Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas

Resumen

Este trabajo describe la clonación de una cepa de caballo de Troya de Ustilago maydis para la entrega in situ de proteínas secretadas de maíz en tres tipos diferentes de tejidos de maíz.

Resumen

Inspirado en el mito de caballo Trojan Homer´s, hemos diseñado el patógeno del maíz Ustilago maydis para proporcionar proteínas secretadas en el apoplasto maíz permitiendo análisis fenotípico en vivo. Este método no se basa en la transformación de maíz pero explota capacidades secretoras de patógenos y genética microbiana. En este documento, permite la inspección de en vivo entrega proteínas secretadas con alta resolución espaciotemporal en diferentes tipos de sitios de infección y los tejidos. La estrategia del caballo de Troya puede ser utilizada para complementar transitorio maíz fenotipos de pérdida de función, para caracterizar funcionalmente dominios de la proteína, para analizar los efectos de la proteína objetivo, o para el estudio de sobredosificación de proteína juego, convirtiéndolo en una poderosa herramienta estudios de la proteína en el sistema de cultivo de maíz. Este trabajo contiene un protocolo preciso sobre cómo generar una cepa de caballo de Troya seguida por protocolos estandarizados infección aplicar este método a tres tipos de tejido diferentes de maíz.

Introducción

El patógeno foliares Ustilago maydis es el agente causativo del maíz smut enfermedad¹. Infecta todas las partes aéreas de maíz resultando en tumores grandes que contienen esporas de melanized, negro. A nivel mundial, se estima en U. maydis causa una pérdida anual de alrededor del 2% de la producción de maíz, mientras que los tumores son apreciados como un manjar gastronómico en México. Infección de la planta se inicia por un apresorio que secreta enzimas lisis celular para penetrar la primera capa de células epidérmicas maíz. De un sitio de infección primaria, U. maydis crece intracelularmente e intracelular, invaden células de uno o dos capas cada día^1,2. Resultado exitoso de la infección en hipertrofia de planta que se transforma en tumores visibles en cinco días post infección^1,3,4. Durante todas las etapas de la infección, los hyphae fungicidas invaginate la membrana de citoplasma de la planta sin contacto directo con el citoplasma host^1,2. El espacio apoplasmic apretado entre la hifa infectante y la membrana de plasma de la planta se considera que el sitio interactivo de host/patógeno, llamado la zona de interacción de foliares. Para superar el sistema inmune innato de planta, U. maydis secretan una matriz de proteínas efectoras en foliares interacción zona¹. Algunos efectores son tomados por células de la planta, mientras que otros permanecen en los foliares interacción zona^5,6,7,8. Efectores apoplásticos uno es UmPit2, que interactúa con las proteasas apoplastic maíz para prevenir la liberación de la señalización del péptido ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplasto proteasa actividad^9,10.

En las últimas décadas, U. maydis se convirtió no sólo un modelo para la genética fúngica en la interacción planta-patógeno, sino también una valiosa herramienta en la biotecnología debido a un ciclo de vida bien comprendido, fácil accesibilidad genética y expresión heteróloga de secretada proteínas^11,12,13. Señales para la secreción de ambas proteínas convencionales y no convencionales se han determinado lo que permite el control de modificaciones del posttranslational¹⁴. Recientemente, U. maydis fue empleado como una herramienta de caballo de Troya para estudiar pequeños, secretan proteínas maíz en situ¹⁵. El enfoque de caballo de Troya fue utilizado con éxito para analizar la función de la proteína secretada, pequeñas ZmMAC1 que participa en el desarrollo de la antera. ZmMAC1 induce la división periclinal de las células pluripotentes y especificación de destino celular de las células recién formado¹⁵. Por el mismo método, la función biológica del péptido asociado daño maíz ZmZIP1 fue revelada. U. maydis secretando el maíz A que zmzip1 dio lugar problemas de formación de tumor¹⁰. Por lo tanto, el caballo de Troya enfoque representa una valiosa alternativa a la proteína los estudios ines situ de alta resolución espaciotemporal que ni requieren generación de líneas de transformación de maíz estable ni infiltración de tejidos con heterologously proteínas expresadas y purificadas. En particular, la estrategia del caballo de Troya permite la secreción de cualquier proteína heteróloga en el apoplasto de maíz y comparación directa de infectados frente a células no infectadas de la planta dentro del mismo tejido.

