Un modelo de cultivo de tejido ex vivo de remodelación del cartílago en explantes de rodilla bovinas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe el aislamiento y el cultivo de explantes de cartílago de rodillas bovinas. Este método proporciona una herramienta fácil y accesible para describir los cambios de tejido en respuesta a estímulos biológicos o nuevas terapias dirigidas a la articulación.

Resumen

Los sistemas de cultivo ex vivo cubren una amplia gama de experimentos dedicados al estudio de la función tisular y celular en un entorno nativo. El cartílago es un tejido único importante para el correcto funcionamiento de la articulación sinovial y está constituido por una matriz extracelular densa (ECM), rica en proteoglicano y colágeno tipo II. Los condrocitos son el único tipo de célula presente dentro del cartílago y son generalizados y relativamente bajos en número. Los estímulos externos alterados y la señalización celular pueden conducir a cambios en la composición y el deterioro de la ECM, que son importantes señas de identidad patológicas en enfermedades como la osteoartritis (OA) y la artritis reumatoide.

Los modelos de cartílago ex vivo permiten 1) perfilar alteraciones mediadas por condrocitos de rotación de tejido de cartílago, 2) visualizar la composición del cartílago ECM y 3) reorganizar condrocitos directamente en el tejido. La elaboración de perfiles de estas alteraciones en respuesta a estímulos o tratamientos son de gran importancia en diversos aspectos de la biología del cartílago, y complementan los experimentos in vitro en condrocitos aislados, o modelos más complejos en animales vivos donde las condiciones experimentales son más difíciles de controlar.

Los explantes de cartílago presentan un método traslacional y de fácil acceso para evaluar la remodelación de tejidos en el ECM del cartílago en entornos controlables. Aquí, describimos un protocolo para aislar y cultivar explantes vivos de cartílago bovino. El método utiliza tejido de la rodilla bovina, que es fácilmente accesible desde la carnicería local. Tanto los explantas como el medio de cultivo condicionado se pueden analizar para investigar la rotación de tejidos, la composición de ECM y la función de condrocitos, lo que genera perfiles de modulación de ECM.

Introducción

Los condrocitos producen y mantienen la matriz del cartílago. Con el fin de estudiar la biología de los condrocitos y cómo ellos y el ECM circundante reaccionan a los estímulos externos, es crucial interrogarlos en su entorno nativo^1,2. El estudio de la rotación del tejido del cartílago es importante para aumentar la comprensión de los mecanismos subyacentes en enfermedades articulares como la OA, una enfermedad para la que actualmente no existe un tratamiento modificador de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de mejores modelos de traducción².

La caracterización ex vivo de los efectos celulares y tisulares es esencial para complementar otros modelos preclínicos, tanto in vitro, como cultivos monocapa de condrocitos, como in vivo, como modelos de OA inducidos por cirugía o el modelo de artritis autoinmune inducida por colágeno (CIA ). Numerosos estudios han destacado las diferencias entre cómo se comportan las células en cultivos monocapa 2D y estructuras 3D o en su tejido nativo^3,4. Muchas células en capas 2D adoptan morfologías no naturales, incluyendo diferencias en la polaridad celular y la unión tisular, lo que resulta en diferencias visuales y funcionales en las células dentro de los tejidos nativos⁵. Las diferencias también son evidentes en la funcionalidad de las células, que pueden desplazar la expresión de proteínas, lo que conduce a patrones de diferenciación profundamente alterados, maquinaria reguladora y funcionalidad celular^{5,6,7 ,8}.

El eCM del cartílago consiste principalmente en colágeno tipo II que proporciona un marco de matriz, y agrecan, un proteoglicano que ayuda a retener el líquido dentro del tejido. Otras moléculas de matriz como colágeno tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteína oligomérica del cartílago (COMP), biglycan, decorin, y perlecan también están presentes⁹.

Mientras que la etiología de OA sigue sin estar clara^10,11, la aparición de la enfermedad se cree que es causada por desequilibrios en los procesos de rotación y reparación de tejidos^12,13. La degradación del cartílago articular es un sello distintivo de la OA. Los condrocitos o células residentes en el cartílago en los tejidos circundantes aumentan su liberación de citoquinas, estimulando la producción elevada de proteinasas como las metaloproteinasas matriciales (MMP) y las agresorasas, que aumentan la degradación del cartílago ECM ¹⁴. Esta degradación da lugar a la liberación de pequeños fragmentos de proteína únicos llamados neoepítos, que se pueden cuantificar en suero, orina o medio de cultivo^15. Tras la formación y maduración del colágeno, también se liberan los llamados profragmentos; estos pueden cuantificarse como medida de la producción de matriz¹⁶.

