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Resumen

Aquí presentamos un protocolo para fabricar un riñón corteza extracelular derivado de matriz hidrogel para mantener la composición de la matriz extracelular (ECM) riñón nativo estructurales y bioquímicos. Se describen el proceso de fabricación y sus aplicaciones. Finalmente, se discute una perspectiva sobre el uso de este hidrogel para apoyar la bioingeniería y la regeneración celular y tejido renal específica.

Resumen

Matriz extracelular (ECM) proporciona importantes señales biofísicas y bioquímicas para mantener la homeostasis del tejido. Hidrogel sintético actual ofrece soporte mecánico robusto en vitro cultura de célula pero carecen de la composición de proteína y de ligando necesaria para provocar el comportamiento fisiológico de las células. Este manuscrito describe un método de fabricación de un hidrogel de ECM-derivado de corteza renal con robustez mecánica adecuada y apoyo composición bioquímica. El hidrogel es fabricado por la homogeneización y solubilización de corteza de riñón humano decellularized ECM mecánicamente. La matriz conserva proporciones de riñón nativo corteza ECM proteínas permitiendo también gelificación a dureza mecánica fisiológica. El hidrogel es un sustrato al que riñón células procedentes de la corteza pueden ser mantenidas bajo condiciones fisiológicas. Además, se puede manipular la composición hidrogel para modelar un ambiente enfermo que permite el estudio de enfermedades renales.

Introducción

Matriz extracelular (ECM) proporciona importantes señales biofísicas y bioquímicas para mantener la homeostasis del tejido. La composición molecular compleja regula propiedades estructurales y funcionales del tejido. Proteínas estructurales proporcionan células con conciencia espacial y permitan la adhesión y la migración1. Consolidados ligandos interactúan con receptores de superficie celular para controlar el comportamiento de la célula2. Riñón ECM contiene una gran cantidad de moléculas cuya composición y estructura varía según la localización anatómica, etapa de desarrollo y enfermedad estado3,4. Recapitulando la complejidad de la ECM es un aspecto clave en el estudio de las células renales derivadas in vitro.

Anteriores intentos de reproducir a microambientes de ECM se han centrado en decellularizing todo tejido para crear andamios capaces de recelularización. Descelularización se ha realizado con detergentes químicos como sulfato dodecyl de sodio (SDS) o detergentes no iónicos, y utiliza el órgano entero perfusión o inmersión y agitación métodos5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Los andamios presentados preservar los indicios estructurales y bioquímicos encontrados en tejido nativo ECM; Además, recelularización con las células donantes-específicas tiene importancia clínica en cirugía reconstructiva14,15,16,17,18, 19. sin embargo, estos andamios carecen de flexibilidad estructural y, por tanto, incompatibles con muchos dispositivos actuales utilizados para estudios en vitro . Para superar esta limitación, muchos grupos han procesado más decellularized ECM en hidrogeles20,21,22,23,24. Estos hidrogeles son compatibles con bioink y moldeo por inyección y eluden micrómetro escala espacial las limitaciones que decellularized lugar de andamios en las células. Además, composición molecular y ratios encontradas ECM nativa se conservan3,25. Aquí se demuestra un método para fabricar un hidrogel que se deriva de la corteza renal ECM (kECM).

El propósito de este protocolo es producir un hidrogel que se replica el microambiente de la región cortical del riñón. Tejido de la corteza renal es decellularized en una solución de SDS 1% bajo agitación constante a eliminar la materia celular. SDS se utiliza comúnmente para decellularize tejido debido a su capacidad de eliminar rápidamente el material celular inmunológica6,7,9,26. El kECM es entonces objeto de homogeneización mecánica y liofilización5,6,9,11,26. Solubilización en un ácido fuerte con pepsina da lugar a un hidrogel final solución20,27. Proteínas de kECM nativas que son importantes para estructural soporte y señal de transducción se conservan3,25. El hidrogel se puede también cuajó a dentro de un orden de magnitud de riñón humano nativo corteza28,29,30. Esta matriz provee un ambiente fisiológico que se ha utilizado para mantener la quietud de las células específicas del riñón en comparación con hidrogeles de otras proteínas de la matriz. Además, la composición de la matriz puede ser manipulada, por ejemplo, mediante la adición de colágeno-I, a los ambientes de la enfermedad modelo para el estudio de la fibrosis renal y otras enfermedades de riñón31,32.

