Ultrasonido de alta frecuencia para el análisis del desarrollo Fetal y placentario en Vivo

Resumen

Aquí describimos la técnica de ultrasonido de alta frecuencia para el análisis en vivo de fetos de ratones. Este método permite el seguimiento de los fetos y el análisis de parámetros placentarios, así como el flujo de sangre materna y fetal durante el embarazo.

Resumen

Imágenes por ultrasonido son un método generalizado para detectar anomalías de órganos y tumores en los tejidos humanos y animales. El método es no invasivo, inocuo e indoloro, y la aplicación es fácil, rápido y puede realizarse en cualquier lugar, incluso con dispositivos móviles. Durante el embarazo, imágenes por ultrasonido se utilizan en forma estándar para vigilar estrechamente el desarrollo fetal. La técnica es importante evaluar la restricción del crecimiento intrauterino (RCIU), una complicación del embarazo corto y largo plazo consecuencias de salud para la madre y el feto. Entender el proceso de restricción del crecimiento intrauterino es indispensable para el desarrollo de estrategias terapéuticas eficaces.

El sistema de ultrasonido usado en este manuscrito es un dispositivo de ultrasonido para el análisis de pequeños animales y puede utilizarse en varios campos de investigación, incluyendo investigación de embarazo. Aquí describimos el uso del sistema para el análisis en vivo de fetos de natural killer (NK) células/la célula de mástil (bujía métrica)-deficiente de las madres que dan a luz a crías de crecimiento. El protocolo incluye la preparación del sistema, manejo de los ratones antes y durante las mediciones y el uso de la modalidad B, color doppler y ondas de pulso doppler. Se analizaron el tamaño fetal, tamaño placentario y suministro de sangre al feto. Encontramos tamaños de implantación reducidos y placentas pequeñas en ratones NK MC-deficientes de media gestación a partir. Además, MC, NK-deficiencia fue asociada ausente han invertido y flujo diastólico final en el fetal Arteria umbilicalis(UmA) y un índice de resistencia elevado. Los métodos descritos en el protocolo se pueden utilizar fácilmente para temas de investigación relacionados y no relacionados.

Introducción

El ultrasonido es ondas sonoras con frecuencias por encima del rango audible del oído humano, superior a 20 kHz¹. Animales como murciélagos, Gales, delfines^2,3, ratones⁴,⁵de ratas y ratón lémures⁶ todos utilizar ultrasonido para orientación o comunicación. Los seres humanos toman ventaja del ultrasonido para varias aplicaciones técnicas y médicas. Un dispositivo de ultrasonido es capaz de crear la onda de sonido y distribuir y representar la señal. Si el ultrasonido choca contra un obstáculo, el sonido es reflejado, absorbido o puede ir a través de él. La aplicación de la ecografía como un método de proyección de imagen, llamado sonografía, se utiliza para el análisis de tejidos orgánicos en humana o veterinaria como el corazón (ecocardiografía)^7,8, pulmón⁹,^{10 de la glándula tiroides} , riñones¹¹y^12,de las vías urinaria y reproductiva¹³; detección de cálculos biliares tumores de¹⁴ y¹⁵; y la evaluación de la perfusión de los vasos sanguíneos u órganos^16,17. El ultrasonido es un método estándar en el cuidado prenatal durante el embarazo, y discapacidades del desarrollo fetales o deterioros se pueden reconocer temprano. Específicamente, el crecimiento de un feto se controla estrechamente a intervalos regulares para reconocer un posible retraso del crecimiento intrauterino. Finalmente, el flujo sanguíneo fetal puede controlarse, como esto puede señalar restricciones de crecimiento^18,19,20,21.

Una ventaja importante de proyección de imagen de ultrasonido en comparación con otros métodos como la radiografía es inocuidad del sonido de los tejidos a analizar. Este método fácil y rápido es no invasivo, indoloro y puede ser utilizado varias veces. El desembolso inicial de un dispositivo de ultrasonido es caro; sin embargo, los materiales consumibles necesarios son baratos. El sistema de ultrasonido utilizado en este manuscrito es conveniente para una gama de modelos animales (es decir, ratones y peces) mientras que para los seres humanos un dispositivo de ultrasonido requiere una frecuencia de 3-15 mHz, una frecuencia de 15-70 mHz se requiere para los ratones.

El presente manuscrito describe un protocolo para el uso del modo B, modo doppler color y modo de doppler de onda de pulso. La descripción incluye la preparación de los ratones, así como rendimiento, adquisición de datos y almacenamiento. Este método ha sido cepas de ratón con éxito aplicadas a diferentes días en gestación y puede utilizarse para investigar el desarrollo fetal y placentario así como parámetros de la sangre materna y fetal. Aquí, todas las aplicaciones se explican en base nuestros estudios utilizando ratones embarazadas de NK MC-deficientes y el control.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD."

