Ultra-som de alta frequência para a análise do desenvolvimento Fetal e placentário na Vivo

Resumo

Aqui descrevemos a técnica de ultra-som de alta frequência para análise na vivo de fetos em camundongos. Esse método permite o acompanhamento de fetos e a análise dos parâmetros da placenta, bem como o fluxo de sangue materno e fetal durante a gravidez.

Resumo

Ecografia é um método usado para detectar anomalias de órgãos e tumores nos tecidos humanos e animais. O método é não-invasivo, indolor e inofensivo, e a aplicação é fácil, rápido e pode ser feita em qualquer lugar, mesmo com dispositivos móveis. Durante a gravidez, o ecografia canonicamente é usada para acompanhar atentamente o desenvolvimento fetal. A técnica é importante para avaliar a restrição de crescimento intra-uterino (IUGR), uma complicação de gravidez com a curto e longo prazo consequências da saúde para a mãe e o feto. Compreender o processo de IUGR é indispensável para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes.

O sistema de ultra-som utilizado neste manuscrito é um dispositivo de ultra-som produzido para a análise de pequenos animais e pode ser usado em várias áreas de pesquisa, incluindo a investigação de gravidez. Aqui nós descrevemos o uso do sistema de análise em vivo de fetos de natural killer (NK) célula/mastócito (MC)-deficientes mães que dão à luz filhotes crescimento restrito. O protocolo inclui a preparação do sistema, manipulação dos ratos antes e durante as medições e o uso do modo-B, color doppler e modo doppler de onda de pulso. Foram analisados tamanho fetal, tamanho da placenta e fornecimento de sangue para o feto. Encontramos tamanhos reduzidos de implantação e menores placentas em camundongos NK/MC-deficiente do meio da gestação em diante. Além disso, MC/NK-deficiência foi associado ausente e inverteu o fluxo de diastólica final no fetal umbilicalis mesentéricos(UmA) e um índice de resistência elevada. Os métodos descritos no protocolo podem ser facilmente usados para tópicos relacionados e não relacionados à pesquisa.

Introdução

Ultra-som é ondas sonoras com frequências acima da faixa audível do ouvido humano, superior a cerca de 20 kHz¹. Animais como morcegos, país de Gales, golfinhos^2,3, ratos⁴, ratos⁵, e lémures rato⁶ todos usar ultra-som para orientação ou comunicação. Seres humanos aproveitam-se do ultra-som para diversas aplicações técnicas e médicas. Um aparelho de ultra-som é capaz de criar a onda sonora e distribuir e representar o sinal. Se o ultra-som encontra um obstáculo, o som é refletido, absorvido ou atravessá-la. A aplicação do ultra-som como um método de imagem, chamada ecografia, é usada para a análise dos tecidos orgânicos em humanos ou medicina veterinária como o coração (ecocardiografia)^7,8, pulmão⁹, glândula tireoide¹⁰ , rins¹¹e¹³.^12,o trato urinário e reprodutivo; detecção de cálculos biliares tumores de¹⁴ e¹⁵; e a avaliação da perfusão dos vasos sanguíneos ou órgãos de^16,17. Ultrassom é um método padrão no pré-natal durante a gravidez, e fetal do desenvolvimento incapacidades ou deficiências podem ser reconhecidas cedo. Especificamente, o crescimento de um feto é estreitamente monitorado em intervalos regulares para reconhecer um possível IUGR. Finalmente, o fluxo sanguíneo fetal pode ser monitorado, como isto pode apontar crescimento restrições^18,19,20,21.

Uma grande vantagem da ultra-sonografia em comparação com outros métodos, como radiografia é a inocuidade do som dos tecidos para ser analisado. Este método fácil e rápido é não-invasivo, indolor e pode ser usado várias vezes. O gasto inicial de um aparelho de ultra-som é caro; no entanto, os materiais consumíveis necessários são baratos. O sistema de ultra-som utilizado neste manuscrito é apropriado para uma variedade de modelos animais (i.e., ratos e peixes) enquanto que para os seres humanos, um dispositivo de ultra-som requer uma frequência de 3-15 mHz, uma frequência de 15-70 mHz é necessária para os ratos.

O presente manuscrito descreve um protocolo para o uso do modo B, modo doppler cor e modo de onda de pulso doppler. A descrição inclui preparação de ratos, bem como desempenho, aquisição de dados e armazenamento. Este método foi cepas de rato com êxito aplicada para diferentes gestacional em todos os dias e pode ser usado para investigar o desenvolvimento fetal e da placenta, bem como os parâmetros do sangue materno e fetal. Aqui, todos os aplicativos estão explicados com base em nossos estudos empregando ratos grávidas MC/NK-deficiente e controle.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD."