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Protocolo

Los riñones humanos se aislaron por LifeCenter Northwest siguiendo pautas éticas establecidas por la Asociación de organizaciones de adquisiciones órgano. Este protocolo sigue animal cuidado y célula pautas cultura por la Universidad de Washington.

1. preparación del tejido de riñón humano

  1. Preparación de solución de descelularización
    1. Esterilizar un vaso de precipitado de 5000 mL y una barra de agitación de 70 x 10 mm.
    2. 1: 1000 (peso: volumen) sodio dodecil sulfato (SDS) en agua desionizada en autoclave en el vaso de la mezcla. Dejar la solución en una placa de agitación en aproximadamente 200 rpm por 24 h o hasta que el SDS se disuelva completamente.
      Nota: Típicamente, 2500 mL de la solución de SDS 1% es suficiente para decellularize un solo riñón humano.
    3. Transferir la solución a un filtro de vacío estéril de 500 mL y filtrar en contenedores herméticos esterilizados.
  2. Procesamiento de tejido renal
    1. Lavado y autoclave un par de pinzas, pinza hemostática dos pinzas, un par de servicios generales grado tijeras, dos asas de la hoja de bisturí, un vaso de precipitados de 1000 mL cubierto con papel de aluminio y una barra de agitación de 36 x 9 mm.
    2. Línea de una campana de cultivo de tejidos con Empapador. Coloque el vaso, un plato de cultivo estériles para tejidos (150 x 25 mm) y el órgano riñón entero en la campana. Llene el vaso con 500 mL de solución al 1% SDS.
      Nota: Los riñones humanos fueron recibidos en el hielo de LifeCenter NorthWest.
    3. Coloque el riñón en la placa de cultivo de tejido estéril (figura 1A). Retire toda la grasa perirrenal por afeitar ligeramente alrededor de la cápsula renal con un bisturí (figura 1B).
    4. Haga una incisión superficial de 8-10 cm con el bisturí, sólo lo suficientemente profunda como para romper la cápsula renal sin dañar el tejido de la corteza subyacente, en el extremo superior del riñón. Retire la cápsula renal por pelar lejos el tejido de corteza con dos mordazas de la pinza (figura 1).
    5. Biseca el riñón a lo largo del plano coronal utilizando el bisturí a lo largo de la parte lateral del riñón (figura 1). Aislar el tejido de la corteza de ambos hemisferios por talla hacia fuera de la región medular con el bisturí (Figura 1E) y cortar el tejido de la corteza en trozos de 0,5 cm3 (Figura 1F). Retire cualquier vasos visibles.
  3. Aislamiento de la matriz extracelular
    1. En una campana de cultivo de tejidos, llene un vaso de precipitados de 1000 mL con 500 mL de solución al 1% SDS. Coloque la barra de tejido y revuelva de corteza picada en el vaso de precipitados que contenga solución de SDS. Cubrir el vaso con papel de aluminio esterilizado y coloque en una placa de agitación en aproximadamente 400 rpm fuera de la campana de cultivo de tejidos.
    2. Después de que el tejido de la corteza ha sido en la placa de agitación durante 24 h, poner el vaso en una campana de cultivo de tejidos y añadir un filtro de 40 μm células estériles con malla de nylon. Llene un vaso de precipitados de 1000 mL separadas con 200 mL de lejía y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos.
    3. Pipetear la solución de SDS a través de la coladera de la célula en el vaso de precipitados que contenga blanqueador. Pipetear a toda solución de SDS hasta que queden sólo tejido decellularized y el filtro de la célula en el vaso.
      Nota: El filtro de la celda debe impedir que cualquier tejido siendo eliminados durante la aspiración de la solución.
    4. Deje el filtro de la célula en el vaso y llénelo con 500 mL de solución fresca de SDS. Cubrir el vaso con el mismo papel de aluminio y coloque en un plato mezclar a la misma velocidad que antes.
    5. Repita los pasos 1.3.1-1.3.3 cada 24 horas con solución fresca de SDS para un total de cinco días.
    6. Tejido de enjuague decellularized con autoclave DI agua cada 24 h durante 3 días total, siguiendo la técnica se indica en pasos 1.3.1-1.3.3.
    7. Tejido decellularized de enjuague con agua de grado de cultura de célula cada 24 h durante 2 días total, siguiendo la técnica se indica en pasos 1.3.1-1.3.3.
    8. Repita los pasos 1.3.1-1.3.2. Transferir el tejido decellularized (denominado kECM desde este punto a) en una 30 mL autónomo tubo cónico y llenarlo con agua de grado cultivo celular hasta que el tejido quede sumergido.