1. experimental procedimiento

1. Mate de 6 a 8 semanas de edad hembra MC-deficiente C57BL/6J-Cpa3^{Cre /+} (Cpa3^{Cre /+}) ratones y MC-suficiente C57BL/6J-Cpa3^+/+ (controles de Colonia; Cpa3^+/+) con ratones BALB/c machos.
2. Definir el día de gestación (gd) 0 después de la confirmación del tapón vaginal y tratar a las hembras inmediatamente después de la confirmación de enchufe.
   Nota: Un enchufe es el esperma del macho en el orificio vaginal de la hembra.
   1. Inyecte 250 μl de PBS por vía intraperitoneal en control Cpa3^+/+ hembras.
   2. Inyecte 250 μl de anti-CD122 (0.25 mg) por vía intraperitoneal en MC-deficiente Cpa3^{Cre /+} hembras.
      Nota: Una inyección de 0,25 mg de anti-CD122 agota NKs periféricas y uNKs en MC-deficiente Cpa3^{Cre /+} hembras como se describió anteriormente²².
3. Espere hasta gd5.
   Nota: En gd5, existe la posibilidad más temprana para el análisis de la implantación.
   1. Proceder con los pasos 2-5 para el análisis de ultrasonido.
4. Realizar la proyección de imagen de ultrasonido en gd5, 8, 10, 12 y 14.

2. preparación del sistema de ultrasonido

1. Encienda el sistema (figura 1A; alimentación principal en la espalda y el equipo espera en el sitio de izquierda), la plataforma de calefacción (figura 1B; en el teclado de control) y el más caliente del gel (figura 1).
   Nota: Gel del ultrasonido necesita calentamiento aproximadamente 0,5 hora.
2. Asegurar que la unidad de isoflurano es llenando suficientemente (figura 1).
3. Abrir un Nuevo estudio o una Serie nueva en un estudio actual en el navegador. Rellene la información requerida (propietario, nombre del estudio, nombre de la serie, datos animal) en la ventana de Información de estudio . Haga clic en Aceptar.
4. Después de hacer clic en Aceptar, asegúrese de que aparece la ventana de proyección de imagen de modo B y la proyección de imagen en modo B comienza automáticamente.

3. manejo del ratón

1. Anestesia del ratón
   1. Coloque el ratón en el cuadro de precipitación (Figura 1E), cerrar el cuadro de, abra el tubo de isoflurano al cuadro de precipitación y encienda el isoflurano (concentración 3.5%).
   2. Cuando el ratón está anestesiado, inferior (a 1.5% de concentración) y redirigir el flujo de isoflurano abriendo el tubo de la dirección de la plataforma de calefacción y cerrar el flujo de la caja de precipitación.
      Nota: Para alcanzar suficiente anestesia, esperar un adicional 10 s después de que el ratón ya no se está moviendo.
   3. Transferir el ratón rápidamente de la caja a la plataforma de calefacción (Figura 1F) en posición dorsal y Coloque suavemente su nariz en el tubo de la nariz de anestesia localizado en la parte superior de la plataforma.
2. Fijación, depilación y preparación del ratón para medir la
   1. Coloque la protección de los ojos crema en cada ojo del ratón para evitar la resequedad en los ojos.
   2. Coloque una gota de gel de electrodos en cada una de las cuatro áreas de cobre en la plataforma de calefacción (Figura 1F).
   3. Toque las patas con cinta quirúrgica en las áreas de cubierta de gel de electrodo de la plataforma de calefacción.
   4. Revise ECG [valor óptimo = 450-550 golpes/minuto (BPM)] y fisiología respiratoria en todo momento.
      Nota: Mediante el uso de una sonda rectal, la medición de la temperatura corporal es posible, pero no es necesario.
   5. Lugar depilatorio crema en el abdomen del ratón, frote la crema con un bastoncillo de algodón y espere alrededor de 1 minuto retirar la crema con una compresa empapada en agua. Repita este paso si no todos los vellos se han ido.
   6. Aplicar el ultrasonido con gel sobre la piel depilada.

