Аэродинамической трубе для запаха при посредничестве насекомых поведенческих анализов

Резюме

Здесь мы описываем, строительство и использование аэродинамической трубе для запаха опосредованного поведения анализов с насекомыми. Аэродинамическая конструкция облегчает освобождение запах источников несколькими методами, с и без зрительных раздражителей. Аэродинамической эксперименты являются важными методами для определения функционально активных летучих химических веществ.

Аннотация

Обоняние является наиболее важных чувств механизм многих насекомых взаимодействуют с окружающей их средой и аэродинамической трубе является отличным инструментом для изучения химическая Экология насекомых. Насекомые могут найти точечных источников в трехмерной среде через сенсорные взаимодействия и сложное поведение. Количественная оценка такого поведения является ключевым элементом в разработке новых инструментов для вредителей контроля и поддержки принятия решений. Аэродинамической трубе с разделом подходящий рейс с ламинарного воздушного потока, visual сигналы для бортового обратной связи и разнообразные возможности для применения запахи могут быть использованы для измерения сложного поведения, который впоследствии может позволить выявить привлекательные или репеллент запахи, насекомое летные характеристики, visual запах взаимодействия и взаимодействия между аттрактанты и запаха затяжной как фон запахи в окружающей среде. Аэродинамической держит преимущество изучения запаха при посредничестве поведенческие репертуар насекомого в лабораторных условиях. Поведенческие меры в контролируемых условиях обеспечивают связь между физиологии насекомых и области применения. Аэродинамической трубе должно быть гибким инструментом и должны легко поддерживать изменения в установки и оборудование для исследования различных вопросов. Основным недостатком в аэродинамической установки, описанных здесь, это фон чистый запах, который требует особого внимания при разработке синтетических летучие смеси для применения в полевых условиях.

Введение

В ветровом туннеле является важным инструментом в исследованиях химическая Экология насекомых, которые позволяют лабораторные испытания ответы насекомых полет на semiochemicals. Выпуская запахи в контролируемых ветер поток, насекомых поведенческие реакции на эти стимулы могут отслеживаться непосредственно, изучая их наветренной полет к источнику. Обоняние является наиболее важным механизмом чувств, в которой многие насекомые взаимодействуют с их биотического окружающей среды¹. Насекомых использовать запах подсказки для поиска подходящих партнеров для спаривания. Аналогичным образом они используют запах букеты из ресурсов узла чтобы найти пищу для себя, или потомство. Растения релиз цветочные запахи в сочетании с нектара и пыльцы награды для обеспечения эффективности насекомых опыление. Все эти сигналы летучих диффузного пассивно в окружающую среду и насекомых необходимо определять и интерпретировать их индивидуальные значения. Как летучих веществ выбрасываются в окружающую среду, молекулы путешествия с ветром как нитей, сохраняя начальной концентрации на большие расстояния по ветру, прежде чем в конечном итоге разобран и разбавлена турбулентности и диффузии². Насекомые могут обнаружить малейшие изменения в летучих сигнала и направить их движение против ветра, к источнику. Насекомых отображения рейса поведение с быстро наветренной скачков при контакте с привлекательный запах, и литье боком на потерю переехать запах шлейфа^3,4. Организация совместного локализованных обонятельных нейронов в членистоногих насекомых антенн можно облегчить поведенческих реакций в наступление и потери контактов шлейфа с замечательным высоким разрешением⁵ и включить насекомых различать подобные запах молекулы, поступающих из различных источников⁶. Визуальную обратную связь во время в полете, называется optomotor anemotaxis, имеет основополагающее значение для определения направления ветра, объектов и относительного смещения^2,7. С помощью сенсорного взаимодействия и сложное поведение насекомых можно найти точечных источников в трехмерной среде.

