Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Resumen

Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.

Resumen

Medición en tiempo real de las oscilaciones en el nivel unicelular es importante descubrir los mecanismos de los relojes biológicos. Aunque extractos bulto preparados de huevos de Xenopus laevis han sido poderosos en disección redes bioquímicas subyacentes a la progresión del ciclo celular, su medición promedio del conjunto por lo general conduce a una oscilación amortiguada, a pesar de cada uno cada oscilador está sostenida. Esto es debido a la dificultad de sincronización perfecta entre osciladores individuales en los sistemas biológicos ruidosos. Para recuperar la dinámica unicelular del oscilador, hemos desarrollado un sistema de célula artificial basada en gotas que puede reconstituir ciclos mitóticos en compartimentos de la célula-como encapsular ciclismo extractos citoplásmicos de los huevos de Xenopus laevis . Estas células sólo citoplasmáticas simples exhiben oscilaciones sostenidas durante más de 30 ciclos. Para construir más complicadas las células con los núcleos, agregamos demembranated la cromatina espermática para activar núcleos uno mismo-montaje en el sistema. Observamos una progresión periódica de cromosoma condensación/decondensation y núcleos envuelven descomposición/reforma, como en las células reales. Esto indica que el oscilador mitotic funcione fielmente para conducir varios eventos mitóticos aguas abajo. Simultáneamente realiza un seguimiento la dinámica del oscilador mitotic y procesos posteriores en gotas individuales utilizando microscopía de fluorescencia Time-lapse de multicanal. El sistema de ciclo celular artificial proporciona un marco de alto rendimiento para la manipulación cuantitativa y análisis de oscilaciones mitóticas con resolución unicelular, que probablemente proporciona penetraciones importantes en la maquinaria reguladora y las funciones de el reloj.

Introducción

Citoplásmicos extractos preparados a partir de huevos de Xenopus laevis representan uno de los modelos más predominantes para el estudio bioquímico de los ciclos celulares, dado el gran volumen de ovocitos, la progresión del ciclo celular rápida y la capacidad de reconstituir eventos mitóticos en vitro^1,2. Este sistema ha permitido el descubrimiento inicial y caracterización mecanicista de los reguladores de ciclo celular esencial como factor promotor de maduración (MPF) así como procesos mitotic posteriores incluyendo huso Asamblea y cromosoma segregación^{1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11}. Los extractos de huevos de Xenopus también se han utilizado para la disección detallada de las redes reguladoras del ciclo celular reloj^8,12,13,14 y para los estudios de los daños en el ADN /Replication de control¹⁵ y huso mitotic Asamblea checkpoint^16,17,18.

Estos estudios de los ciclos celulares utilizando los extractos de huevos de Xenopus se han basado principalmente en mediciones masivas. Sin embargo, ensayos de reacción a granel convencional no pueden mímico comportamientos de celular real, dados una discrepancia importante en sus dimensiones y compartimentación subcelular espacial de las moléculas de reacción. Por otra parte, mediciones masivas de actividades mitotic son propensas a dar un número limitado de ciclos antes de amortiguación rápida⁸. Estas desventajas de reacciones a granel han impedido que el extracto de sistema para proporcionar más comprensión de funciones y propiedades dinámicas complejas de reloj. Estudios recientes han encapsulado citostáticos sin células factor detenido (CFS) Xenopus extractos^19,20 en compartimentos de celular-como definido por el tamaño, que han ayudado a dilucidar cómo tamaño de husillo es modulada por el volumen citoplásmico. Sin embargo, este sistema in vitro es detenido en metafase de meiosis II por la acción del factor citostático¹, y un sistema capaz de oscilaciones sostenidas a largo plazo en el nivel unicelular es necesaria investigación adicional del ciclo celular oscilador.