4. mediciones y adquisición de imágenes y vídeos

1. Mantener el transductor (figura 1) en la mano o pinza en el dispositivo de sujeción (figura 1 H; sosteniendo el dispositivo se recomienda).
2. Identificar la vejiga con el transductor y utilizarlo como punto de referencia. Mover el transductor a los sitios de izquierda y derecho del abdomen para implantaciones de rastro.
3. B-modo de visualización de estructuras anatómicas en la imagen en escala de grises 2D
   1. Mover el transductor o tabla de plataforma donde el ratón está ocupado hasta que la primera implantación es visible en la pantalla a su tamaño más grande de la calefacción.
      1. Seleccionar Imagen etiqueta y escriba un nombre o Marco Store (almacenamiento sin nombre) para almacenar los marcos individuales, o Cine tienda para almacenar un cineloop para medidas de implantación todo.
   2. Mover el transductor o tabla para traer la placenta a una posición donde es visible el flujo sanguíneo en la UmA. Almacenar un solo cuadro o cineloop (ver paso 4.3.1.1) para mediciones de placentarias.
      Nota: Las mediciones placentarias son posibles desde gd10 adelante.
   3. Continuar con todos los implantes utilizando el mismo método.
4. Modo doppler color para visualizar y determinar la dirección del flujo de sangre
   1. Presione el botón de Color .
   2. Mover el cuadro de Color (en esta área, la señal es visible) en la posición deseada usando el trackball. Si es necesario, cambiar el tamaño de la caja pulsando Actualizar y mover el trackball (a la derecha/hacia arriba = mayor; para el lado-abajo izquierdo = más pequeño). Cuando la caja tiene el tamaño correcto, pulse seleccionar.
   3. Guardar marcos individuales o cineloops como se describe en el paso 4.3.1.1.
5. Modo de doppler de pulso (PW) para cuantificar el flujo de sangre a través de los vasos de la Arteria uterina (de la arteria uterina, UA) y UmA
   1. Ubicar la región de interés en la adquisición de doppler color.
      Nota: La UA se encuentra caudal a la vejiga y la UmA se encuentra entre el feto y la placenta.
   2. Prensa PWy una línea discontinua aparece. Desplazar esta línea vascular de interés y ajustar el ángulo de la línea utilizando el botón "Ángulo Doppler" en consonancia con el flujo de sangre. Pulse Actualizar.
      Nota: El ángulo entre la dirección del flujo sanguíneo y el transductor debe ser coherente en todos los animales, especialmente cuando se utilizan ángulos de más de 60° (aquí, 70° para UAs y 45° para UmAs fueron utilizados).
   3. Almacenar un cineloop de las líneas de doppler que aparece en la ventana de adquisición doppler PW.

5. revisión y acabado de adquisición de datos y una serie de ahorro

1. Para revisar los datos, pulse estudio gestión. Desplácese hasta la imagen en miniatura de interés y haga doble clic en actualización.
2. Comprimir primero Gestión de estudio cerca de la ventana del navegador para terminar la adquisición de datos y guardar una serie grabada.
   Nota: Después de cerrar una serie, no es posible almacenar marcos o cineloops en esta serie ya.

6. manejo de adquisición de datos del ratón

1. Retirar el gel de los animales anestesiados con la ayuda de compresas secas.
2. Retire cuidadosamente la cinta quirúrgica de las patas.
3. Cierre el tubo de isoflurano (concentración 0%).
4. Proceder con el siguiente análisis de ultrasonido en gd5, 8, 10 y 12.
   1. Coloque el animal solo en una jaula para un mínimo de 5 minutos así que tiene tiempo para despertar y orientar.
   2. Vuelva a colocar el ratón en la jaula original.
      Nota: No apague el isoflurano antes de retirar el gel y el esparadrapo, como ratones se despiertan muy rápidamente (alrededor de 20 s) después de apagar el isoflurano.
5. Proceder con el siguiente análisis de ultrasonido en gd14.
   1. Sacrificar a la hembra antes que despierte por dislocación cervical. Abrir el animal, extirpar el útero, separar los fetos y placentas y medir el peso fetal y placentario.

7. copiar e importar los datos

1. Marque una o más series haciendo clic en Exportar a y seleccione el espacio de almacenamiento para copiar datos en un disco duro.
2. Abra el software en un ordenador y haga clic en Copiar desde y seleccione la serie de estudios desde el disco duro para importar una serie de estudios en el software.
3. Analizar los datos con el software.

Resultados

Componentes individuales del sistema de ultrasonido utilizado en este manuscrito se muestran en la figura 1. La figura 2 muestra a representante adquirieron de imágenes de ultrasonido en modo B en gd5, 8, 10 y 12 (B) y en la medida correspondiente del área de implantación resultados (A), demostrando un área significativa implantación reducida de tratados con anti-CD122 Cpa3^{Cre / +}

Discusión

Utilizando nuestro sistema de ultrasonido, demostró restricción del crecimiento fetal en las madres MC NK-deficientes de gd10 en. Además, observamos en gd10 y 12, reducido tamaño placentario y gd14 la ausencia o reversión del flujo diastólico final en las uma de algunos fetos de ratones uMC/uNK-deficientes. Este signo de pobre vascularización se asoció con un índice significativo de la resistencia de las arterias que indica restricción del crecimiento intrauterino. Resultados confirman el papel importante de uM...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb)	BioLegend	123204	Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System	FujiFilm VisualSonics Inc.		Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software	FujiFilm VisualSonics Inc.
Isoflurane	Baxter	PZN: 6497131
Electrode gel	Parker	12_8
Surgical tape	3M Transpore	1527-1
Eye cream	Bayer	PZN: 1578675
Cotton tipped applicators	Raucotupf	11969	100 pieces
Depilatory cream	Reckitt Benckiser	2077626
Compresses	Nobamed Paul Danz AG	856110	10 x 10 cm
Ultrasound gel	Gello GmbH	246000