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要約

油中水マイクロエマル ジョンのアフリカツメガエルの卵抽出液をカプセル化して単一細胞レベルでの細胞分裂自律振動体外の生成法を提案します。

要約

単一細胞レベルの振動の実時間測定は、生物時計のメカニズムを明らかにすることが重要です。アフリカツメガエル卵から調製した一括抽出物は、細胞周期の進行を基になる生化学的なネットワークを切り裂くことに強力なされているが、彼らのアンサンブル平均測定が通常にもかかわらずそれぞれの減衰振動につながる個々 の発振器は支えられています。これは騒々しい生物システムで個々 の発振器の間で完全に同期の難しさのためです。発振器の単一細胞ダイナミクスを取得、アフリカツメガエル卵の細胞質抽出物サイクリングをカプセル化細胞のようなコンパートメントで分裂サイクルを再構築できる液滴を利用した人工細胞システムを開発しました。これらの単純型細胞質だけの細胞は、以上 30 サイクルの持続的な振動を展示します。複雑な細胞核を構築するには、我々 は自己組織システムの核をトリガーする鞭毛精子クロマチンを追加しました。私たちは染色体凝縮/decondensation の定期的な進行を観察し、核が実際の細胞のような内訳/改革を包みます。これは細胞分裂の発振器に複数のダウン ストリーム分裂イベントを駆動する忠実に機能することを示します。我々 は同時に分裂の発振器とマルチ チャネル タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた個々 のしぶきの下流プロセスのダイナミクスを追跡しました。人工細胞周期システム定量的操作と単一セルの解像度、おそらく規制機械との機能に重要な洞察を提供する分裂振動解析の高スループット フレームワークを提供します。クロック。

概要

アフリカツメガエル卵から調製した細胞質のエキスを表す大量の卵母細胞、急速な細胞周期進行および再構成の機能を与え、細胞周期に関する生化学的研究の最も支配的なモデルの一つ分裂イベント体外1,2。初期検索と本質的な細胞周期調節因子の性質を含む下流の分裂プロセスと同様に成熟促進因子 (MPF) 紡錘アセンブリおよび染色体分離1 のようにこのシステムを許可しています。 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10、 11。アフリカツメガエル卵抽出液は、細胞周期クロック8,12,13,14の調節ネットワークの詳細な解剖、DNA 損傷の研究にも使用されています。/replication チェックポイント15と紡錘アセンブリ チェックポイント16,17,18。

アフリカツメガエル卵抽出液を用いた細胞周期のこれらの研究は、一括測定を主にに基づいています。しかし、従来のバルク反応アッセイは寸法、反応分子の細胞内空間区画の大きな矛盾を与えられた本当のセル動作をまねるかもしれない。また、分裂活動の一括測定は8をすばやく減衰する前にサイクルの限られた数を与えることになりやすいです。バルク反応のこれらの欠点は、さらに複雑なクロックの動的プロパティは、関数の理解を提供する抽出システムを妨げています。最近の研究を無細胞 cytostatic 要因逮捕 (CSF)アフリカツメガエルサイズ定義セルのような区画は、によってスピンドルのサイズを調整する方法の解明に貢献しているに19,20を抽出しカプセル化、細胞質の体積。しかし、この生体外でシステムは1は細胞増殖抑制因子との作用により減数分裂 II の中期で逮捕され、単一細胞レベルで長期的な持続的な振動の対応システムが細胞周期の研究の必要発振器。

単一セルの解像度と細胞周期振動の研究、細胞規模、再構成と複数の自律的な核分裂振動プロセスは個々 のマイクロエマル ジョンの同時測定のための高スループット システムを開発しました。水滴。この詳細なビデオ プロトコルでサイクリングアフリカツメガエル卵細胞質に至る 10 300 μ m サイズのマイクロエマル ジョンをカプセル化して人工細胞分裂振動システムの作成を示しています。このシステムは、染色体凝縮と解消凝縮、核膜崩壊と改革と合成と分解の後期基板 (例えば、 securin-mCherry このプロトコルで) を含む分裂の振動だった正常に再構成。