Este protocolo muestra los pasos principales para la generación de una cepa de caballo de Troya de U. maydis para estudiar una proteína de interés. Además incluye información precisa sobre los procedimientos de la infección de tres tipos de tejido diferentes de maíz (hojas adultas, borlas y orejas) con U. maydis, que es un requisito previo para el estudio de la función de progreso y el proteínas infección espaciotemporal en estos tejidos diana. Otras especificaciones no son dadas en la amplificación del gen maíz y microscópica imagen técnicas, puesto que estos pasos son específicos del destino y dependiente del instrumento. Así, este protocolo está dirigido a usuarios avanzados de técnicas de biología molecular estándar.

Protocolo

1. construcción de un caballo de Troya de U. maydis

Nota: Vea la figura 1.

1. Amplificar un gen de interés a partir de maíz cDNA utilizando cartillas gene-específicas y una revisión ADN polimerasa. Clonar el producto primario de la polimerización en cadena y transforman la construcción de e. coli siguiendo las instrucciones del proveedor de plásmido. Verifique que el gen correcto de la secuencia de interés por Sanger secuenciación antes de los próximos pasos de la clonación.
   Nota: Especificaciones de PCR necesitan ser optimizado debido a la primer secuencia especificidades y condiciones de la reacción de polimerasa de la DNA óptimo.
2. Diseño de cebadores para amplificar el gen maíz de interés sin la secuencia de codificación de un péptido de señal (SP).
3. Extender el extremo 5´ del primer revés con el motivo RSIATA y un NcoI corte sitio (tabla 1).
4. Amplificar el gen maíz de interés con una corrección ADN polimerasa mediante la construcción de la polimerización en cadena generada en 1.1 como la plantilla de la polimerización en cadena.
5. Doble-digerir el producto PCR y el plásmido de transformación de U. maydis , p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- ZmmCherry mac1-Ha¹⁵, con XbaI y Nco I. purificar el producto de PCR y el plásmido digerido.
6. Ligar el producto PCR digerido en la p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- ZmmCherry mac1-Ha plantilla con T4 ADN ligasa siguiendo las instrucciones de manufacturer´s. Transformar el producto de la ligadura en e. coli y verificar el gen correcto de la secuencia de interés por Sanger secuenciación.
7. Alinear la p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- Zmgene de interés mCherry-Ha con la enzima de restricción SspI y transformación ADN en el solopathogenic U. maydis cepa SG200¹⁶. Aislar U. maydis transformantes selección carboxin y confirmar aislados transformantes por sur blot análisis¹⁶.
   Nota: Para cada proteína de interés, por lo menos tres independientes U. maydis transformantes deben ser aislados y analizados para estimar efectos de fenotipo de mutaciones al azar del fondo.

2. medios de cultivo

1. Preparación de medio líquido de YEPSlight¹⁶: Extracto de levadura 1.0% (w/v), 0.4% (w/v) Bacto-peptona y 0.4% (p/v) de sacarosa. Disolver todos los componentes en ddH₂O y autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.
2. Preparar papa-dextrosa-agar (agar PD)²⁰: 3,9% (w/v) papa dextrosa agar y 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). Mezclar todos los componentes directamente en la botella para el autoclave y añadir ddH₂O más una barra de agitación magnética. Autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.
3. Preparación de agar carbón PD²⁰: 3,9% (w/v) papa dextrosa agar, carbón 1% (p/v) y 1.0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). Mezclar todos los componentes directamente en la botella para el autoclave y añadir ddH₂O más una barra de agitación magnética. Autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.