2. fabricación de solución Stock de hidrogel

  1. Proceso mecánico de tejido decellularized
    1. En una campana de cultivo de tejidos, mecánicamente homogeneizar la kECM dentro del tubo cónico con un homogeneizador de tejidos por 2 min.
      Nota: KECM homogeneizada debe parecerse una solución opaca sin pedazos visibles de ECM.
    2. Sumerja el tubo cónico que contiene kECM en nitrógeno líquido hasta ebullición que rodea el tubo ya no persiste. Guarde el kECM en-4 ° c durante la noche.
  2. Liofilización de tejido congelado decellularized
    1. Afloje ligeramente la tapa del tubo cónico para permitir intercambio del gas y coloque el tubo en una máquina de liofilización. Liofilizar el kECM durante tres días o hasta que se asemeja a un fino polvo blanco. Tienda a-4 ° c.
  3. Digestión química y solubilización de gel
    1. Autoclave de un vial de centelleo de 20 mL y tapa, una barra de agitación de 15.9 x 7.9 mm y un par de pinzas de punta fina.
    2. Pesar el kECM liofilizado y calcular el volumen de ácido clorhídrico y la masa de pepsina necesaria para solubilizar el kECM a una solución de 3% (30 mg/mL) usando las siguientes ecuaciones, donde m lapepsina es la masa de pepsina, tejido de m es la masa de tejido liofilizado y VHCl es el volumen de HCl N 0.01:
      figure-protocol-6115
      figure-protocol-6184
    3. En una campana de cultivo de tejidos, agrega pepsina gástrica porcina, 0.01 N HCl y la barra de agitación para el vial de centelleo y dejarlo en un plato mezclar a aproximadamente 500 rpm hasta que se disuelva la pepsina. KECM liofilizado de transferencia al vial de centelleo y dejar la solución en una placa de agitación a aproximadamente 500 rpm durante tres días.

3. hidrogel gelificación

  1. Preparación del hidrogel de riñón ECM
    1. El hidrogel del gel mediante la mezcla de la solución madre de hidrogel de kECM con 1 N NaOH, 10 x suplemento de medios de comunicación (M199) y medios de cultivo de células. Mantenga todas las soluciones en el hielo.
      Nota: Gel Final concentraciones de 7,5 mg/mL fueron utilizadas para el cultivo celular. 1 mL de gel de kECM era suficiente para experimentos de cultivo celular presentados.
    2. Determinar el volumen de gel realizable kECM producido y el volumen de hidrogel kECM stock necesario utilizando la siguiente ecuación, donde Vfinal es el volumen de gel creado, VkECM común es el volumen de hidrogel kECM stock necesario, Cacciones kECM es la concentración de la hidrogel de acción kECM, y Cfinal es la concentración del gel final:
      figure-protocol-7597
    3. Determinar el volumen de neutralizar reactivos necesarios utilizando las siguientes ecuaciones, donde VNaOH es el volumen de 1 N NaOH, 10 X de V es el volumen de M199 suplen 10 medios X y V1 X es la volumen de medios de cultivo celular:
      figure-protocol-7979
      figure-protocol-8048
      figure-protocol-8117
    4. En una campana de cultivo de tejidos, pipetear los reactivos neutralizantes (NaOH M199 y medios de cultivo celular) en un estéril 30 mL autónomo tubo cónico. Mezcle la solución de reactivo neutralizante con una microspatula.
    5. Utilice una jeringa estéril de 1 mL para transferir el volumen apropiado de hidrogel kECM acciones para la solución de reactivo neutralizante. Utilice un microspatula para mezclar suavemente la solución hasta obtener una homogénea en solución del color del hidrogel.
      Nota: Evitar la introducción de burbujas de aire agitando lentamente y suavemente.
    6. Para incorporar las células en el hidrogel kECM, reste 10 μl de medio de cultivo celular (V1 X) de los cálculos de volumen de solución neutralizante en paso 3.1.1.3.
      1. Suspender las células en 10 μl de medio de cultivo celular. Determinar el número de células suspensión utilizando la siguiente ecuación, donde #células implica el número de células en suspensión yfinal de V es el volumen de gel creado:
        figure-protocol-9250
        Nota: 300.000 células/mL es la concentración de células en el gel de kECM.
      2. Pipetear 10 μl de solución celular suspendido en el gel de kECM final después de la solución kECM se ha mezclado con una solución de reactivo que neutraliza. Agitar la solución con un microspatula hasta que las células se distribuyen uniformemente.
  2. Utilice una jeringa de 1 mL para llenar un dispositivo de la cultura de célula deseada con el hidrogel de kECM.
  3. Permita que el gel fijar a 37 ° c durante 1 hora antes de transferir o células de la galjanoplastia.