1. procedimento experimental

1. Companheiro de 6 a 8 semanas de idade feminina MC-deficiente C57BL/6J-Cpa3^{Cre /+} (Cpa3^{Cre /+}) ratos e MC-suficiente C57BL/6J-Cpa3^+/+ (controles de colônia; Cpa3^+/+) com os machos BALB/c.
2. Definir o dia de gestação (gd) 0 após a confirmação do plugue vaginal e tratar as fêmeas imediatamente após a confirmação do plug.
   Nota: Um plug é o esperma do macho no orifício vaginal da fêmea.
   1. Injectar 250 µ l de PBS intraperitonealmente em controle Cpa3^+/+ fêmeas.
   2. Injetar 250 µ l de anti-CD122 (0,25 mg) intraperitonealmente em MC-deficiente Cpa3^{Cre /+} fêmeas.
      Nota: Uma injeção de 0,25 mg de anti-CD122 esgota NKs periféricas e uNKs no MC-deficiente Cpa3^{Cre /+} fêmeas conforme descrito anteriormente,²².
3. Espere até gd5.
   Nota: No gd5, existe a possibilidade de mais antiga para análise de implantação.
   1. Prossiga com as etapas 2-5 para a análise de ultrassom.
4. Realizar a ultra-sonografia em gd5, 8, 10, 12 e 14.

2. preparação do sistema de ultra-som

1. Ligue o sistema (figura 1A; poder principal na parte traseira e o computador em espera no local da esquerda), a plataforma aquecida (figura 1B; no painel de controle) e o gel aquecedor (Figura 1).
   Nota: O gel de ultra-som precisa aquecer durante aproximadamente 0,5 h.
2. Certifique-se de que a unidade de isoflurano é encher suficientemente (Figura 1).
3. Abra um Novo estudo ou Nova série em um estudo existente no navegador. Preencha todas as informações necessárias (proprietário, nome do estudo, nome da série, dados obtidos em animais) na janela de Informação de estudar . Clique Okey.
4. Depois de clicar Okey, certifique-se de que aparece a janela de imagem modo-B e a imagem em modo-B começa automaticamente.

3. Mouse manipulação

1. Anesthetization do rato
   1. Posicione o mouse na caixa "knockdown" (Figura 1E), fechar a caixa, abrir o tubo de isoflurano para a caixa "knockdown" e ative o isoflurano (3,5% de concentração).
   2. Quando o mouse é inferior (de 1,5% de concentração), anestesiados e redirecionar o fluxo de isoflurano através da abertura do tubo na direção da plataforma de aquecimento e fechar o fluxo de caixa "knockdown".
      Nota: Para chegar a anestesia suficiente, espere um adicional de 10 s depois já não estiver movendo o mouse.
   3. Transferir o mouse rapidamente da caixa de nocaute para a plataforma de aquecimento (Figura 1F) em posição dorsal e posicione suavemente seu nariz no nariz anestesia tubo localizado na parte superior da plataforma.
2. Fixação, depilação e preparação do mouse para medir
   1. Óculos de proteção Coloque creme em cada olho do rato para prevenir olhos secos.
   2. Coloque uma gota de gel de eletrodo em cada uma das quatro áreas cobre na plataforma aquecida (Figura 1F).
   3. Bata as patas com fita cirúrgica sobre as áreas de gel-revestido eletrodo da plataforma de aquecimento.
   4. Verifique o ECG [valor ideal = 450-550 batimentos/minuto (BPM)] e fisiologia respiratória em todos os momentos.
      Nota: Usando uma sonda rectal, medição de temperatura do corpo é possível, mas não necessário.
   5. Lugar creme depilatório creme no abdômen do mouse, esfregue o creme com um cotonete e esperar cerca de 1 min. Retire o creme com uma compressa embebida em água. Repita este passo se não todos os pelos sumiram.
   6. Aplica o gel de ultra-som pré-aquecido na pele depilada.