Para estudiar las oscilaciones del ciclo celular con una sola célula resolución, hemos desarrollado una escala celular, sistema de alto rendimiento para la reconstitución y la medida simultánea de múltiples procesos oscilatorios mitotic autosostenidos en microemulsión individual gotas. En este detallado video protocolo, demostramos la creación del sistema de oscilación mitotic artificial encapsulando ciclismo citoplasma de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones de tamaños que van desde 10 a 300 μm. En este sistema, fueron mitotic oscilaciones como condensación del cromosoma y la condensación, ruptura de la envoltura nuclear y reforma y la degradación y síntesis de sustratos de la anafase (p. ej., securin-mCherry en este protocolo) reconstituido con éxito.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.

1. preparación de materiales para la reconstitución del ciclo celular y detección

1. Asamblea de Gibson la clonación para la construcción de ADN de plásmido y purificación de mRNA de mCherry securin
   1. Preparar tres fragmentos de la DNA incluyendo una columna vertebral del vector pMTB2, securin y mCherry mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y gel de purificación^21,22.
   2. Medir las concentraciones de fragmentos mediante un fluorospectrometer. Combinar 100 ng de troncales con securin mCherry inserciones en un 1: relación molecular 1:1 y añadir agua desionizada para ajustar el volumen total de reacción a 5 μl.
   3. Preparar 6 mL de 5 x buffer de reacción isotérmica de la Asamblea con 3 mL de 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 300 μL de 1 M de MgCl₂, 600 μl de dNTP 10 mM, 300 μL de 1 M TDT, 1.5 g de PEG-8000 y 20 mg de NAD²³.
   4. Añadir los fragmentos combinados a 15 μl de 1 Tampón de reacción x Asamblea isotermo alícuota. Incubar la reacción en un tubo de reacción de PCR a 50 ° C durante 15 minutos.
   5. Hacer una agarosa 0.8% gel y funcionan con una tensión de 10 V/cm para verificar la eficiencia recocida de estos fragmentos.
   6. Purificar el plásmido construido y eluir con 15 μl de agua libre de ARNasa. Transformar 1 μl del plásmido purificado ADN en 50 μl de competentes DH5α e. coli las células²⁴ para uso futuro.
   7. Extraer y purificar el plásmido ADN de mCherry securin de los competentes DH5α e. coli las células.
   8. Transcribir el ADN del plásmido linearizado de mCherry securin en mRNA y purificar el mRNA. Utilice un espectrofotómetro para verificar que la concentración de mRNA es más de 100 ng/μl y la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm es aproximadamente 2.0.
2. Preparación de demembranated laevis de Xenopus espermatozoides DNA
   Nota: Adaptado de Murray 1991¹.
   1. Eutanasia de adultos machos Xenopus laevis²⁵ y diseccionar los testículos de cuatro ranas macho^26,27.
   2. Coloque los testículos de cuatro ranas en el mismo plato de Petri de 100 mL. Enjuague los testículos tres veces en 50 mL de solución fría 1 x MMR (2 mM KCl, 0.1 M de NaCl, 1 mM de MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA).
   3. Retire el exceso de sangre y la grasa de los testículos en un plato de petri 100 mL y lavar dos veces en tampón frío preparación nuclear (NPB) (250 mM sacarosa, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8.0, trihydrochloride espermidina de 0,5 mM, 0,2 mM tetrahydrochloride de espermina).
   4. Elimine el preparación nuclear de tampón (NPB) y trocear los testículos con longitudes inferiores a 0,2 cm con tijeras de disección agudas en un plato de Petri de 100 mL. Añada 8 mL de NPB frío a los testículos para más descomposición.