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo de cartílago ex vivo para comparar el efecto de la estimulación y/o el tratamiento farmacológico en la rotación de tejido SCM. La rotación del cartílago se perfila midiendo biomarcadores de neoepitopos derivados de la matriz directamente en el medio de cultivo condicionado utilizando ELISA: AGNx1 (que refleja la actividad de la agresorasa), C2M (que refleja la actividad de MMP de matriz) y ProC2 (reflejando colágeno tipo II formación). Los hallazgos pueden ser verificados por la tinción histológica del ECM, que también visualiza la organización de los condrocitos en los explantes individuales. El protocolo descrito se puede utilizar para probar el efecto de nuevos tratamientos sobre la función de condrocitos y la rotación de ECM de cartílago. Varios estudios han utilizado explantes de cartílago para describir procesos biológicos o el efecto de la intervención en explantes con problemas de citoquinas utilizando enfoques histológicos o inmunohistoquímicos cuantitativos, ARNm, expresión de proteínas o proteómica^{2 ,17,18}. Sin embargo, estos protocolos están fuera del alcance del manuscrito actual.

Protocolo

1. Aislamiento de tejidos

1. Abastecimiento de tejidos
   1. Realice toda la sección de abastecimiento de tejido fuera de una campana de flujo laminar en un entorno aséptico.
   2. Del matadero local, obtenga una articulación entera de rodilla tibiofemoral bovina fresca de terneros entre 1,5 y 2 años de edad.
   3. Disecciona suavemente la rodilla de la pantorrilla eliminando primero el exceso de carne, descubriendo los cóndilos, el menisco, los tendones y la membrana sinovial. Cortar los tendones y la membrana sinovial, permitiendo que la articulación se desmemse. Retire el menisco para exponer los cóndilos femorales.
   4. Aísle los explantes de la zona de carga del cóndilo femoral utilizando un punzante de biopsia de 3 mm y suéltelos de la superficie articular cortando con un bisturí paralelo y lo más cerca posible del hueso subcondral. La estructura dura del hueso subcondral debe asegurarse de que los explantes no contengan matriz calcificada. Esfuérzate por explantes con altura uniforme.
   5. Almacene y mezcle inmediatamente los explantes en DMEM/F12- GlutaMAX + 1% P/S médium de cultivo en un tubo de 50 ml o plato Petri. No mezcle explantes de diferentes rodillas de vaca, sino que se mantenga separado para cada estudio.
2. Cultivo de tejido
   1. Transfiera los explantes a una placa estéril de 96 pocillos en una campana de flujo laminar.
   2. Lavar los explantes 3 veces en medio de cultivo o PBS y cultivarlos en 200 éL de medio de cultivo por pozo hasta el inicio del experimento. Use un período de lavado de 1 día para sincronizar la actividad celular de la biopsia y la liberación pasiva del biomarcador.
   3. Cultivo de los explantes hasta 10 semanas en una incubadora de 37oC con 5% de_CO2. Coloque todas las réplicas dentro de cada grupo diagonalmente en la placa de cultivo para minimizar la variación inducida por la evaporación. Para evitar aún más la evaporación del sobrenadante, agregue PBS a los pocillos exteriores de la placa de cultivo.

2. Tratamiento explantado de cartílago bovino y evaluación de la actividad metabólica

1. Cambio medio de cultivo y tratamiento
   1. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días en una campana de flujo laminar.
   2. Si aplica algún tratamiento, prepárelos antes de cambiar el medio. Preparar los tratamientos a la concentración deseada en los pozos explantar por dilución en el medio de cultivo.
   3. Retire suavemente el sobrenadante de cada pocal y transfieralo a una nueva placa de 96 pocillos. Almacene el sobrenadante con cinta de sellado a 20 oC para el análisis de biomarcadores de la rotación de tejidos y la expresión de proteínas.
   4. Añadir inmediatamente 200 ml de medio de cultivo fresco o tratamiento por pocto. No deje que los explantes se sequen durante el cambio medio y asegúrese de que todos los explantes estén completamente sumergidos en el nuevo medio.
2. Tinción de Resazurina
   1. Mida la actividad metabólica una vez por semana como una medición indirecta de la viabilidad celular. La prueba de resazurina es una manera fácil de evaluar si la actividad metabólica de los explantes se deteriora para una explanta individual debido a la muerte celular o cambios celulares. Los explantas en el medio de cultivo solo tienen una lectura de resazurin relativamente estable durante todo el período del experimento.
   2. Hacer una solución de medio de cultivo con 10% de resazurina.
   3. Cosecha el sobrenadante como se describe en el paso 2.1.3.
   4. Sumerja los explantes en una solución de resazurina del 10% durante 3 h a 37 oC o hasta que los sobrenadores se vuelvan púrpuras. Incluya 4 pozos sin explantes como controles de fondo.
   5. Transfiera la solución de resazurina condicionada y de control de fondo a una placa microtíter negra y mida la fluorescencia a una emisión de 540 nm/590 nm.
   6. Lavar bien 3 veces en medio de cultivo o PBS y sumergir los explantes en medio de lavado durante 5-10 min para permitir que la resazurina se difunda por completo. Añadir nuevo medio de cultivo o tratamientos si se utiliza.

