Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

Resumen

Se ha desarrollado una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa de pan-lyssavirus para detectar específicamente todos los lyssavirus conocidos. La validación utilizando muestras cerebrales de rabia de diferentes especies animales demostró que este método tiene una sensibilidad y especificidad equivalente a la prueba de anticuerpos fluorescentes estándar de oro y podría ser utilizado para el diagnóstico de la rabia de rutina.

Resumen

Para detectar el virus de la rabia y otras especies miembro del género lyssavirus dentro de la familia rhabdoviridae, se desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada de pan-lyssavirus (RT-PCR anidada) para detectar la región conservada del gen de la nucleoproteína (N) de los lissavirus. El método aplica la transcripción inversa (RT) utilizando ARN viral como plantilla y oligo (DT)₁₅ y hexámeros tal aleatorios como imprimadores para sintetizar el ADN complementario viral (cDNA). Luego, el cDNA viral se utiliza como una plantilla para amplificar un fragmento de gen 845 BP N en PCR de primera ronda usando imprimadores externos, seguidos por PCR anidada de segunda ronda para amplificar el fragmento final de 371 BP usando imprimadores internos. Este método puede detectar diferentes clados genéticas de virus de la rabia (RABV). La validación, utilizando 9.624 especímenes de cerebro de ocho especies de animales domésticos en 10 años de diagnósticos clínicos de rabia y vigilancia en China, demostró que el método tiene 100% de sensibilidad y 99,97% de especificidad en comparación con la fluorescente directa prueba de anticuerpos (FAT), el método estándar de oro recomendado por la Organización Mundial de la salud (OMS) y la Organización Mundial de sanidad animal (OIE). Además, el método también podría amplificar específicamente el fragmento genético N objetivo de otras 15 especies aprobadas y dos novelas de lyssavirus en el 10º informe del Comité Internacional sobre taxonomía de virus (ICTV), evaluado por una detección mímica de N plásmidos génicos de todos los lyssaviruses. El método proporciona una alternativa conveniente a FAT para el diagnóstico de la rabia y ha sido aprobado como una norma nacional (GB/T36789-2018) de China.

Introducción

La rabia es una enfermedad zoonótica mundial causada por virus en el género lyssavirus¹. Los lyssavirus (familia rhabdoviridae) son virus de ARN de cadena única negativa con un genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) y la proteína grande o polimerasa (L). Basándose en secuencias de nucleótidos del gen N, la distancia genética y los patrones antigénicos, los lissavirus se han dividido en 16 especies, que comprenden el virus de la rabia clásica (RABV) y los virus relacionados con la rabia (RRV): virus del murciélago de lagos (LBV), virus de Duvenhage (DUVV ), Virus Mokola (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), lyssavirus murciélago australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), lyssavirus de murciélago Bokeloh (BBLV), lyssavirus Gannoruwa bat (GBLV), virus Irkut (IRKV), Khujand virus (KHUV), el virus del murciélago del Cáucaso occidental (WCBV), el virus del murciélago Shimoni (SHIBV), y el lyssavirus del murciélago de Lleida (LLEBV)². Recientemente, se han identificado dos lyssavirus adicionales: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) aislado de un murciélago de Brandt (Myotis Brandtii) en finlandia en 2017³ y lyssavirus murciélago Taiwán (twblv) aislado de un Pipistrelle japonés ( Pipistrellus abramus) en Taiwán, China en 2016 – 2017⁴.

Todos los mamíferos son susceptibles a la rabia; sin embargo, ninguna lesión patognomónica bruta o signos clínicos específicos permiten su identificación, y el diagnóstico sólo se puede hacer en el laboratorio⁵. El método más ampliamente utilizado para el diagnóstico de la rabia es la grasa, que se considera como el estándar de oro por la OMS y la OIE^5,6. Sin embargo, la FAT puede producir resultados poco fiables en muestras de tejido cerebral degradadas/autolizadas. Además, no se puede utilizar para el ensayo de muestras de fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva y la orina, lo que excluye en gran medida su empleo en el diagnóstico de antemortem⁷. Las pruebas diagnósticas convencionales alternativas, tales como la prueba de infección del cultivo del tejido de la rabia (RTCIT) y la prueba de inoculación del ratón (MIT), requieren varios días⁶, un inconveniente importante cuando un diagnóstico rápido es esencial.

