Un túnel de viento para olor mediada por insectos ensayos conductuales

Resumen

Aquí, describimos la construcción y el uso de un túnel de viento para olor había mediada ensayos conductuales con insectos. El diseño de túnel de viento facilita la liberación de las fuentes de olor por varios métodos, con y sin estímulos visuales. Túnel de viento los experimentos es métodos importantes para identificar su comportamiento activos sustancias químicas volátiles.

Resumen

Olfato es el más importante mecanismo sensorial por el cual muchos insectos interactúan con su entorno y un túnel de viento es una excelente herramienta para el estudio de la ecología química de insectos. Insectos pueden localizar fuentes puntuales en un entorno tridimensional a través de la interacción sensorial y sofisticado comportamiento. La cuantificación de este comportamiento es un elemento clave en el desarrollo de nuevas herramientas para el soporte de control y decisión de plagas. Un túnel de viento con una sección de vuelo adecuado con flujo de aire laminar, visual de señales de feedback durante el vuelo y una variedad de opciones para la aplicación de los olores puede utilizarse para medir el comportamiento complejo que posteriormente puede permitir la identificación de atractivos o repelente de olores, características de vuelo de insectos, interacciones de olor visual e interacciones entre atrayentes y olores persistentes como los olores de fondo en el ambiente. Un túnel de viento tiene la ventaja de estudiar el olor mediado el repertorio conductual de un insecto en un entorno de laboratorio. Las medidas conductuales en un ambiente controlado proporcionan el enlace entre la fisiología de insectos y la aplicación de campo. Un túnel de viento debe ser una herramienta flexible y fácilmente debe apoyar los cambios en la configuración y el hardware para preguntas de investigación. La desventaja principal a la configuración de túnel de viento se describe aquí, es el fondo de olor limpio que requiere especial atención en el desarrollo de una mezcla volátil sintético para aplicaciones de campo.

Introducción

El túnel de viento es una herramienta importante en estudios de Ecología química de insectos que permiten las pruebas de laboratorio de las respuestas de vuelo insectos a los semioquímicos. Por liberación de olores en una corriente de viento controlado, la respuesta de comportamiento de los insectos a estos estímulos puede controlarse directamente por estudiar su vuelo ceñida hacia la fuente. Olfato es el más importante mecanismo sensorial por el cual muchos insectos interactúan con su medio ambiente biótico¹. Insectos usan señales de olor para encontrar a socios adecuados para el apareamiento. Del mismo modo, utilizan Ramos de olor de recursos de host a buscar alimentos por sí mismos, o la descendencia. Plantas liberan olores florales en combinación con recompensas néctar y polen para garantizar la eficiencia de la polinización de insectos. Todas estas señales volátiles difunden pasivamente en el medio ambiente y necesitan de insectos identificar e interpretar su importancia individual. Como volátiles son liberados en el medio ambiente, las moléculas viajan con el viento como filamentos, manteniendo la concentración inicial para las largas distancias en la empopada, antes de finalmente ser roto y diluido por turbulencia y difusión². Insectos pueden detectar cambios pequeños en la volátil de la señal y dirigen su movimiento contra el viento, hacia la fuente. Insectos mostrar un comportamiento de vuelo con sobretensiones rápido ceñidas al contacto con un olor atractivo, y hacia los lados del bastidor sobre la pérdida de trasladar el olor del penacho^3,4. El arreglo Co localizado de neuronas olfativas en el sensillo de las antenas de insectos puede facilitar las respuestas del comportamiento a la aparición y pérdida de contacto de la pluma con notable alta resolución⁵ y permitir que los insectos se distinguen entre similares moléculas de olor procedentes de diversas fuentes⁶. Retroalimentación visual mientras que en vuelo, denominado anemotaxis optomotor, es fundamental para identificar la dirección del viento, los objetos y desplazamiento relativo^2,7. Por el uso de la interacción sensorial y comportamiento sofisticado, insectos pueden localizar fuentes puntuales en un entorno tridimensional.