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プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ミシガン大学によって承認されています。

1. 細胞周期の再構成と検出のための材料の準備

  1. ギブソン アセンブリ プラスミド DNA 構築と securin mCherry の mRNA 精製のクローニング
    1. PMTB2 ベクター バックボーン、securin、およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を mCherry を含む 3 つの DNA のフラグメントを準備し、ゲルの浄化21,22。
    2. フラグメントを使用して、fluorospectrometer の濃度を測定します。1 securin と mCherry を挿入してバックボーンの組み合わせ 100 ng: 分子の比率を 1:1、5 μ L を反応の総量を調整する脱イオン水を加えます。
    3. 6 ml 等温アセンブリ反応バッファー x 5 の 1 の 3 ml M トリス-HCl (pH 7.5) 1 M MgCl2600 10 mM dNTP の μ L 300 μ L 1 M の DTT のペグ-8000 の 1.5 g、NAD23の 20 mg を 300 μ l 添加します。
    4. 結合フラグメントを 15 μ L 分注 1 の x 等温アセンブリ反応バッファーに追加します。15 分のための PCR 反作用の管を 50 ° c で反応を孵化させなさい。
    5. 0.8% の agarose のゲルし、これらのフラグメントのアニーリング効率を確認する 10 V/cm の電圧を使用して実行を確認します。
    6. 構築されたプラスミドを浄化し、溶出水の RNase フリーの 15 μ L を使用します。精製プラスミド DNA の 1 μ L を変換 50 μ L DH5α 有能なエシェリヒア属大腸菌のセル24将来使用するため。
    7. 抽出し、securin-mCherry DH5α 有能なエシェリヒア属大腸菌からのプラスミドを浄化する細胞。
    8. MRNA に一直線に並べられた securin mCherry プラスミド DNA を転写、mRNA を浄化します。分光光度計を使用して、mRNA の濃度が以上 100 ng/μ L と 260 で吸光度の比であることを確認する nm と 280 nm は約 2.0。
  2. 鞭毛アフリカツメガエル精子 DNA の調製
    注: は、マレー 19911から適応。
    1. 成人男性アフリカツメガエルを安楽死させる25そして 4 つの男性カエル26,27から精巣を解剖。
    2. 同じ 100 mL ペトリ皿に 4 つのカエルから精巣を配置します。1 冷の x MMR 溶液 (0.1 M NaCl、KCl 2 mM、MgCl2、2 mM CaCl2, 5 mM HEPES、0.1 ミリメートルの EDTA の 1 mM) の 50 mL で 3 回精巣をすすいでください。
    3. 100 mL ペトリ皿で精巣から余分な血液や脂肪を削除し、冷たい原子力準備バッファー (NPB) (250 mM ショ糖、15 mM HEPES、pH 7.4、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、0.5 mM スペルミジン trihydrochloride 0.2 mM スペルミン tetrahydrochloride) で 2 回洗います。
    4. 原子力準備バッファー (NPB) を削除し、100 mL のシャーレに鋭い解剖はさみを使用して 0.2 cm より小さい長さに睾丸を切り。さらに故障のための睾丸に冷たい NPB の 8 mL を追加します。
    5. 使用ナイロン メッシュ、精巣をフィルタ リング、15 mL の円錐管に精子のサンプルを収集して 70 μ m の細孔径が付いている生地です。4 ° C で 10 分間 1,730 × g で収集した精子をスピンダウンし、上清を除去します。
