di reazione. Dopo l'incubazione, centrifugare a 14.000 × g per 5 min rimuovere le proteine extra e degli enzimi.
3. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca 1,5 mL.

4. purificazione di N- glicani

1. Preparare la colonna di estrazione in fase solida (SPE) per arricchire gli N- glicani e rimuovere i sali ed altre impurità dalla miscela di reazione, aumentare la selettività dell'agente d'etichettatura fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) per N- glycan derivatizzazione.
   1. Aggiungere 3 mL di acqua deionizzata per lavare la colonna.
   2. Aggiungere 3 mL di soluzione di acetonitrile 80% contenente acido trifluoroacetico (TFA, 0.1% v/v) in attivo la SPE-colonna.
   3. Aggiungere 3 mL di acqua deionizzata per equilibrare la SPE-colonna.
2. Trasferire il campione dal punto 3.3 sulla colonna e scartare il flusso continuo.
3. Aggiungere 1,5 mL di acqua deionizzata per lavare la colonna e scartare il flusso continuo.
4. Eluire il N- glicani rilasciato dalla colonna utilizzando 1,5 mL di soluzione acquosa al 20% acetonitrile, contenente 0,1% TFA (v/v) in una provetta da centrifuga da 2 mL.
5. Rimuovere il solvente per evaporazione centrifuga a temperatura ambiente. Evaporare fino a quando il campione è completamente asciutto.

5. fluorescenza derivatizzazione di N- glicani

1. Preparare 1 mL di soluzione 2-AB, composto da 35 mM 2-AB e 0,1 M cianoboroidruro di sodio in soluzione di acido acetico/solfossido dimetilico (7:3, v/v).
2. Aggiungere 5 µ l di soluzione di 2-AB ai campioni secchi (passo 4.5.) derivati da sei differenti ravanelli. Vortex ciascun campione fino a quando completamente sciolto.
3. Incubare la miscela per 2 ore a 65 ° C.
4. Lasciate raffreddare il campione a temperatura ambiente per 5 minuti e aggiungere 5 µ l di acqua deionizzata e 40 µ l di acetonitrile. Centrifugare le provette a 14.000 x g per 3 min.
5. Trasferire 48 µ l dal surnatante in un flaconcino HPLC di 300 µ l alta-recupero. Memorizzare i derivatizzato N- glycan campioni a-20 ° C fino ad un mese.

6. HILIC-UPLC profilatura di N- glicani

1. Analizzare i campioni utilizzando un sistema UPLC standard collegato a un detectorset di fluorescenza online alle lunghezze d'onda di eccitazione/emissione della 330 nm/420 nm, rispettivamente.
2. Utilizzare una cromatografia liquida di interazione idrofobica (HILIC)-colonna glycan UPLC a una temperatura di 60 ° C per l'analisi della colonna.
3. Preparare il solvente A diluendo 50 mL della soluzione madre (soluzione di formiato di ammonio 1 M, pH 4.5) con 950 mL di liquida cromatografia spettrometria di massa (LCMS)-acqua di grado. Preparare la soluzione di riserva come segue:
   1. Aggiungere 43 mL di acido formico a 700 mL di LCMS-grade H₂O.
   2. Regolare il pH a 4.5 aggiunta goccia a goccia di soluzione di ammoniaca acquosa (25% w/w).
   3. Trasferire il solvente per un cilindro graduato e riempire fino a 1000 mL con LCMS-grade H₂O. negozio a 4-6 ° C fino a 3 mesi.
4. Utilizzare acetonitrile LCMS-grado come solvente B.
5. Separare gli N- glicani con l'eluizione di pendenza seguente:
   1. Iniziare aggiungendo il 95% di solvente B in solvente A. imposta la velocità di flusso a 0,5 mL/min da 0 a 44,5 min.
   2. Da 0 a 6 minuti, gradualmente diminuire la proporzione del solvente B con un gradiente lineare di to78%.
   3. Da 6 a 44,5 minuti, gradualmente diminuire la proporzione del solvente B con una sfumatura lineare al 55,9%.
   4. Da 44,5 a 46,5 minuti, rapidamente diminuire la proporzione del solvente B con una sfumatura lineare dal 55,9% allo 0% e tenere allo 0% per 2 min e avviare il lavaggio della colonna. Ridurre il tasso di flusso a 0,25 mL/min da 44,5 a 55 min.
   5. Lavare la colonna ulteriormente aumentando solvente B al 95% da 48,5 a 50,5 minuti e tenere al 95% per 4,5 min.
   6. Riequilibrare la colonna per le condizioni di partenza del solvente B al 95% a 0,5 mL/min da 50,5 a 57 min.
6. Iniettare 45 µ l del campione nel sistema UPLC.
7. Eluire gli N- glicani di UPLC con tempi di ritenzione tra 15 e 40 min.
8. Raccogliere ogni frazione di picco UPLC osservati usando provette da centrifuga 2 mL e asciugare i campioni per evaporazione centrifugo.
9. Iniettare circa 1 pmol di 2-AB etichettato destrano standard (2−20 unità di glucosio) per calibrare la pianta -N- glycan profilatura e di assegnare loro tempi di eluizione in unità di glucosio standardizzati.

7. MALDI-TOF MS Analysis

1. Sciogliere i campioni da passo 6,8 a 5 µ l di LCMS-acqua di grado. Mescolare 1 µ l della soluzione campione e 1 µ l di soluzione (ATT) (0,3% p/v in acetonitrile acquosa 70% v/v) 6-aza-2-thiothymine e pipetta il composto sul porta-campioni MALDI-TOF.
2. Analizzare i campioni utilizzando uno strumento di spettrometro di massa MALDI-TOF in modalità ioni positivi premendo il pulsante Start .
3. Analizzare gli spettri di massa utilizzando il software di analisi MALDI-TOF-MS accompagnamento.
4. Interpretare gli spettri utilizzando un opensource glycan interpretazione software¹⁹. Impostare i parametri di ricerca per 2-AB etichettatura, [M + Na]⁺e impostare il parametro di precisione Da 2.0.

Risultati

La figura 1 Mostra una panoramica schematica del protocollo descritto, compreso l'isolamento delle proteine (glico-) dal ravanello, la preparazione di N- glicani, l'analisi UPLC e l'analisi MALDI-TOF-MS di questi componenti. La figura 2 Mostra rappresentative cromatogrammi UPLC di N- glicani derivatizzata delle cultivar ravanello analizzati. La figura 3 Mostra i risultati ottenuti d...

Discussione

Il protocollo che abbiamo presentato qui consente il confronto dei profili N- glycan di varie cultivar di ravanello. Un notevole vantaggio di questo metodo rispetto ai protocolli esistenti è che è necessaria alcuna modifica di buffer tra il rilascio enzimatico di N- glicani e la reazione di derivatizzazione con 2-AB. Il punto più critico di questa procedura è la purificazione di N- glicani utilizzando la colonna SPE, come la mancata rimozione di sali o altre impurità nella miscela di reazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080