La identificación de insectos atrayentes y repelentes puede tener varios importantes aspectos aplicados. Feromonas (señales intraespecíficas) de muchos insectos plaga pueden ser sintetizadas y liberadas en el aire para interrumpir el acoplamiento comportamiento⁸. Las feromonas y kairomonas (señales interespecíficas) pueden ser utilizado para la captura masiva, atraen y mataron en la supervisión de trampas para dar información directa del estado de la plaga. Repelentes de insectos tales como mosquitos⁹, también se pueden estudiar en pruebas biológicas de túnel de viento. Estos métodos desempeñan un papel importante de plagas sistemas de soporte de gestión y decisión de los agricultores.

Pruebas biológicas de túnel de viento, donde el repertorio de comportamiento mediado de olor de una especie puede ser monitoreado, es un método eficaz para identificar posibles nuevas herramientas para el control de plagas sustituir o reducir el impacto del uso de plaguicidas.

El razonamiento teórico detrás del diseño del túnel de viento es minuciosamente descrito¹⁰. Aquí, describimos la construcción del túnel de viento, aplicación de olor y comportamiento de vuelo que se ha utilizado en varios experimentos para determinar el protocolo de túnel de viento prueba. El túnel de viento (figura 1) en el Nibio (Ås, Noruega) está hecho de policarbonato transparente resistente a los arañazo. El campo de vuelo es de 67 cm de alto, 88 cm de ancho y 200 cm de largo. Frente a la arena de vuelo, hay una sección adicional de policarbonato de 30 cm de largo. Esta parte del túnel de viento sirve como una sección de utilidad para la aplicación de los olores. Si los volátiles se ponen en contacto con el policarbonato de la vivienda en el campo de vuelo, más adelante puede ser re-lanzado y contaminan entre sesiones. En cada extremo de la sección de utilidad, por lo tanto hay una rejilla metálica perforada. Ambas redes restringen el flujo de aire y crean una ligera sobrepresión en el lado del upwind. Esto resulta en aumento del flujo laminar en el lado downwind. La rejilla de viento se hace de una placa de metal perforada con orificios de 8 mm dispersados uniformemente a través de la sección transversal del túnel para proporcionar 54% espacio abierto. La rejilla de viento tiene agujeros de 3 mm y un 51% de área abierta. Esto reduce la turbulencia y se asegura de que el olor a pluma viaje centralmente a lo largo de la arena de vuelo. El plume del olor tendrá la forma de un cono estrecho y puede ser visualizado por el uso de humo. En la planta del vuelo arena, plástico o papel de círculos de diferentes tamaños (de 5 a 15 cm de diámetro) están dispuestos a dar retroalimentación visual de insectos durante el vuelo. Hay una puerta de acceso de 25 por 50 cm en el extremo de upwind de la arena de vuelo y en la sección de utilidad. Entre el viento final de la arena de vuelo y la sección del filtro de escape, hay un área abierta de 60 cm para el manejo de insectos. Esta área está cubierta en los lados con una tela de 0,8 mm con malla para evitar que los insectos que escapan a la habitación.

Aire se mete en la primera caja del filtro por un ventilador. El aire pasa a través de un filtro de polvo antes de ser purificada por 24 filtros de carbón activo de alta capacidad y aparecido en el túnel. El aire al salir del túnel se pasa a través de una caja de filtro similares antes de ser liberado en el ambiente. Podría ser beneficioso para el aire hacia el exterior del edificio a través de una campana de humos de escape. Los ventiladores en ambos cárteres del filtro funcionan con flujo igual. Ambos ventiladores tienen un interruptor atenuador continuo y se calibran a velocidades del viento diferentes utilizando un medidor de caudal. La velocidad del aire es dependiente de las especies. 30 cm s^-1 es a menudo un buen punto de partida. Para pequeños insectos, puede reducirse la velocidad ideal del aire, y para volantes fuertes, la velocidad puede ser mayor para aumentar la distancia de vuelo relativo.

La sala de túnel de viento facilita el control de la temperatura, la humedad y la intensidad de la luz. Tiras de LED se colocan detrás de un panel de poly(methyl methacrylate) opaco de 3 mm para crear una fuente difusa de luz arriba y detrás de la arena de vuelo. Ambas fuentes de luz pueden controlarse independientemente.