    6. NPB の 1 mL と 50 μ L 10 mg/mL リゾレシチンの精子細胞を供給し、demembranate 精子細胞に 5 分間、室温でインキュベートします。
    7. 3 回 10 ml 3 %bsa 溶液による冷たい NPB の鞭毛精子 DNA を洗浄します。
    8. 診断で精子 DNA の濃度を計測します。
    9. 5 μ 因数で精子 DNA を液体窒素で凍結し、-80 ° C で保存精子 DNA の最適濃度は約 105 核/μ L です。
  3. GFP 核局在化シグナル (GFP NLS) の蛋白質の浄化
    1. BL21 GST タグ GFP NLS プラスミドに変換 (DE3) 有能なエシェリヒア属大腸菌のセル5。
    2. 1 h の 37 ° C で抗生物質がない細胞をインキュベートし、100 μ g/mL アンピシリンと、LB アガロース ・ プレートに広めます。
    3. セルを単一のコロニーに成長する 14 〜 18 時間 37 ° C でプレートを孵化させなさい。選択し、シングル コロニーを 100 μ g/mL アンピシリンと LB 媒体の 4 mL に接種します。12 時間 37 ° C でセルを振る。
    4. オートクレーブの YT 媒体 (バクト トリプトンの 16 g、バクト酵母エキス、塩化ナトリウム 5 g の 10 g) を準備し、37 ° c. に YT メディアを熱
    5. 100 μ g/mL アンピシリン予熱した YT 媒体の 250 mL に 1 mL の LB 媒体で一晩培養細胞を接種してセル密度を高めるために 2 時間のために振る。
    6. 測定セルの光学濃度 (OD) 30 分ごとに 600 の波長の分光光度計を用いた nm。0.1 mM IPTG OD 値 0.1 に達すると NLS GFP タンパク質発現を誘導するためにセルを追加します。
    7. 細胞成長率を抑えより良いタンパク質の発現・合成 18 ° C は一晩でセルを振る。
    8. 5 分の 4 ° C で 34,524 x g でセルを回し、上清を除去します。
    9. 40 mL の PBS バッファー (50 mg/mL リゾチームの 800 μ L、100 μ L の 0.2 M PMSF、leupeptin、ペプスタチン、ヒトデ、10 mg/mL ミックスの 13.2 μ L、0.5 M の EDTA の 8 μ L に付属) で細胞ペレットを再懸濁します、4 ° C で 20 分間インキュベートします。
    10. 破る 4 x 30 の 20 kHz の周波数で、超音波発生装置を使用してセルを s、30 s の間隔を解放するため、それぞれの超音波で GFP NLS 蛋白質を表現。
    11. 壊れた細胞を取除くために 35 分の 20,000 × g で回転します。
    12. アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーを使用して抽出し、GFP NLS 蛋白質を浄化します。
    13. 15 mL の PBS バッファーで 3 回 1.5 mL ビーズ スラリーを洗浄し、逆転で 4 ° C で 4 時間インキュベート 250 mL のビーズとライセート。
    14. スピン ・ ダウン 5 分 2000 x g でビーズとビーズを洗浄溶液 (25 トリス基本、pH 7.5、500 mM の NaCl、および 5 mM DTT) 10 mL を追加します。4 ° C で回転と溶出バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 8.8, 20 mM 減るグルタチオンと 5 mM DTT) の 700 μ L でビーズをインキュベートします。50 μ L のボリュームと溶出の因数を収集します。
    15. Coomassie 青いゲル28を実行して収集されたタンパク質の濃度を測定します。
    16. 3 ml のバッファー交換を通じてストレージ バッファー (20 mM HEPES、150 mM KCl、10% グリセロール、pH 7.7) の PD 10 列を用いたタンパク質を溶出します。