Varias pruebas de diagnóstico molecular (p. ej., la detección de ARN viral por RT-PCR, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas PCR [PCR-ELISA], hibridación in situ y PCR en tiempo real) se utilizan como técnicas rápidas y sensibles para el diagnóstico de rabia⁸. La OIE recomienda ahora la RT-PCR para el diagnóstico rutinario de la rabia, y se describe una PCR heminested (HN) en el manual de pruebas diagnósticas y vacunas para animales terrestres de la OIE para detectar todos los lyssavirus⁵. Aquí describimos un pan-lyssavirus anidado RT-PCR, que permite la detección específica y sensible de las 18 especies de lyssavirus comparables o superiores a las obtenidas por la grasa. El principio del método es un RT del ARN Diana (región conservada del gen del lyssavirus N) en la cDNA, seguida de la amplificación de la cDNA por dos rondas de PCR. El cDNA sufre el PCR de primera ronda con imprimadores externos para amplificar un fragmento de 845 BP; a continuación, el PCR de segunda ronda utiliza el producto PCR de primera ronda como plantilla para amplificar un fragmento de 371 BP con imprimaciones internas. Las dos rondas de PCR aumentan significativamente la sensibilidad del ensayo.

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Protocolo

El uso de ratones en este protocolo fue aprobado por el Comité Administrativo de bienestar animal del Instituto de medicina veterinaria militar, la Academia de ciencias médicas militares, China (autorización del Comité de cuidado de animales de laboratorio y uso, permitir número JSY-DW-2010-02). Se siguieron todas las directrices institucionales y nacionales para el cuidado y el uso de animales de laboratorio.

1. extracción de ARN

1. Extracto de ARN de la rabia-sospecha de tejido cerebral, biopsias de piel, saliva, o CSF o de cultivo celular infectado por RABV, utilizando métodos de extracción basados en isotiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio o kits de extracción de ARN viral disponibles comercialmente. Utilice el ARN preparado inmediatamente o guárdelo a-80 ° c hasta que sea necesario.

2. transcripción inversa del ARN viral

1. Retire los reactivos RT enumerados en la tabla 1 del congelador, manténtelos en hielo y descongele y vórtice antes de usarlos.
2. Prepare 12 μL de mezcla de reacción RT en un tubo PCR de 0,2 mL con los reactivos enumerados en la tabla 1. Permita variaciones de pipeteo preparando un volumen de mezcla maestra al menos un tamaño de reacción mayor que el requerido.
3. Añada 8 μL de muestra, ARN de control positivo o control negativo a la mezcla de reacción RT dentro de una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas. El control positivo RT es el ARN extraído del cultivo celular infectado con la cepa fija RABV CVS-11 (Challenge virus Standard-11) y almacenada a-80 ° c. El control negativo contiene RNase-Free ddH₂O.
4. Mezclar el contenido de los tubos RT por vortexing; Luego, centrifugar brevemente.
5. Cargue los tubos de reacción en un termociclador. Configurar el programa de síntesis de cDNA con las siguientes condiciones: 42 ° c para 90 min, 95 ° c para 5 min, y 4 ° c en espera. Ajuste el volumen de reacción a 20 μL. Inicie la ejecución de RT.

3. PCR de primera ronda

1. Mantener los reactivos de PCR enumerados en la tabla 2 sobre hielo en una sala limpia hasta su uso; entonces, descongelarlos y vórtilos.
2. Prepare la mezcla de PCR de primera ronda en un tubo de PCR de 0,2 mL con los reactivos enumerados en la tabla 2.
3. Añadir una muestra de 2 μL de cDNA o plásmido en la mezcla de PCR de primera ronda dentro de una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas. El control positivo de PCR es CVS-11 cDNA preparado como se menciona en el paso 2,3 para el método RT anterior. El control negativo PCR es ddH₂O.
4. Transfiera los tubos sellados a un termociclador de PCR y ciclo utilizando los parámetros enumerados en la tabla 3.

4. PCR de segunda ronda

1. Prepare la mezcla de PCR de segunda ronda en un tubo de PCR de 0,2 mL utilizando los reactivos enumerados en la tabla 4.
2. Añadir 2 μL de producto de PCR de primera ronda a la mezcla de PCR de segunda ronda. Además, incluya ddH₂O como un control negativo del PCR de segunda ronda.
3. Realice el ciclo térmico de PCR usando los mismos parámetros que los dados en el paso 3,4.