Aplicación de olor puede lograrse por varios medios. En general, los olores son liberados en el flujo de aire en el centro del extremo upwind de la arena de vuelo. Según las preguntas de investigación a mano, el punto de lanzamiento puede expuesto o cubierto. Un cilindro de vidrio (diámetro de 10 cm, 12,5 cm de largo) con una malla de metal (tamaño de acoplamiento de 2 × 2 m m) en el lado downwind visualmente puede bloquear la fuente de olor y a la vez servir como una plataforma de aterrizaje para los insectos. En muchos experimentos, una plataforma de cristal horizontal puede utilizarse para la presentación de fuentes de olores o señales visuales cerca del punto de lanzamiento. También es la oportunidad para lanzar dos olores a la vez, lado a lado, para facilitar el análisis de la elección. Los puntos de desenganche se colocan 20 cm aparte y las estelas de olores superponen de hasta la mitad del túnel. La elección se puede identificar entonces por cual penacho el insecto está siguiendo contra el viento.

El diseño del túnel de viento facilita numerosos métodos de liberación volátiles. Por ejemplo, se puede lanzar un olor específico frente a un olor de fondo tales como emitido por una planta de cultivo^11,12. También, diferentes estímulos visuales pueden ser probado^13,14. La disposición experimental debe adaptarse a cada pregunta de investigación y especies.

Fuentes de olor natural como partes de la planta y los olores sintéticos de dispensadores pueden introducirse directamente en el campo de vuelo. Para aislar el olor mediada por comportamientos de visual, la fuente de olor puede ser cubierta, o los volátiles llevaron a la arena de vuelo a través de un suministro de aire de carbón laboratorio filtrada desde el exterior. La fuente de olor se limita entonces a un tarro de cristal y el aire es empujado a través de la jarra en el túnel de viento a través de tubos de teflón y tubos de vidrio. La velocidad en el punto de liberación debe coincidir con la velocidad del viento en la arena.

Para liberar los olores a ratios de mezcla específico, puede utilizarse un pulverizador. El rociador es un inyector ultrasónico con una punta cónica y un insertado microbore para facilitar un flujo líquido en 10 μl min^-1. La boquilla está conectada a un generador de ultrasonidos de banda ancha y opera a 120 kHz. Una bomba de la jeringuilla está impulsando la muestra del olor en la boquilla del rociador. Fluorado etileno propileno (FEP) con tubería de 0,12 mm de diámetro interior conecta la jeringa de 1 mL prueba de gas y la boquilla. Adaptadores de tubería que se hinchan en etanol y encogen en el aire, facilitar ajustada con ningún volumen interno. El tamaño de la gota de aerosol generado por la vibración de la boquilla es frecuencia dependiente y depende el disolvente específico usado. Las pequeñas gotitas se evaporan y se traen abajo del túnel de viento como volátiles. También existen otros diseños de rociador y una versión más barata utilizando un piezo por vidrio capilar ofrece una solución similar¹⁵.

Mezclas sintéticas o colecciones del espacio de cabeza se pueden utilizar con el pulverizador. Las muestras se diluyen con etanol puro a las concentraciones deseadas. Con colecciones de volátiles, la muestra puede ser diluida para corresponder a la época de la colección. Esto significa que debe diluirse una colección volátil muestreada durante 3 h a 1800 μl, que con una versión tipo de rociador en 10 μl min^-1 corresponde a 3 h.

La identificación del comportamiento del vuelo puede hacerse directamente por la observación manual o por análisis post-hoc de video. El vuelo orientado debe ser distinguido de vuelo aleatorio. Olor mediado conducta puede reconocerse por las siguientes características: vuelo de zig-zag en el olor del penacho, upwind recto vuelo dentro de la pluma, y bucle de nuevo si se pierde el contacto con la pluma. Sobre la pérdida de un penacho de atractivo, los insectos también pueden empezar a zig-zag con el aumento de arcos para volver a conectar el penacho perdido^3,4. Este comportamiento es fundamental en un ambiente de campo donde los insectos sigue un olor atractivo necesitan hacer frente a turbulencias y vientos de cambio. El patrón de vuelo no es uniforme y varía según las órdenes de insectos. Por ejemplo, volantes fuertes como pupas de moscas tienen una orientación más rápida ceñida con el patrón de colada más amplia que las polillas, y aumente la velocidad del viento para facilitar una más larga trayectoria relativa.