Выявление аттрактантов насекомых и репелленты могут иметь несколько важных прикладных аспектов. Секс феромоны (внутривидовой сигналы) многих насекомых-вредителей могут быть синтезированы и выпустили в воздух, чтобы сорвать сопрягая поведение⁸. Феромоны и кайромонов (межвидовой сигналы) могут быть использованы для массового треппинга, привлекают и убить в мониторинге ловушки, чтобы дать прямую информацию о статусе вредителей. Средства от насекомых, таких как комары⁹, также могут изучаться в аэродинамической трубе bioassays. Эти методы играют важной частью комплексной борьбы с вредителями поддержки систем управления и решения для фермеров.

Аэродинамической bioassays, где запах опосредованного поведения репертуар вида может контролироваться, это мощный метод для выявления потенциальных новых инструментов для борьбы с вредителями для замены или смягчения последствий использования пестицидов.

Теоретическое обоснование аэродинамической конструкции является подробно описаны¹⁰. Здесь мы описываем аэродинамической конструкции, запах приложения и рейс поведения, который был использован в нескольких экспериментов для определения аэродинамической биопроб протокола. Аэродинамической трубе (рис. 1) в Nibio (Ås, Норвегия) изготовлен из прозрачного поликарбоната к царапинам. Рейс Арена — 67 см высотой, 88 см шириной и длиной 200 см. Перед полета Арена есть раздел Дополнительные поликарбоната, 30 см длиной. Эта часть аэродинамической служит раздел Утилита для применения запахов. Если летучих получить контакт с поликарбоната жилье в рейс Арена, они могут впоследствии быть переиздан и загрязнять между сессиями. На каждом конце раздела утилита поэтому существует перфорированной металлической сеткой. Обе сетки ограничить поток воздуха и создать небольшое избыточное давление на наветренной стороне. Это приводит к увеличению ламинарного потока на подветренной стороне. Наветренной решётка изготовлена из перфорированной металлической пластины с 8 мм отверстия равномерно рассредоточены по поперечное сечение туннеля для обеспечения что 54% открытая площадка. По ветру сетка имеет отверстий 3 мм и 51% открытая площадка. Это уменьшает турбулентность и гарантирует, что запах шлейфа путешествия централизованно вниз по длине на арене полета. Шлейф запаха будет иметь форму узкий конус и могут быть визуализированы с помощью дыма. На полу рейса Арена, пластик или бумага кругов различных размеров (от 5 до 15 см в диаметре) изложены дать насекомых визуальную обратную связь во время полета. Существует 25 x 50 см дверца на наветренной конце полета арены и в разделе утилиты. Между ветру окончания рейса Арена и секцией фильтра выхлопных газов есть открытая площадка 60 см для насекомых обработки. Этот доступ область покрыта по бокам с 0,8 мм отверстиями ткани, чтобы предотвратить насекомых, спасаясь в комнату.

Воздух поступает в первый корпус фильтра с помощью вентилятора. Воздух проходит через фильтр пыли, прежде чем он очищается 24 высокой емкости активные Фильтры угольные и выпущен в туннеле. Воздух, выход из туннеля проходит через аналогичный корпус фильтра перед освобождением обратно в комнату. Это может быть полезным для вытяжного воздуха снаружи здания через вытяжной шкаф. Вентиляторы на обоих корпусы запускаются с равными потока. Оба вентилятора имеют непрерывный диммер и калибруются на различных скоростях ветра с помощью расходомера. Скорость воздуха зависит от видов испытания. s 30 см^-1 часто является хорошей отправной точкой. Для мелких насекомых идеальная скорость воздуха может быть уменьшен, и для сильной листовки, скорости полета может быть выше, чтобы увеличить расстояние относительного рейса.

Номер аэродинамической облегчает контроль температуры, влажности и освещенности. Светодиодные полосы размещены позади непрозрачной poly(methyl methacrylate) панель 3 мм для создания диффузного источника света выше и позади Арены полета. Как источники света можно управлять независимо.