3. Terminación, fijación y almacenamiento de muestras

1. Terminación del período de cultivo
   1. Mida la actividad metabólica como se describe en el paso 2.2. Añadir 200 sL de PBS por pozo.
2. Fijación y almacenamiento
   1. Retire el PBS, agregue 200 s de formaldehído por pozo y déjelo durante 2 horas a temperatura ambiente.
   2. Deseche el formaldehído y agregue 200 sde PBS por pozo. Cubra la placa con cinta de sellado y guárdela a 4 oC para el análisis histoquímico. Recomendamos realizar análisis histoquímicos en un plazo de 3 meses.

4. Biomarcadores de rotación de tejidos (ELISA)

1. ELISA competitivos indirectos
   1. Recubrir una placa de estreptavidina con el ensayo biotinilado específico objetivo-péptido diluido 1:100 en tampón de ensayo (100 l por pocto) durante 30 min a 20 oC.
   2. Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar y añadir una muestra de sobrenadante (20 l por pozo) junto con anticuerpo monoclonal primario contra el péptido objetivo de ensayo diluido 1:93.3 para ProC2 y 1:100 en tampón de ensayo para AGNx1 (100 l por pozo) e incubar durante 2 h a 20 oC a 20 oC con temblor para ProC2 y 3 h a 20oC para AGNx1.
      NOTA: El volumen de la muestra se toma directamente de las placas sobrenadantes almacenadas. Si la concentración medida está fuera del rango de medición del ensayo, diluya el sobrenadante en una placa de dilución con fondo en V en PBS o tampón de ensayo.
   3. Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar e incubar con anticuerposecundario etiquetado por peroxidasa diluido 1:100 en tampón de ensayo (100 ml por poca) durante 1 h a 20 oC.
   4. Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar e incubar con agitación durante 15 minutos en la oscuridad a 20 oC con tetrametilbenzidina (TMB) como sustrato de peroxidasa (100 ml por pozo).
   5. Finalice la reacción con una solución de parada estándar, 0,1 M H₂SO₄ (100 ml por poca).
   6. Lea la reacción colorimétrica a 450 nm de absorbancia utilizando una absorbancia de referencia a 650 nm en un lector de placas de laboratorio estándar.
2. ELISA competitivas directas para la medición de la rotación del tejido del cartílago en el sobrenadante
   NOTA: Esto cuantifica C2M.
   1. Recubrir una placa de estreptavidina con un ensayo biotinilado específico objetivo-péptido diluido 1:100 en tampón de ensayo (100 l por pocto) durante 30 min a 20 oC.
   2. Lávese 5 veces con tampón de lavado y agregue el sobrenadante de muestra junto con 100 l de anticuerpo monoclonal etiquetado con peroxidasa contra el péptido objetivo del ensayo diluido 1:100 en el tampón de ensayo (20 ml por pozo). Incubar durante 20 h a 2-8oC con agitación.
      NOTA: El volumen de la muestra se toma directamente de las placas sobrenadantes almacenadas. Si la concentración medida está fuera del rango de medición del ensayo, diluya el sobrenadante en una placa de dilución con fondo en V en PBS o tampón de ensayo.
   3. Lavar 5 veces con tampón de lavado estándar e incubar con agitación durante 15 minutos en la oscuridad a 20 oC con TMB como sustrato de peroxidasa (100 ol por pozo).
   4. Finalice la reacción con una solución de parada estándar, 0,1 M H₂SO₄ (100 ml por poca).
   5. Lea la reacción colorimétrica a 450 nm de absorbancia con una absorbancia de referencia a 650 nm en un lector de placas de laboratorio estándar.
3. AGNx1
   1. Cuantifique la degradación del aggrecan midiendo la liberación del neoepitopo AGNx1. Este ensayo ELISA competitivo indirecto se dirige al péptido C-terminal (NITEGE³⁷³⁾generado por ADAMTS-4 y 5 cleavage. El anticuerpo monoclonal reconoce todos los fragmentos con un epítopo NITEGE expuesto. Los detalles experimentales del ensayo se han publicado en otros^19.
4. ProC2
   1. Cuantificar la formación de colágeno tipo II midiendo la liberación del profragmentación del colágeno tipo II. Este ensayo ELISA competitivo indirecto se dirige al epítopo del propéptido PIIBNP (QDVRQPG) generado por N-propeptidasas durante el recorte del colágeno tipo II recién sintetizado. Los detalles experimentales del ensayo se han publicado en otros^16.
5. C2M
   1. Cuantifique la degradación del colágeno tipo II midiendo la liberación del fragmento de neoepitopo C2M. Este ELISA competitivo directo reconoce el péptido C-terminal rolado MMP (KPPGRDGAAG¹⁰⁵³). Este ensayo difiere de AGNx1 y ProC2, ya que es el anticuerpo primario que está etiquetado con peroxidasa y, por lo tanto, se utiliza como detector. Los detalles experimentales del ensayo se han publicado en otros^20.