5. Análisis de los productos de PCR por electroforesis en geles de agarosa

1. Prepare un gel de agarosa al 1,5% añadiendo 1,5 g de agarosa a 100 mL de tris-acetato-EDTA (TAE) y disolviéndola a fondo calentándolo en un horno de microondas.
2. Añadir bromuro de etidio (EB) (a una concentración final de 0,01%) u otra sustitución comercial de EB. Vierta el gel en el molde y deje que se solidifique a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
3. Prepare las muestras de carga mezclando 5 μL de cada producto PCR con 1 μL de búfer de carga 6X.
4. Cargue las muestras y el marcador de ADN adecuado por separado en los pozos y ejecute el gel durante aproximadamente 30-45 min a 120 V hasta que la línea de tinte sea aproximadamente del 75%-80% por el gel.
5. Apague la alimentación, desconecte los electrodos de la fuente de alimentación, y luego, retire con cuidado el gel de la caja de gel.
6. Utilice un dispositivo de documentación de gel UV para visualizar y fotografiar los fragmentos de ADN.

6. Caracterización de RT-PCR anidada

1. 6,1. especificidad y sensibilidad para la detección de 18 plásmidos de lissavirus
   1. Ordene 18 plásmidos comerciales que contengan el gen N completo de cada lyssavirus (16 especies de ICTV y dos especies novedosas) para el PCR.
   2. Calcule el número de copia del plásmido utilizando el número de Avogadro (N_A) y la siguiente fórmula.
      [(g/μl de ADN plásmido)/(longitud plásmido en BP x 660)] x 6,022 x 10²³ = número de moléculas/μl
   3. Prepare soluciones de stock (2,24 x 10⁹ moléculas/μL) de los 18 plásmidos en DDH₂O.
   4. Realizar diluciones seriales de 9 10 veces de los 18 plásmidos en ddH₂o. diluir 10 μl de cada material plásmido con 90 ΜL de DDH₂o. Vortex y centrifugar brevemente.
   5. Realice la amplificación de PCR como se describe en las secciones 3-5.
   6. Analice la especificidad y la sensibilidad del PCR anidado detectando una serie de plásmidos de lyssavirus.
2. Determinación de la d etection l imit
   1. Ajustar el título de la cepa del virus de la rabia de la cultura de células CVS-11 a 10^5,5 tcid₅₀/ml (título del virus determinado de acuerdo con el manual de la OIE)⁵.
   2. Realizar diluciones en serie 5 10-Fold de CVS-11 (solución de stock es 10^5,5 tcid₅₀/ml) como se describe en el paso 6.1.4.
   3. Realizar la extracción de ARN y los procedimientos anidados de amplificación RT-PCR de todas las diluciones virales como se describe en las secciones 1-5.
3. Compar Ison con antelación de la RT-PCR anidada con la grasa "Gold Standard"
   1. Pruebe todas las muestras clínicas mediante RT-PCR anidada y, a continuación, confirme los resultados con la secuenciación de genes FAT⁵ y N⁹.
   2. Utilice datos normalizados para un análisis estadístico con SAS 9,1. Utilice la prueba Kappa y la prueba chi-cuadrada de McNemar para una comparación estadística de las pruebas de diagnóstico (mandato SAS: proc FREQ; tabla/acuerdo). Calcule los intervalos de confianza asumiendo la distribución abinomial.
4. Evaluación de la eficacia en la prueba de muestras degradadas
   1. Exponga dos muestras de tejido cerebral clínico confirmado de perros rabiosos a 37 ° c.
   2. Ensayo de las dos muestras en cada día de exposición a 37 ° c por RT-PCR anidada, el FAT, y el MIT⁵.

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Resultados

Los resultados de la RT-PCR anidada para detectar 18 especies de lyssavirus se muestran en la figura 1. Todos los controles positivos de PCR mostraron el 845 BP esperado en la primera-y 371 BP en las amplificaciones de la segunda ronda sin banda en el control negativo. Los 18 lyssavirus produjeron las bandas 845 y/o 371 BP esperadas, indicando que el RT-PCR anidado detectó los 18 lyssavirus. Dieciséis plásmidos de los lissavirus tuvieron una amplificación eficiente en ambas rondas de PCR...

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Discusión

Actualmente, RABV es un lissavirus importante responsable de casi toda la rabia humana y animal en China, así como en otros países. Además, una variante de IRKV fue identificada por primera vez a partir de un murciélago Murina leucogaster en la provincia de Jilin en el noreste de China en 2012¹⁰, y se ha reportado que causó la muerte de un perro en la provincia de Liaoning en 2017¹¹. Más recientemente, un nuevo lyssavirus, TWBLV, también fue identif...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 × TAE	Various	Various
6 × loading buffer	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Various	Various
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
Electrophoresis System	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
Gel Imaging System	UVITEC	Fire Reader
Microcentifuge tubes	Various	Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR Tubes	Various	Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
RNase-free ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A
Tips	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various