Запах приложения можно достичь несколькими способами. Как правило запахов выпускаются в воздушный поток в центре наветренной окончания рейса Арена. В зависимости от исследования вопросов под рукой точки выхода может быть воздействию или покрыты. Стеклянный цилиндр (диаметр 10 см, длиной 12,5 см) с металлической сеткой (2 × 2 мм размер сетки) на подветренной стороне визуально может блокировать источник запахов и в то же время служить в качестве целевой платформы для насекомых. В многих экспериментов горизонтальный стекла платформа может использоваться для представления источников запаха, или визуальных сигналов недалеко от точки выхода. Существует также возможность освободить двух запахов в то же время, бок о бок, чтобы облегчить выбор анализов. Точки выхода затем помещаются 20 см друг от друга и запах шлейфов перекрываются с полпути вниз туннеля. Выбор может быть идентифицированы, который шлейфа насекомых после против ветра.

Аэродинамическая конструкция облегчает многочисленные летучие релиз методы. Например со специфическим запахом могут быть освобождены перед фон запах, такие как излучаемый^11,урожай растений¹². Кроме того различные визуальные раздражители могут быть протестированных^13,14. Экспериментальной установки должны быть адаптированы для каждого вида и исследований вопрос.

Естественный запах источников, таких как части растений и синтетического запаха от колонок могут быть введены непосредственно в арену полета. Чтобы изолировать запах опосредованного поведения от visual, источник запахов могут быть покрыты или летучих веществ осуществляется на арену рейс через уголь отфильтрованных Лаборатория подачи воздуха извне. Затем источник запахов ограничивается стеклянную банку, и воздух выталкивается через jar в аэродинамической трубе через стекло и тефлоновые трубки. Скорость полета на момент освобождения должен соответствовать скорости ветра на арене.

Выпустить запахов на конкретные смесь отношения, может использоваться опрыскивателя. Опрыскиватель является ультразвуковые сопло с коническим наконечником и вставленные microbore для облегчения потока жидкости в 10 мкл мин^-1. Сопло подключен к широкополосной ультразвуковой генератор и работает на 120 кГц. Шприцевой насос толкает образца запаха в сопло опрыскивателя. Фторированные этилена пропилена (FEP) трубки с внутренним диаметром 0,12 мм подключается Газонепроницаемая шприц 1 мл и сопла. Трубы адаптеров, которые набухают в этаноле и сжать в воздухе, облегчить обтягивающие не внутренним объемом. Размер капельки аэрозоля, создаваемые вибрации сопла зависит от частоты и зависит от конкретных растворителя используется. Маленькие капельки испаряются и принесены вниз аэродинамической как летучих веществ. Существуют также и другие проекты, распылитель и более дешевая версия, используя управляемые стеклянные капиллярные пьезо предоставляет аналогичные решения¹⁵.

Синтетических смесей или headspace коллекции может использоваться с распылителем. Образцы разрежаются с чистого этанола до требуемой концентрации. С нестабильной коллекций образец может быть разбавлен соответствуют время сбора. Это означает, что коллекцию летучих, отведать свыше 3 h следует разбавить до 1800 мкл, который на момент выпуска соответствует ставка от распылителя на 10 мкл мин^-1 до 3 ч.

Определение поведения рейс может быть сделано непосредственно ручной наблюдения или post hoc анализа видео. Ориентированных на рейс следует отличать от случайных полета. Запах опосредованного поведения могут быть признаны следующими характеристиками: Зиг заг перелет через запах шлейфа, прямо наветренной полета внутри факела, и цикл обратно, если контакт с шлейфа теряется. После потери привлекательным шлейфа насекомых может также начать Зиг заг с увеличением арки восстановить потерянные шлейфа^3,4. Это поведение является основополагающим в поле параметр где насекомых после привлекательный запах нужно справиться с турбулентности и изменение направления ветра. Схемы полета не является равномерным и варьируется в разных насекомых заказы. Например сильный листовки как blowflies имеют быстрее наветренной ориентации с широкой литья узором чем моли, и скорость ветра должна быть увеличена до содействия более длинный путь относительный полета.