   5. Malla de nylon de uso las telas con un tamaño de 70 μm de poro para filtrar los testículos y recoja la muestra de semen en un tubo cónico de 15 mL. Desactivación de los espermatozoides recolectados a 1.730 x g durante 10 minutos a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
   6. Fuente de las células de la esperma con 1 mL de NPB y 50 μl de 10 mg/mL lysolecithin e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos de demembranate células de la esperma.
   7. Lavar el esperma demembranated ADN con 10 mL de NPB frío con la solución de BSA 3% tres veces.
   8. Medir la densidad de espermatozoides DNA con un hemocitómetro.
   9. Congelar el esperma de ADN en 5 alícuotas μL en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C. La concentración óptima de DNA de la esperma es aproximadamente 105 núcleos/μl.
3. Purificación de proteínas de señal de localización Nuclear de GFP (GFP-NLS)
   1. Transformar el plásmido con la GST-etiqueta GFP-NLS BL21 (DE3) competente e. coli las células⁵.
   2. Incube las células sin antibióticos a 37 ° C por 1 h y luego en una placa de agarosa LB con ampicilina 100 de μg/mL.
   3. Incubar la placa a 37 ° C de 14 a 18 horas crecer las células en colonias individuales. Recoger e inocular las colonias individuales en 4 mL de medio LB con ampicilina 100 de μg/mL. Agitar las células a 37 ° C durante 12 horas.
   4. Preparar la media de YT esterilizado (16 g de Bacto-triptona, 10 g de extracto de Bacto-levadura, 5 g de NaCl) y el calor de la media de YT a 37 ° C.
   5. Inocular 1 mL de las células incubadas durante la noche en medio LB en 250 mL de medio de YT precalentado con 100 ampicilina μg/mL y agitar durante 2 horas para aumentar la densidad celular.
   6. Medir la densidad óptica (OD) de celular cada 30 minutos, utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Añadir 0,1 mM IPTG en células para inducir la expresión de la proteína GFP-NLS una vez que el valor de OD alcanza 0,1.
   7. Agitar las células a 18 ° C durante la noche para reducir la tasa de crecimiento de la célula y permiten la síntesis y la mejor expresión de la proteína.
   8. Desactivación de las células a 34.524 x g a 4 ° C durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
   9. Resuspender el pellet celular en 40 mL de tampón PBS (suministrado con 800 μl de lisozima de 50 mg/mL, 100 μl de PMSF 0,2 M, 13.2 μl de una mezcla de 10 mg/mL de leupeptin, pepstatin y chymostatin y 8 μl de EDTA de 0,5 M) e incubar a 4 ° C durante 20 minutos.
   10. Romper a las células utilizando un sonicador a una frecuencia de 20 kHz para 4 x 30 s, con 30 intervalos s cada sonicación para liberar expresado proteína GFP-NLS.
   11. Gira a 20.000 x g durante 35 minutos para eliminar las células rotas.
   12. Utilizar la cromatografía de afinidad para extraer y purificar la proteína GFP-NLS.
   13. Lavar la mezcla de grano de 1,5 mL tres veces con 15 mL de tampón PBS e incubar 250 mL de lisado con granos durante 4 horas a 4 ° C con la inversión.
   14. Desactivación de las cuentas a 2000 x g durante 5 min y añadir 10 mL de solución de lavado 25 mM Tris base, pH 7.5, 500 mM NaCl y 5 mM (TDT) a los granos. Incubar los granos en 700 μl de tampón de elución (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 20 mM reducida glutatión y 5 mM DTT) con rotación de 4 ° c. Recoge una alícuota de la elución con un volumen de 50 μl.
   15. Medir la concentración de proteína recogida al ejecutar una de gel azul de Coomassie²⁸.
   16. Eluir las proteínas utilizando PD-10 columnas con 3 mL de buffer de almacenamiento (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerol, pH 7.7) a través del intercambio de búfer.

2. preparación de ciclismo Xenopus extractos

Nota: El procedimiento general de preparación de los extractos se ilustra en la figura 1A. Adaptado de Murray 1991¹.