3. planta infección

1. Realizar análisis de maíz la división celular en respuesta a caballo de Troya entregada proteína (por ejemplo, basado en la microscopía celular contando) previamente. U. maydis -indujo proliferación celular maíz y formación de un tumor posterior comienza alrededor de 4-5 días post infección. Evaluación cuantitativa de la enfermedad dependen del tejido y se debe realizar de 6 a 14 días post infección.
   Nota: Distintos cultivares de maíz muestran diferentes niveles de susceptibilidad a la infección por U. maydis . Maíz cvs W23, A188, Pedernal de Gaspe, gallo de oro temprano o Va35 susceptibilidad a este patógeno y así cultivares adecuados para estudios de caballo de Troya.
2. Preparación del inóculo de U. maydis
   1. Incluyen la cepa progenitora SG200 como control negativo en todos los experimentos de caballo de Troya para la estimación de los efectos secundarios a la infección por la cepa transgénica. Aquí, se utiliza una cepa de U. maydis expresando una versión no segregada de la proteína de interés como control negativo. Sin embargo, por razones de factibilidad (p. ej., grandes proyecciones), la cepa progenitora puede ser la opción más fácil de control.
   2. Antes de comenzar el experimento, estimar qué cantidad de la cultura de la infección es necesarios. Tenga en cuenta que la infección de la planta requiere de 1-1.5 mL de la suspensión de U. maydis depende del tipo de maíz tejido.
      Nota: Aproximadamente 1 mL de una cultura de la noche a la mañana es suficiente para la dilución a un OD₆₀₀ de 0.2 en 20 mL de medio de_luz YEPS y 25 mL de un cultivo de U. maydis con un OD₆₀₀ de 0.8-1.0 es suficiente para la infección de plantas de 13-16.
   3. Rasguño U. maydis de un agar de PD la placa con una pipeta Pasteur estéril, inocular en 5 mL de medio YEPS_luz y dejar que la cultura crece a 28 ° C con agitación constante a 200 rpm por 16 h.
   4. Antes de la infección, examinar la cultura de la inoculación de U. maydis por microscopia ligera estándar para el adecuado crecimiento y contaminación bacteriana con 400 aumentos.
      Nota: En una cultura adecuada, sólo el hongo en forma de cigarro es visible (figura 2).
   5. 900 μl de fresco YEPS_luz se mezclan con 100 μl del cultivo durante la noche y medir el OD₆₀₀ con YEPS_luz medio como un espacio en blanco en el análisis de espectrofotómetro.
   6. Diluir la cultura durante la noche con medio fresco de_luz YEPS a un OD₆₀₀ de 0.2 y dejar que la cultura crece a 28 ° C con agitación constante a 200 rpm hasta llegar a la fase de crecimiento de registro media indicada por un OD_{600 nm} de 0.8-1.0.
      Nota: U. maydis células duplican cada 2 h en estas condiciones, así el deseado OD₆₀₀ se alcanza después de 4-5 h de cultivo.
   7. Cosechar las células en OD₆₀₀ de 0.8-1.0 girando a 3.000 x g durante 10 min y descarte el sobrenadante.
   8. Lavar el precipitado de células una vez con el ddH₂O. Para ello, añadir un volumen de cultivo de ddH₂O, vuelta con 3000 x g durante 10 min y descarte el sobrenadante.
   9. Resuspender el precipitado celular cuidadosamente en ddH₂O con una pipeta de vidrio de 20 mL, ajustando así el OD final₆₀₀ 3.0 (para un análisis de caballo de Troya) o 1.0 (para la calificación de la enfermedad).
3. Verificación del caballo de Troya: en planta de la secreción de la proteína de fusión maíz
   1. Infectar las plántulas de maíz con una cepa de caballo de Troya¹⁷.
   2. Realizar la proyección de imagen microscópica de micorrizada en 2-3 días post infección usando un microscopio de escaneo láser confocal. Para ello, suprimir un trozo rectangular de la hoja de 1 cm por debajo del punto de inyección, coloque la muestra en un portaobjetos y añadir una gota de ddH₂O. Para visualizar la proteína de fusión mCherry, excitar la muestra con λ = 561 nm y emisión récord a λ = 580-630 nm.
4. Infección de hojas de maíz adulto
   1. Cultivar plantas de maíz a la etapa de adulto hojas (hoja de cuando menos 7 crece en el tallo).
      Nota: Esta etapa se llega después de cuatro semanas en la siembra bajo condiciones de invernadero de 14 h, 28 ° C día/10 h, ritmo de la noche de 22 ° C con CV W23. Duración puede variar con las condiciones de cultivo y efecto invernadero maíz.
   2. Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.
   3. Presione el tallo cuidadosamente para localizar el tejido meristemático en el tallo. La base de los meristemos se puede distinguir por una transición de tallo más duro al más suave del tejido.
   4. Marque el meristemo en el tallo con un bolígrafo.
   5. Inyectan 1.5 mL de cultivo de U. maydis 1 cm arriba del meristem del lanzamiento o meristemo de la inflorescencia.
   6. Tasa de síntomas de la enfermedad en 6 y 12 días post infección.
5. Infección de borlas
   1. Crecer plantas de maíz hasta llegar a la etapa de la borla.
      Nota: Una detallada cronología sobre el desarrollo de la antera y borla en cultivar maíz W23 fue descrita¹⁸¹⁹. Borlas que contienen las anteras pre-meióticas son altamente susceptibles a la infección por U. maydis ; en el cultivar maíz W23 borlas son del tamaño de 4-7 cm.
   2. Presione el tallo cuidadosamente para localizar la borla en el tallo.
   3. Marca la punta y la base de la borla en el tallo con un bolígrafo.
   4. Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.
   5. Inyecta 1,5 mL del inóculo en la borla. Para garantizar la equitativa distribución del inóculo, lentamente colocar 0,5 mL en la base de la espiga marcada con la pluma, la punta y la parte media.
   6. Tasa de síntomas de la enfermedad a 10 días post infección.
6. Infección de oídos
   Nota: el desarrollo de tejido de la oreja difiere en diferentes cultivares de maíz y en condiciones de invernadero y debe respetarse cuidadosamente antes de la inoculación. Orejas a superar sedas son altamente susceptibles a la infección por U. maydis .
   1. Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.
   2. Inyectar la aguja de inoculación en el espacio entre las hojas de cáscara tan profundamente como sea posible sin dañar el oído.
   3. Versión 1.5 mL del inóculo en el oído.
   4. Retire la jeringa y aguja y masaje con cuidado la cob para distribuir igualmente la solución de U. maydis .
   5. Tasa de síntomas de la enfermedad a 14 días post infección.
7. Confirmar viabilidad del inóculo de U. maydis
   1. Colocar 10 μl del inóculo en una placa de agar carbón de PD e incube a temperatura ambiente durante 2 días.
      Nota: Si la cultura de U. maydis es capaz de filamentos de forma, micelio esponjoso, blanco se convierte en visible (figura 5)