2 エキスアフリカツメガエルをサイクリングの準備

注: 抽出物を準備する手順の概要は、図 1 aに示されています。マレー 19911から適応。

  1. 10 日産卵前に、66 IU 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG) と 3 つの成熟した女性アフリカツメガエルを挿入します。
  2. サイクリングのエキスの準備の前に 18 時間の産卵を誘発するひと絨毛性ゴナドトロピン (HCG) 500 IU とこれらのアフリカツメガエルのカエルを注入します。
  3. 一晩置いた卵を破棄します。絞りたての卵から調製した抽出実験 (データは示されていない) に基づいて、同じ女性カエルから卵から調製した抽出物よりも長期的な活動を生成します。10 mL の 0.2 x MMR バッファーを含む 100 mm のペトリ皿に各女性のカエルの卵を絞るし、ステレオの顕微鏡の下で検査します。
  4. 動物と植物極の間の不明瞭な境界または動物極の上に不規則な白い斑点がある卵のバッチを破棄します。
  5. 明確に差別化された動物と植物極卵の同質な人口を提示 1 つ女性カエルから卵のバッチを選択し、600 mL のビーカーに卵を転送します。
  6. 過剰な 0.2 x MMR バッファーを注ぐし、軽く 250 mL を追加 100 mL あたり 2 g の 1 x のシステイン (pH 7.7) 抽出バッファー (100 mM KCl、0.1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、50 mM ショ糖、pH 7.7) の卵に。
  7. 手で卵を積極的に振るし、システインの 800 mL の容量を持つ 3 つ以上の洗浄は 3 分、または集計の卵までバッファーに格納し、ゼリー コート除去が成功したことを示す、ビーカーの底で解決の卵ゼリー コートを脱ぐ。
  8. 4 倍以上 0.2 x MMR ソリューションの 1 L と卵を洗います。
  9. 選択し、転送ガラス ピペットを使用して白くなる卵を破棄します。
  10. MMR バッファーを注ぐし、200 ml の 0.1 μ G/ml イオノフォア A23187 ソリューション活性化のための 0.2 x MMR バッファー内の卵を供給します。
  11. ガラス ピペットの広い開口部側を使用して、卵がアクティブになり、カルシウム イオノフォア ソリューションを削除するまで、卵を軽くかき混ぜます。
  12. ビーカーの底に卵が落ち着く後活性化効率をチェックします。よく活性卵のおよそ 25% がある動物極と植物極の 75%。
  13. 洗ってとプロテアーゼ阻害薬 (10 μ g/mL 各 leupeptin、ペプスタチン、ヒトデの) 補われる抽出バッファー x 1 の 50 mL の 2 回卵を活性化。
  14. 慎重に卵を 0.4 mL スナップ キャップ チューブに転送し、200 x g で 60 秒間遠心分離を介して卵と 30 秒、600 x g をパックします。
  15. エキスの希釈を抑えるガラス パスツール ピペットを使用して卵の上に余分なバッファーを削除します。
  16. 4 ° C で 10 分間 15,000 × g で卵をつぶす
  17. 砕いた卵の 3 つの層を分離し、中間層で原油の質を保つためにかみそりの刃でチューブをカットします。
  18. 新しい遠心チューブに原油の細胞質を転送し、プロテアーゼ阻害剤と 10 μ g/ml 各サイトカラシン B を補います。
  19. さらに余分な脂質と卵黄を削除して細胞質を浄化するために 5 分の 4 ° C で 15,000 × g で再び原油の細胞質を遠心します。
  20. 氷の上の新鮮なエキスを維持します。