1. Se inyectan tres mujer madura Xenopus laevis con IU 66 gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) 10 días antes de la puesta de huevos.
2. Se inyectan estas ranas Xenopus con 500 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG) para inducir la ponedora 18 horas antes de la preparación de extractos de ciclismo.
3. Descarte de huevos durante la noche. Basado en experimentos (datos no mostrados), extractos preparados a partir de los huevos recién exprimidos generan actividades de mayor duración que extractos preparados a partir de huevos puestos desde la misma rana hembra. Apriete los huevos de cada hembra rana en platos de Petri de 100 mm que contiene 10 mL de tampón de x MMR 0,2 y examinar bajo un microscopio estéreo.
4. Deshágase de las tandas de huevos que tienen límites confusos entre animal y vegetal postes o tienen manchas blancas irregulares sobre postes de animal.
5. Elegir el lote de huevos de una rana hembra que presenta una población homogénea de huevos con polos de vegetal y animal claramente diferenciada y transferir los huevos en un vaso de precipitados de 600 mL.
6. Vaciar el exceso de tampón de x MMR 0,2 y suavemente Agregar 250 mL de 2 g por 100 mL extracto de cisteína (pH 7.7) en 1 x buffer (100 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, sacarosa de 50 mM, pH 7.7) a los huevos.
7. Agitar enérgicamente los huevos con la mano y quitar las capas de gelatina de huevos en tres lavados con un volumen total de 800 mL de cisteína de búfer durante 3 minutos o hasta que el agregado de huevos y colocan en el fondo del vaso, indicando que el retiro de capa de la jalea es exitosa.
8. Lavado de huevos con 1 L de solución de x MMR 0.2 más de cuatro veces.
9. Recoger y desechar huevos que utilice una pipeta de vidrio blancos.
10. Vaciar el búfer MMR y huevos con 200 mL de ionóforo de calcio de 0.1 μg/mL solución A23187 en buffer de x MMR 0,2 para la activación de la fuente.
11. Use el lado de la abertura de una pipeta de cristal para revolver los huevos suavemente hasta que los huevos se activan y retire la solución de ionóforo de calcio.
12. Comprobar la eficacia de la activación después de huevos colocan abajo en la parte inferior del vaso. Huevos bien activados tienen aproximadamente el 25% del polo animal y el 75% del polo vegetal.
13. Lavar los huevos activados dos veces con 50 mL de 1 x extracto buffer suplementado con los inhibidores de proteasa (10 μg/mL cada leupeptin, pepstatin y chymostatin).
14. Transferir cuidadosamente huevos a un microtubo de casquillo rápido de 0,4 mL y luego empacar huevos mediante centrifugación a 200 x g durante 60 segundos y luego 600 x g durante 30 segundos.
15. Quitar extra amortiguación en la parte superior de huevos usando un pipeta Pasteur de vidrio para reducir la dilución de los extractos.
16. Aplastar huevos a 15.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
17. Cortar los tubos con una cuchilla de afeitar para separar las tres capas de huevos machacadas y mantener el citoplasma crudo en la capa media.
18. Transferir el citoplasma crudo a nuevos tubos de la ultracentrífuga y complementar con inhibidores de la proteasa y citocalasina B en 10 μg/mL de cada una.
19. Centrifugue el citoplasma crudo otra vez a 15.000 x g a 4° C durante 5 minutos para purificar más citoplasma mediante la eliminación de la yema y el exceso de lípidos.
20. Mantener extractos recién preparados en el hielo.