Полета насекомых также может быть снят. С одной камерой можно описать простой лётные характеристики печати координаты y x¹⁶. Используя две камеры с синхронизированной захват экрана, 3D рейс могут быть восстановлены с помощью внешнего программного обеспечения¹⁷. Рейс Трек затем могут быть проанализированы давать информацию о скорость полета и расстояния, углы рейса в отношении направления ветра и подробности о лётных характеристик применительно к шлейф запаха. Есть пользовательские и торговое оборудование и программное обеспечение которое включить автоматическое отслеживание кадра. Калибровка кадры должны использоваться для ссылки на реальный мировое пространство, и прямолинейных широкоугольной линзы должны использоваться для сведения к минимуму искажения объектива. Для уменьшения визуальных фоновый шум, как кромки и углы в аэродинамической трубе Арена и максимизировать насекомых на фоне дискриминации следует соблюдать осторожность. С помощью инфракрасного источника света, отражение (например., от ночные комары) может быть снят с Монохромная CCD камеры¹⁷.

протокол

1. Подготовка стеклянных трубок

1. Подготовьте стеклянных трубочек (например., диаметр 2,8 см, длиной 13 см) и закрыть один конец с крышкой пластиковые оснастки.
2. Разделить ограничен стеклянных трубочек 10 насекомых и накрыть марлей, используя резинкой оставшиеся конце. Разрешить насекомых, чтобы акклиматизироваться к температуры, освещенности и влажности аэродинамической комнаты для минимум 2 ч.
   Примечание: Количество насекомых внутри каждой трубы зависит от видов и исследований вопрос.

2. Подготовка источников запаха

1. Опрыскиватель протокол.
   1. Заполните Газонепроницаемая шприц 1 мл с разбавленным headspace коллекции или смесь синтетического запаха.
      Примечание: Содержание разреженных headspace или синтетический запах смеси зависит от насекомых видов и исследований вопрос. В общем концентрации используется должно соответствовать ставки природных релиз подлинный запах источника.
   2. Подключите кончик шприца FEP трубок с помощью трубки адаптеров и вставьте шприц в шприцевой насос.
   3. Запустите шприцевой насос.
   4. Начало широкополосного ультразвуковой генератор.
      Примечание: Выпуска аэрозоля от опрыскивателя может быть подтверждена указывая факел света снизу точки выхода.
   5. Запустите опрыскиватель с Этанол 96% минимум 10 минут между процедурами для очистки внутри трубки и насадки. Использование отдельного шприц, посвященный чистого этанола, для всех очистки.
   6. После использования экологически чистые шприцы и кончик насадки с 96% этанола.
2. Аутентичные запах источник протокол.
   1. Вставьте подлинный запах источников в аэродинамической трубе или сосуд коллекции headspace 2 Л.
   2. Подключите headspace емкость коллекции к лаборатории воздушного потока и выпустить в аэродинамической трубе.
      Примечание: Сбор растительного материала как близко к начала экспериментов, как можно скорее и предотвратить увядание, вставив конце разреза в маленький пузырек с водой. Объем и тип растительного материала или другой источник аутентичных запах, зависит от насекомых видов и исследований вопрос.
3. Установите стеклянную трубку с insect(s) на держатель 180 см по ветру из источника запаха и визуальные и 30 см от земли. Capped конец должен указывать против ветра.