3. 液滴生成

  1. 2 D ガラス室準備
    注: 四角形のガラス管は簡単に観察とデータ収集を可能にする 1 つの 2 次元平面における液滴を閉じ込める部屋として機能します。
    1. 長い作品を 4 mm に 2 mm x 100 μ m の内径寸法で四角形のガラス管をカットします。砥石のシャープなエッジを使用して、光エッチング ガラス管の外側の表面に目的の境界をマークし、ガラス管の部分にエッチングの両側を軽く押さえます。
    2. 95 ° c 乾燥風呂インキュベーターを予熱します。暖房のブロックを取り出して、ポリカーボネート真空デシケータに入れます。
    3. 暖房のブロック (1 H, 1 H, 2 H, 2 H ペルフロロオクチル) トリクロロ シランの 30 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに配置します。暖房のブロックを約 5 cm にカット ガラス管真空デシケータ中を置きます。
    4. 織ってを真空ポンプに接続します。必要な真空度に到達する 1 分のポンプをオンにし、織ってをシールし、ガラス管の内壁をコーティング (1 H, 1 H, 2 H, 2 H ペルフロロオクチル) トリクロロ シラン蒸着三方弁を閉じます。液滴を安定化するため疎水性環境が作成されます。
    5. 一晩コーティング用デシケータ内ガラス管を残します。チューブは使用次の日の準備になります。
  2. 液滴生成とイメージング
    注: 図 1 b と 1 C に液滴を生成し、イメージングの手順を示します
    1. 抽出手順 2 10 ng/μ L の液を供給 securin mCherry mRNA 細胞質だけの単純な細胞周期の実験のため。また、鞭毛精子クロマチン (抽出の μ L あたり 250) と供給エキス、10 μ M NLS GFP タンパク質及び 10 ng/μ L securin mCherry mRNA 定期的な核形態を展示する液滴を作成するを変更します。
    2. 1.5 mL 遠心チューブに抽出のミックス 20 μ L 付属組換えタンパク質や mRNA と 2% パーフルオロポリ エーテル - ポリエチレング リコール 200 μ L (PFPE PEG) HFE7500 フッ素油フッ素。
    3. 渦のミキサーを使用して液滴を生成します。粒径の範囲は、渦の速度と持続時間によって変調することができます。50 から 200 μ m に至るまでの半径と、液滴を作成するには、56 x g (4.9 mm の半径を持つ 3,200 rpm) で渦の速度を設定し、抽出物を含む微量遠心チューブと界面活性剤の混合物を 3.5 秒間ミキサーを軽く押してください。滴が均一の大きさの場合を目視で確認します。
    4. 20 μ L ピペットを使用して PCR チューブに上部と PFPE ペグ界面活性剤の等量に浮かぶ水滴を転送します。滴チューブの約 75% をいっぱい持っているし、チューブが完全に塗りつぶされるまで界面活性剤層にチューブを押し込みますまで 1.5 mL 容マイクロ チューブと待機の液滴層へのステップから調製したガラス管を浸します。これは液滴濃度を低く、チャンバー内過密による重複や形状の歪みのない 1 つの単一の層を形成する水滴ができます。
    5. 鉱物油と 40 ミリメートルの直径を持つガラス底皿を埋めます。優しく高級毛抜きを使用してそれらをプッシュで油の液滴入り管を浸します。
    6. 読み込み後ガラスを使用してすべてのサンプルは、目に見えるごみを取り除くにピペットまたは液滴を流出します。チューブではないまたはイメージング プロセスで完全に没頭しない場合より多くの鉱物油を追加します。
    7. 電動 xy ステージを搭載した落射蛍光顕微鏡で水滴のイメージングを行う (材料の表を参照してください)。すべての画像に 4 X 空気目的を使用します。蛍光イメージングを使用 130 W 水銀蒸気短いアーク ランプ蛍光照明用光源の GFP フィルター設定 (励起 482/35 nm、発光 514/LP nm) と mCherry フィルター設定 (励起 562/40 nm と排出 641/75 nm) 用GFP NLS と securin mCherry を通知します。
    8. 明視野、複数の蛍光チャンネル毎 6 ~ 9 分で水滴がその活性を失うまでの時間経過のビデオを録画できます。