3. gota generación

1. Preparación de la cámara de cristal 2D
   Nota: Los tubos de vidrio de rectángulo sirven como cámaras que confinan las gotitas en un solo plano de 2 dimensiones, lo que permite más fácil observación y recopilación de datos.
   1. Cortar tubos de vidrio rectangular con una dimensión interna del μm 2 mm x 100 mm 4 piezas largas. Utilice el borde afilado de una piedra de afilar, marcar los límites deseados en la superficie externa del tubo de vidrio con grabados de luz y suavemente aplique presión en ambos lados de los grabados a romper pedazos de tubos de vidrio.
   2. Precalentar una incubadora de baño seco a 95 ° C. Sacar el bloque de calefacción y colóquelo en un desecador de vacío de policarbonato.
   3. Coloque un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo 30 μl de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano en el bloque calefactor. Montar los tubos de vidrio de corte dentro del desecador de vacío aproximadamente a 5 cm para el bloque de calefacción.
   4. Conecte el desecador a una bomba de vacío. Encienda la bomba durante 1 minuto para alcanzar el nivel de vacío deseado, luego cierre la válvula de 3 vías para sellar el desecador y dejar que el vapor de silano de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) recubrir la pared interna de los tubos de vidrio. Esto creará un ambiente hidrofóbico para estabilizar las gotitas.
   5. Dejar los tubos de vidrio dentro del desecador para la capa durante la noche. Los tubos estarán listos para usar al día siguiente.
2. La proyección de imagen y la generación de gotas
   Nota: Los procedimientos de generación de gotas y la proyección de imagen se ilustran en las figuras 1B y 1C.
   1. Suministro de extractos preparados en el paso 2 con 10 ng/μl mCherry securin mRNA para los experimentos simples sólo citoplasmática de ciclo celular. Por otra parte, fuente de extractos con cromatina de esperma demembranated (250 μl de extracto), proteína de GFP-NLS de 10 μm y 10 ng/μl mCherry securin mRNA para crear gotas que morfología de núcleos periódica cambia.
   2. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, mezcla 20 μl del extracto había provisto de proteína recombinante o ARNm con 200 μL de perfluoropoliéter 2%-polietilenglicol (PFPE-PEG) fluorosurfactant en HFE7500 fluorados aceite.
   3. Generar gotitas usando un mezclador de tipo vórtex. La gama de tamaños de gota puede ser modulada por la duración y la velocidad del vórtice. Para crear las gotas con radios que van desde 50 a 200 μm, ajustar la velocidad del vórtice a 56 x g (3.200 rpm con un radio de 4,9 mm) y presione suavemente el tubo de microcentrífuga con el extracto y la mezcla de surfactante en el mezclador durante 3,5 segundos. Inspeccione visualmente si las gotitas son uniformes en tamaño.
   4. Use una pipeta de 20 μl para transferir las gotitas flotando en la parte superior y un volumen igual de PFPE PEG surfactante en un tubo PCR. Sumergir el tubo de cristal preparado en el paso en la capa de gotas en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y esperar hasta que las gotas han llenado aproximadamente el 75% del tubo, luego empuje el tubo hacia abajo en la capa de surfactante hasta que el tubo esté lleno. Esto baja la densidad de la gota y permitir que las gotitas formar una sola capa dentro de la cámara sin superposición o forma de distorsión causado por el hacinamiento.
   5. Llenar un plato de fondo de cristal con un diámetro de 40 mm con aceite mineral. Sumerja los tubos llenos de gotas en aceite empujándolas suavemente hacia abajo usando una pinza fina.
   6. Después de cargar todas las muestras, uso un vaso pipeta para remover cualquier suciedad visible o gotas de filtrado. Añadir más aceite mineral si los tubos no son o no estar completamente inmerso en el proceso de proyección de imagen.
   7. Realizar la proyección de imagen de gotas en un microscopio de epifluorescencia equipado con una platina x-y motorizado (véase Tabla de materiales). Utilice un objetivo de aire X 4 para la proyección de imagen de todos. Para imágenes de fluorescencia, utilice 130 W vapor corto arco lámpara de mercurio como fuente de luz de fluorescencia para la iluminación y un filtro GFP (excitación 482/35 nm y emisión 514/LP nm) y un filtro mCherry (excitación 562/40 nm y emisión 641/75 nm) para la proyección de imagen Señales NLS GFP y mCherry securin.
   8. Grabar vídeos Time-lapse en el campo luminoso y múltiples canales de fluorescencia cada 6 a 9 minutos hasta que las gotas pierden su actividad.