El vuelo de un insecto puede también ser filmado. Con una sola cámara, características de vuelo simple pueden ser descritas mediante el trazado de la x y coordenadas¹⁶. Mediante el uso de dos cámaras con la captura de marco sincronizados, se puede reconstruir el vuelo 3D usando un software externo¹⁷. La pista de vuelo luego puede ser analizada para dar información sobre la velocidad de vuelo y distancia, los ángulos de vuelo con respecto a la dirección del viento y los detalles sobre las características del vuelo en relación con el plume del olor. Hay equipo de encargo y comercial y software disponible que permiten el seguimiento automático del cuadro por cuadro. Los cuadros de calibración deben utilizarse para referenciar el espacio del mundo real, y pueden usarse para minimizar la distorsión de la lente rectilíneas lentes gran angular. Debe tenerse cuidado para reducir el ruido de fondo visual, tales como bordes y esquinas en la arena del túnel de viento y para maximizar el insecto a la discriminación de fondo. Mediante el uso de una fuente de luz infrarroja, la reflexión (ej., de los mosquitos nocturnos) puede ser filmado con monocromática CCD cámaras¹⁷.

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Protocolo

1. preparación de tubos de vidrio

1. Preparar los tubos de vidrio (por ej., 2,8 cm de diámetro, 13 cm de largo) y cerrar un extremo con un casquillo de plástico rápido.
2. Separar 10 insectos en los tubos de vidrio tapado y cubre el extremo restante con una gasa con una goma. Permita que los insectos para aclimatarse a la temperatura, las condiciones de luz y humedad de la habitación de túnel de viento de al menos 2 h.
   Nota: El número de insectos dentro de cada tubo depende de la pregunta de investigación y especies.

2. preparación de fuentes de olor

1. Protocolo de rociador.
   1. Llene la jeringa de prueba de gas de 1 mL con una colección de headspace diluido o una mezcla de olor sintético.
      Nota: El contenido del espacio diluido o mezcla de olor sintético depende de pregunta de investigación y especies de insectos. En general, las concentraciones utilizadas deben corresponder a las tasas de liberación natural de la fuente de olor auténticos.
   2. Conecte la punta de la jeringa a la tubería de FEP con adaptadores de tubería e Inserte la jeringa en la bomba de jeringa.
   3. Arrancar la bomba de jeringa.
   4. Iniciar el generador de ultrasonidos de banda ancha.
      Nota: La liberación del aerosol del rociador puede confirmarse señalando una antorcha de luz desde el punto de lanzamiento.
   5. Ejecute el pulverizador con etanol a 96% para un mínimo de 10 minutos entre los tratamientos para limpiar el interior de los tubos y boquilla. Limpieza de uso una jeringa separada, dedicada al etanol puro, para todos.
   6. Limpiar las jeringas y la punta de la boquilla con etanol 96% después de su uso.
2. Protocolo de la fuente del olor auténticos.
   1. Inserte las fuentes de olor auténticos en el túnel de viento o en un frasco de colección de headspace de 2 L.
   2. Conectar el frasco de colección de espacio libre para el flujo de aire del laboratorio y liberar en el túnel de viento.
      Nota: Planta recoger material como el comienzo de los experimentos como sea posible y prevenir marchitez insertando el extremo cortado en un frasco pequeño con agua. La cantidad y tipo de material vegetal u otra fuente de olor auténticos, depende de la pregunta de investigación y especies de insectos.
3. La posición el tubo de vidrio con los insectos en un soporte 180 cm sotavento de la fuente de olor visual y 30 cm del suelo. El extremo tapado debe apuntar contra el viento.