4 画像処理およびデータ解析

  1. 液滴の分割および追跡
    1. 画像解析ソフトウェア「.tif ファイル"または".oif"の形式で記録されたデータをインポート (材料の表を参照してください).
    2. 明視野のチャネルを使用して単一液滴をセグメント化します。明視野像は、液滴を明るい暗い境界円として表示されます。イメージにしきい値を適用します。各サーフェスは、対応する液滴の全域をカバーできるように、暗いピクセルと明るいピクセルの間にしきい値をチューニングすることによって、各液滴追跡の表面を追加します。
    3. 自己回帰の動きのアルゴリズムを使用して隣接するフレーム間セグメントを自動的に追跡します。小さな水滴を正確に追跡するほとんどの液滴の半径よりも小さくなるように 2 つの隣接するフレーム間の液滴の許容最大走行距離を調整します。
    4. すべての実際水滴ではなく液滴間セグメント空スペース不正な区切りを検出する全体のビデオのトラックを視覚的に確認します。不適切なトラックを手動で削除します。
    5. セグメントおよび背景の蛍光強度を取得する任意の水滴なし背景領域を追跡します。ノイズ信号を高めるためには、各タイム フレームでの液滴の蛍光強度からバック グラウンド強度を減算します。
    6. 「.Csv」ファイルに平均と液滴周辺地域と蛍光強度の標準偏差を含む、時間をかけて各トラックの測定パラメーターをエクスポートします。
  2. 液滴の大きさと振動の期間のデータ解析
    1. 各液滴の期間の蛍光強度のプロットを作成する R に「.csv」ファイルを読み込みます。「.Csv」ファイルにレコードの液滴の ID です。
    2. Matlab に解析ソフトウェアと液滴の ID のリストを「.csv」ファイルからエクスポートした「.csv」ファイルをインポートし、、さらにデータ分析「.mat」ファイルとして保存。
    3. セグメンテーションとガラスの高さの部屋19後エクスポートされた液滴のエリア情報に基づく圧縮された液滴の体積を計算します。球として液滴の半径を計算するのにには、ボリュームを使用します。
    4. 山と谷のピーク ・ トラフ検出アルゴリズムを使用しての時間ポイントを抽出します。山と谷が正確に検出されることを確認するための位置に手動での修正を実行します。
    5. 細胞周期を計算するには、2 つの隣接するピークの間の時間間隔を計算します。その細胞周期として各液滴のすべての間隔の平均値を取る。

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結果

図 2でこのプロトコルが複雑な細胞核、発振器が核形成と変形の繰返しの交替をドライブと同様、両方のシンプルで無料の核細胞における有糸分裂振動を生成することを示します。核無料液滴生成細胞分裂の振動を 30 不減衰サイクルに 92 時間の時間にわたって定期的な合成と、蛍光レポーター securin-mCherry (図 2 a) の劣化に...

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ディスカッション

有効の試験管内再構成、単一細胞レベルで自律的な細胞周期振動の長期的な追跡高スループット人工細胞システムを開発するための手法を提案しました。このメソッドが成功するいくつかの重要な手順があります。良い品質で最初、絞りたてのアフリカツメガエル卵は卵と比較して、長く持続振動活動とエキスを生産する傾向があります。第二に、界面活性剤安定化微小内抽出?...

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開示事項

何を開示する必要があります。

謝辞

マドレーヌ Lu にありがとう GFP NLS を構築提供するためジェームス e. フェレル ジェレミー B. チャンと液滴生成に関する議論のためのアレン P 劉ケネス Ho ラップ男李 securin mCherry プラスミドを構築します。この作品は全米科学財団によって支えられた (早いキャリア助成金 #1553031)、健康の国民の協会 (ミラ #GM119688) とスローン研究員。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Xenopus laevis frogsXenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kitQIAGEN27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)QIAGEN28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription KitAmbionAM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cellSigma-AldrichB2935
Calcium ionophoreSigma-AldrichA23187
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261Toxic
TrichloroSigma-Aldrich448931Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactantRan Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beadsSigma-AldrichGE17-0756-01
PD-10 columnSigma-AldrichGE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubingVitroCom5012
Olympus SZ61 Stereo MicroscopeOlympus
Olympus IX83 microscopeOlympus
Olympus FV1200 confocal microscopeOlympus
NanoDrop spectrophotometerThermofisherND-2000
0.4 mL Snap-Cap MicrotubesE&K Scientific485050-B
PureLink RNA Mini KitThermoFisher (Ambion)12183018A
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific2215365
ImarisBitplaneVersion 7.3Image analysis software

参考文献

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