4. tratamiento y análisis de datos de imágenes

1. Segmentación y seguimiento de las gotas
   1. Importar datos en formato ".tif" o ".oif" en software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales).
   2. Segmento de gotitas individuales utilizando el canal de campo brillante. La imagen de campo claro mostrará gotitas como círculos brillantes con límites oscuros. Aplicar el umbral a la imagen. Añadir una superficie de seguimiento a cada gotita templando el umbral entre los píxeles oscuros y brillantes, para que cada superficie cubre toda el área de la gota correspondiente.
   3. Seguir automáticamente los segmentos entre fotogramas adyacentes utilizando el algoritmo de movimiento autorregresivo. Ajustar la distancia máxima aceptable de una gota entre dos marcos adyacentes sea menor que el radio de gotas más para un seguimiento preciso de pequeñas gotitas.
   4. Revise visualmente todas las pistas en todo el video entero para detectar segmentaciones incorrecto ese segmento el espacio vacío entre las gotas en lugar de gotitas reales. Elimine manualmente las pistas incorrectas.
   5. Segmento y área de fondo sin cualquier gotas para obtener la intensidad de la fluorescencia de fondo de pista. Para mejorar la señal a ruido, restar intensidad de fondo de la intensidad de fluorescencia de gotitas en cada marco de tiempo.
   6. Exportación de parámetros medidos para cada pista con el tiempo, incluyendo la media y desviación estándar de la intensidad de fluorescencia y de la zona de gota en archivos ".csv".
2. Análisis de datos de gota tamaño y oscilación período
   1. Cargar los archivos ".csv" en R para crear parcelas de intensidad de fluorescencia con el tiempo de cada gotita. ID. gotita de registro en un archivo ".csv".
   2. Importar los archivos de ".csv" exportados desde el software de análisis y el archivo ".csv" con una lista de ID de gota en Matlab y guardar como archivos de "MAT" para su posterior análisis de datos.
   3. Calcular el volumen de una gota comprimido basado en la información de zona de gota exportados después de segmentación y la altura de vidrio cámara de¹⁹. Utilizar el volumen para calcular el radio de la gota como una esfera.
   4. Extracto de los puntos de picos y valles utilizando el algoritmo de detección de pico a través del tiempo. Realizar correcciones manuales en la posición de los picos y valles para asegurar que se detectan con precisión.
   5. Para calcular el período del ciclo celular, calcular el intervalo de tiempo entre dos picos adyacentes. Tomar el promedio de todos los intervalos para cada gotita como su período del ciclo celular.

Resultados

En la figura 2, mostramos que este protocolo produce oscilaciones mitóticas en células simples, libre de nucleares así como complicadas células con núcleo, donde el oscilador conduce la alternancia cíclica de la formación de núcleos y deformación. Las gotas libres de núcleos generan oscilaciones mitóticas hasta a 30 ciclos undamped sobre la duración de 92 horas, según lo indicado por el periódico síntesis y la degradación de una fluorescencia ...

Discusión

Hemos presentado un nuevo método para el desarrollo de un sistema celular artificial de alto rendimiento permite vitro en reconstitución y seguimiento a largo plazo de las oscilaciones de ciclo celular autosuficiente a nivel unicelular. Hay varios pasos fundamentales que hacen que este método exitoso. Huevos de Xenopus de primera, recién exprimidos con una buena calidad, en comparación con huevos establecidas, tienden a producir extractos con actividad de oscilación de mayor duración. En segundo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xenopus laevis frogs	Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit	QIAGEN	27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)	QIAGEN	28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Ambion	AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell	Sigma-Aldrich	B2935
Calcium ionophore	Sigma-Aldrich	A23187
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Toxic
Trichloro	Sigma-Aldrich	448931	Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads	Sigma-Aldrich	GE17-0756-01
PD-10 column	Sigma-Aldrich	GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing	VitroCom	5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope	Olympus
Olympus IX83 microscope	Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope	Olympus
NanoDrop spectrophotometer	Thermofisher	ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes	E&K Scientific	485050-B
PureLink RNA Mini Kit	ThermoFisher（Ambion）	12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	2215365
Imaris	Bitplane	Version 7.3	Image analysis software