4. medições e aquisição de imagens e vídeos

1. Segure o transdutor (Figura 1) com a mão ou apertá-lo no dispositivo de exploração (Figura 1 H; segurando o dispositivo é recomendado).
2. Identificar a bexiga com o transdutor e usá-lo como ponto de referência. Mova o transdutor para os sites de esquerda e direito do abdômen para implantações de rastreamento.
3. B-modo de visualização das estruturas anatômicas na imagem 2D em tons de cinza
   1. Mover o transdutor ou aquecimento tabela plataforma onde o mouse está fixado, até a primeira implantação é visível na tela em seu tamanho maior.
      1. Selecione Imagem rótulo e digite um nome, ou Frame Store (armazenamento sem nome) para armazenar quadros único, ou Loja de Cine para armazenar um cineloop para medições de implantação inteira.
   2. Mova o transdutor ou tabela para trazer a placenta para uma posição onde o fluxo de sangue na UmA é visível. Armazenar um único quadro ou cineloop (consulte a etapa 4.3.1.1) para medições da placenta.
      Nota: As medições da placenta são possíveis de gd10 em diante.
   3. Continue com todos os implantes, usando o mesmo método.
4. Modo doppler cor para visualizar e determinar a direção do fluxo de sangue
   1. Pressione o botão de cor .
   2. Mover a caixa de cor (nesta área, o sinal é visível) para a posição desejada usando o trackball. Se necessário, alterar o tamanho da caixa, pressionando a atualização e mover o trackball (para a direita/para cima = maior; para o esquerdo lado para baixo = menor). Quando a caixa tem o tamanho certo, pressione selecionar.
   3. Loja quadros simples ou cineloops, conforme descrito na etapa 4.3.1.1.
5. Modo doppler de onda de pulso (PW) para quantificar o fluxo de sangue através os vasos (artéria uterina, UA) da artéria uterina e UmA
   1. Localize a região de interesse na aquisição de doppler a cor.
      Nota: A UA está localizado caudal para a bexiga, e a UmA situa-se entre o feto e a placenta.
   2. Imprensa PWe uma linha tracejada aparecerá. Mover esta linha para o vaso sanguíneo de interesse e ajustar o ângulo da linha usando o botão de "Ângulo Doppler" em consonância com o fluxo de sangue. Pressione a atualização.
      Nota: O ângulo entre a direção do fluxo de sangue e o transdutor deve ser consistente em todos os animais, especialmente quando usando ângulos superiores a 60° (aqui, 70° para UAs e 45° para UmAs foram usados).
   3. Armazene um cineloop das linhas doppler aparecendo na janela de aquisição doppler PW.

5. revisão e acabamento de aquisição de dados e salvar uma série

1. Para rever os dados, pressione estudo gestão. Role até a imagem em miniatura de interesse e clique duas vezes em Update.
2. Pressione primeiro Estudo gestão e depois fechar na janela do navegador para concluir a aquisição de dados e salvar uma série gravada.
   Nota: Depois de fechar uma série, não é possível armazenar quadros ou cineloops mais nesta série.

6. Mouse manipulação após a aquisição de dados

1. Retire o gel o animal anestesiado com a ajuda de compressas secas.
2. A fita cirúrgica cuidadosamente retire as patas.
3. Feche o tubo de isoflurano (0% de concentração).
4. Prosseguir com a seguinte análise de ultrassom no gd5, 8, 10 e 12.
   1. Coloque o animal sozinho em uma gaiola para um mínimo de 5 min para que ele tenha tempo para acordar e orientar.
   2. Coloque o mouse volta para a gaiola original.
      Nota: Não desligue o isoflurano antes de remover o gel e fita cirúrgica, como ratos acordem muito rapidamente (cerca de 20 s) depois de desligar o isoflurano.
5. Prosseguir com a seguinte análise de ultrassom em gd14.
   1. Sacrifica a fêmea antes que acorde por deslocamento cervical. Abra o animal, remover o útero, separar os fetos e placentas e medir pesos fetais e placentários.

7. copiar e importar os dados

1. Marque uma ou mais séries, clicando em Exportar para e escolha o espaço de armazenamento para copiar dados para um disco rígido.
2. Abra o software em um computador e clique em Copiar de e selecione a estudo/série do disco rígido para importar uma série/estudo para o software.
3. Analise os dados com o software.

Resultados

Componentes individuais do sistema de ultra-som usado neste manuscrito são mostrados na Figura 1. A Figura 2 mostra o representante ultra-som imagens adquiridas no modo B-gd5, 8, 10 e 12 (B) e medição de área de implantação correspondente resultados (A), demonstrando uma área de implantação de redução significativa de anti-CD122-tratados Cpa3^{Cre / +} ratos de gd10 em diante.<...

Discussão

Usando nosso sistema de ultra-som, demonstrámos restrição de crescimento fetal em mães MC/NK-deficiente de gd10 na. Além disso, no gd10 e 12, observamos dimensões reduzidas da placenta e no gd14 a ausência ou a reversão de fluxo diastólico de final nas UmAs de alguns fetos de ratos uMC/uNK-deficiente. Este sinal de vascularização pobre foi associado com um índice de resistência significativa das artérias indicando IUGR. Resultados confirmam o papel importante das uMCs e uNKs durante a gravidez e o bem-estar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb)	BioLegend	123204	Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System	FujiFilm VisualSonics Inc.		Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software	FujiFilm VisualSonics Inc.
Isoflurane	Baxter	PZN: 6497131
Electrode gel	Parker	12_8
Surgical tape	3M Transpore	1527-1
Eye cream	Bayer	PZN: 1578675
Cotton tipped applicators	Raucotupf	11969	100 pieces
Depilatory cream	Reckitt Benckiser	2077626
Compresses	Nobamed Paul Danz AG	856110	10 x 10 cm
Ultrasound gel	Gello GmbH	246000