3. a partir del Protocolo de

1. Usar dos cámaras para capturar dos diferentes puntos de vista. Montar las cámaras sobre la arena de vuelo y ángulo para capturar dos diferentes puntos de vista.
2. Abra la tapa.
3. Iniciar el temporizador.
   Nota: Diferentes especies requieren diferentes marcos de tiempo para responder, por ejemplo., la polilla de la fruta de apple (Argyresthia conjugella) responderá dentro de 4 a 5 min¹¹, pero la polilla grapewine (Lobesia botrana) requieren hasta 20 minutos para responder ¹⁸.
4. Observar el patrón de vuelo y prestar especial atención a las características de vuelo y orientación upwind. Anotar el funcionamiento de vuelo según las categorías de comportamiento predefinidos, por ejemplo., despegue, vuelo vuelo orientada sobre una distancia corta (mínimo 20 cm), orientado sobre larga distancia (< 5 cm de la fuente) y el aterrizaje.
   Nota: Pueden utilizarse para dar información más detallada sobre las características de vuelo filmando y seguimiento 3D con dos cámaras. En general, las cámaras están montadas sobre la arena de vuelo y ángulo para capturar dos diferentes puntos de vista.
5. Recoger los insectos en las paredes del túnel de viento, fuera el plume del olor y vuelva a colocar en el soporte.
   Nota: Los insectos pueden tener una oportunidad de responder a los olores con vuelo ceñida y no sustituirse.
6. Cambio para limpiar hardware de cristal entre los tratamientos.
   Nota: Deben ejecutar tratamientos de control frecuente para identificar las fuentes de posible contaminación.
7. Eutanasia a los insectos con CO₂ o por congelación después de los experimentos.
   Nota: Dependiendo de la pregunta de investigación, las hembras se anotó para el desarrollo del huevo o una inspección visual para verificar la condición de alas o antenas.

4. limpieza

1. Lavar todos los elementos de metal y vidrio con etanol y agua y dejar hasta que se seque.
2. Calentar todos los elementos metal y cristal a 300 ° C por 6 h eliminar los contaminantes.

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Resultados

Pupas de moscas responde fuertemente a los olores de animales muertos que representa un efímero crecimiento larvario sustrato^19,20. Usando ratones muertos como una fuente de olor natural, investigó los detalles del comportamiento del vuelo de 15 días de edad, había acoplado hembra C. vicina, con o sin un estímulos visuales junto a la liberación de olor punto¹³. Para eliminar la señal visual ...

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Discusión

El túnel de viento es una herramienta útil para la identificación de olores atractivos y repelentes para muchos insectos^4,9. Con sólido conocimiento de la ecología, la biología y el comportamiento de los insectos estudiados, se pueden identificar fácilmente sus características de vuelo y las condiciones ambientales, la velocidad del viento, estímulos visuales y aplicación de olor pueden ser adaptados para encajar. Se recomienda al comenzar hacia fuera c...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flight arena	any	NA	Construct to fit the filter housing
Filter housing x 2	Camfill Farr		Contains the dust and charcoal filters
Fan x 2	Fischbach	Model D640/E35	Silent fan with continous dimmer switch
Perforated grids	any	NA	Two different open areas are needed, e.g. 54 and 51%
Flowmeter	Swema air	Swema air 300	Identifying the wind speed
Ultrasonic sprayer	SonoTek		Sprayer nozzle with conical tip and inserted microbore
Broadband ultrasonic generator	SonoTek		Function generator
Syringe pump	CMA microdialysis	CMA 102	Liquid delivery
FEP tubing	CMA microdialysis		0.12 mm inner diameter
Tubing adaptors	CMA microdialysis		Connectors for zero internal volume
Gastight syringe	any	NA	1000 µL syringe for headspace collections and synthetic blends
Gastight syringe	any	NA	1000 µL syringe for cleaning sprayer
Torch	any	NA	Small light source for checking sprayer release
Timer	any	NA	Timer with alarm function
Holder for insect release	any	NA	Metal construction
Lighting	any	NA	LED is preferable due to low heat production
Moisturiser	any	NA	Size depends on volume of wind tunnel room
Temperature control	any	NA	Temperture range depends on species
Glass tubes	any	NA	Tubes (2.8 cm diameter, 13 cm long) for  insects
Snap cap	any	NA	Snap cap that fits the glass tube
Gauze	any	NA	Fabric to close the glass tube
Rubber band	any	NA	To hold gauze in place
Glass cylinder	any	NA	Cylinder for odour containment and landing platform (10 cm diameter, 12.5 cm long)
Glass jars	any	NA	Glass jars for dynamic headspace collection
Connectors and tubes	any	NA	Tubes and connectors depends on type of glass jars
Air supply	any	NA	From laboratory air or bottles
Charcoal filters	any	NA	For cleaning the outside air sypply
Vial	any	NA	Small vial with water to keep plant material fresh
Oven	any	NA	Heat metal and glassware to 300 degrees to decontaminate