3. Начиная с протоколом

1. Используйте две камеры для захвата две разные точки зрения. Монтировать камеры выше рейса Арена и угловые, чтобы захватить две разные точки зрения.
2. Откройте крышку.
3. Запустите таймер.
   Примечание: Различные виды требуют разные сроки реагирования, например., плоды яблоко моли (Argyresthia conjugella) будет ответить в течение 4-5 мин¹¹, но grapewine моли (Lobesia botrana) требуют ответа до 20 мин ¹⁸.
4. Наблюдать картину рейса и уделять особое внимание летные характеристики и наветренной ориентацию. Оценка полетов согласно предварительно определенных поведенческих категорий, например., взлет, ориентированной полета на короткие расстояния (минимум 20 см), ориентированный на большие расстояния (< 5 см от источника) и посадки.
   Примечание: 3D отслеживания, используя две камеры и съемки может использоваться дать более подробную информацию о летных характеристик. В общем камеры монтируются над рейс-Арена и угловые, чтобы захватить две разные точки зрения.
5. Сбор насекомых, посадка на стенах в аэродинамическую трубу, вне шлейф запаха и заменить обратно на держатель.
   Примечание: Насекомые могут предоставляться один шанс, чтобы реагировать на запахи с наветренной рейса и не будут заменены.
6. Изменения для очистки стекла аппаратных между процедурами.
   Примечание: Частое контроля лечения следует запустить для выявления возможного загрязнения источников.
7. Усыпить насекомых или замораживания после экспериментов с CO₂ .
   Примечание: В зависимости от исследования вопрос, может быть забил для развития яйца или визуального осмотра проверить состояние крылья или усиков самки.

4. Очистка

1. Вымойте все аппаратные металла и стекла с этанол и вода и оставить до полного высыхания.
2. Тепло все стекла и металла оборудования до 300 ° C для 6 h для удаления загрязнений.

Результаты

Blowflies сильно реагирует на запахи от мертвых животных, которые представляет эфемерное роста субстрата^19,20. С помощью мертвых мышей в качестве источника природных запахов, мы исследованы детали рейса поведение 15 день старого, повязана жен?...

Обсуждение

В ветровом туннеле является полезным инструментом для выявления привлекательных и репелленты запахов для многих насекомых^4,9. С глубокими знаниями об экологии, биологии и поведения насекомых изучал его летные характеристики могут быть легко идентифици?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flight arena	any	NA	Construct to fit the filter housing
Filter housing x 2	Camfill Farr		Contains the dust and charcoal filters
Fan x 2	Fischbach	Model D640/E35	Silent fan with continous dimmer switch
Perforated grids	any	NA	Two different open areas are needed, e.g. 54 and 51%
Flowmeter	Swema air	Swema air 300	Identifying the wind speed
Ultrasonic sprayer	SonoTek		Sprayer nozzle with conical tip and inserted microbore
Broadband ultrasonic generator	SonoTek		Function generator
Syringe pump	CMA microdialysis	CMA 102	Liquid delivery
FEP tubing	CMA microdialysis		0.12 mm inner diameter
Tubing adaptors	CMA microdialysis		Connectors for zero internal volume
Gastight syringe	any	NA	1000 µL syringe for headspace collections and synthetic blends
Gastight syringe	any	NA	1000 µL syringe for cleaning sprayer
Torch	any	NA	Small light source for checking sprayer release
Timer	any	NA	Timer with alarm function
Holder for insect release	any	NA	Metal construction
Lighting	any	NA	LED is preferable due to low heat production
Moisturiser	any	NA	Size depends on volume of wind tunnel room
Temperature control	any	NA	Temperture range depends on species
Glass tubes	any	NA	Tubes (2.8 cm diameter, 13 cm long) for  insects
Snap cap	any	NA	Snap cap that fits the glass tube
Gauze	any	NA	Fabric to close the glass tube
Rubber band	any	NA	To hold gauze in place
Glass cylinder	any	NA	Cylinder for odour containment and landing platform (10 cm diameter, 12.5 cm long)
Glass jars	any	NA	Glass jars for dynamic headspace collection
Connectors and tubes	any	NA	Tubes and connectors depends on type of glass jars
Air supply	any	NA	From laboratory air or bottles
Charcoal filters	any	NA	For cleaning the outside air sypply
Vial	any	NA	Small vial with water to keep plant material fresh
Oven	any	NA	Heat metal and glassware to 300 degrees to decontaminate