Resultados

Construcciones para los experimentos de caballo de Troya de U. maydis se clonan en el plásmido p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2-gene de interés mCherry-Ha. El maíz gen de interés se fusiona a un reportero de fluorescencia mCherry y un epitopo HA-etiqueta. La expresión de la proteína de fusión es bajo control del promotor U. maydis Umpit2 que específicamente se...

Discusión

Investigación de cultivo moderno exige protocolos de análisis molecular en genética y niveles de la proteína. Accesibilidad genética a través de transformación no es disponible o ineficientes y lentos para más especies de cultivos como el maíz. Por otra parte, herramientas genéticas confiables tales como sistemas de reportero promotor son escasos, lo que hace difícil para el estudio de la función de la proteína in situ de alta resolución espaciotemporal en sitios tisulares distintos. Apoplasto prot...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
cDNA from maize			from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal	Sigma-Aldrich	05105
Confocal laser scanning microscope			use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm			use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification			use locally available equipment
Nco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			please contact the corresponding author
Pasteur pipet (glass, long tip)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar	VWR	90000-745
Sharpie pen			use locally available equipment
Spectrophotometer			use locally available equipment
Ssp I	NEB	R0132
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
T4 DNA ligase	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Xba I	NEB	R0145
Yeast extract	BD	212750