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Resultados

El hidrogel de kECM proporciona una matriz para el cultivo celular de riñón con composición química similar como el microambiente del riñón nativo. Para fabricar el hidrogel, tejido de la corteza renal es mecánicamente aislada de un órgano riñón entero y picado (figura 1). Descelularización con un detergente químico (figura 2A.1-A.3) seguido por enjuagues con agua para eliminar partículas de detergen...

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Discusión

Matrices proporcionan importantes señales mecánicas y químicas que rigen el comportamiento de la célula. Hidrogeles sintéticos son capaces de apoyar complejo dibujo 3 dimensiones pero no proporciona las señales extracelulares diversas encontradas en microambientes matriz fisiológica. Hidrogeles derivados de ECM nativa son materiales ideales para los estudios tanto en vivo como en vitro . Estudios previos han utilizado hidrogeles decellularized de ECM para recubrir biomateriales sintéticos para e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer la Lynn y Mike Garvey imagen laboratorio del Instituto de células madre y medicina regenerativa y LifeCenter NorthWest. También les gustaría reconocer el apoyo financiero de subvenciones de los institutos nacionales de salud, TR000504 UH2/UH3 (a J.H.) y DP2DK102258 (a Y.Z.), beca de formación de NIH T32 DK0007467 (a R.J.N.) y un regalo sin restricción de los centros de riñón de noroeste a la Instituto de investigación del riñón.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Preparation of Kidney Tissue
5000 mL BeakerSigma-AldrichZ740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma-Aldrich436143
Sterile H2OAutoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm)Fisher Science14-512-128
500 mL Vacuum FilterVWR97066-202
Stir PlateSigma-AldrichCLS6795420D
1000 mL BeakerSigma-AldrichCLS10031L
ForcepsSigma-AldrichF4642Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat ClampSigma-AldrichZ168866
Dissecting ScissorsSigma-AldrichZ265977
Scalpel Handle, No. 4VWR25859-000Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20VWR25860-020Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)Fisher Science14-513-52
Absorbent UnderpadVWR82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm)Corning430597
Autoclavable Biohazard BagVWR14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um)Fisher Science22-363-547
Cell Culture Grade WaterHyCloneSH30529.03
30 mL Freestanding TubeVWR89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer MachinePolytronPCU-20110
Freeze DryerLabconco7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and CapSigma-AldrichV7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm)Fisher Science14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric MucosaSigma-AldrichP7012
0.01 N HClSigma-Aldrich320331Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile)Sigma-Aldrich415413Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199Sigma-AldrichM4530
15 mL Conical TubeThermoFisher339651
Cell Culture MediaThermoFisher11330.032Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10082147
Antibiotic-Antimycotic 100XLife Technologies15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100XLife Technologies51300-044
1 mL SyringeSigma-AldrichZ192325
MicrospatulaSigma-AldrichZ193208

Referencias

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