5. Análisis histológico

1. Infiltración, incrustación y corte
   1. Coloque los explantes fijados (véase el paso 3.2) en casetes etiquetados individualmente. Incluya tanto una etiqueta dentro del cassette como casetes de etiquetas para garantizar la identificación.
   2. Transfiera los cassettes que contienen explantes a una máquina procesadora de tejidos. Luego infíltrate en los explantes con parafina en una serie de pasos de deshidratación e infiltración de parafina.
      1. Deshidratar con 96% de etanol durante 90 min sin ajuste de temperatura. Repita este paso 3 veces.
      2. Limpie el etanol con tolueno durante 90 min sin ajuste de temperatura. Repita este paso 2 veces.
      3. Limpiar el etanol con tolueno durante 90 min a 60oC.
      4. Infiltrar con cera de parafina durante 30 min a 60oC.
      5. Infiltrar con cera de parafina durante 60 min a 60oC.
      6. Infiltrar con cera de parafina durante 90 min a 60oC.
      7. Para cada paso, añada las soluciones a la cámara de muestra con flujos de bombeo y bombeo lentos de menos de 33-34 kPa. Ejecute el proceso de infiltración en un ciclo de presión/vacío con un vacío máximo de 65 a 70 kPa.
   3. Después de la infiltración, coloque los cassettes en un bloque de calentamiento para permitir la eliminación cuidadosa de los explantes del cassette. Incruste suavemente los explantes infiltrados en bloques de parafina individuales. Con fórceps calentados, coloque los explantes con el cartílago articular superficial y los lados del hueso subcondral perpendiculares a la superficie de corte, asegurando la visualización de las diferentes capas de cartílago dentro de cada sección de la muestra.
   4. Corta 5 m de bloques de parafina enfriados con explantes incrustados en un microtome. Transfiera las secciones de corte a un baño de agua fría. Si es necesario, las secciones se pueden separar con un bisturí o un vaso de cubierta.
   5. Con un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento con cuidado, transfiera las secciones a un baño de agua tibia (50 oC), donde se despliegan las secciones. Levante cada sección sobre una diapositiva de cubierta etiquetada y colóquela en una placa caliente durante 30 minutos.
   6. Colocar los portaobjetos en una cesta e incubar a 60oC durante 1 h y luego mantenerlos durante la noche a 37oC. A partir de ahora, guarde los portaobjetos en recipientes cerrados a 4oC hasta la tinción.
2. Safranin O/Fast Green tinción y visualización
   1. Colocar los portaobjetos para ser manchados en una cesta e incubar los portaobjetos a 60oC durante 1 h.
   2. Preparar y filtrar todos los reactivos con un filtro de 0,45 mm.
   3. En preparación para la tinción, vierta los reactivos filtrados en vasos de precipitados a un volumen que permita que las soluciones cubran completamente las diapositivas al sumergir la cesta. Los vasos utilizados requerían un volumen de 250 ml para cubrir las diapositivas.
   4. Deparaffinizar los portaobjetos fundidos sumergiendo la cesta en tolueno durante 10 minutos dos veces, 99% etanol para 2 min dos veces, 96% etanol para 2 min dos veces, y 70% etanol para 2 min dos veces. Luego, hidrata los portaobjetos en agua durante 2 min.
   5. Mancha los portaobjetos desparafinados e hidratados sumergiendo la cesta en la solución de hematoxilina de hierro de Weigert (pH 1.5) durante 10 minutos, sumérgete en 1% de HCl una vez y enjuaga con agua corriente del grifo durante aproximadamente 5 minutos o hasta que el exceso de color se haya lavado.
   6. A continuación, la mancha en 0.05% Solución Fast Green (pH: 5.75) durante 5 min, sumergir en 1% CH₃COOH una vez, y la mancha en 0.1% Safranin O (pH: 6.5) para 20 min.
   7. Deshidratar y limpiar los portaobjetos sumergiendo dos veces en 70% etanol, 96% etanol para 2 min dos veces, 99% etanol para 2 min dos veces, y tolueno 2 min dos veces.
   8. Monte los portaobjetos de vidrio sin recubrimiento con un medio resinoso que cubra los portaobjetos de histología.

Resultados

Los explantes bovinos a profundidad fueron aislados, cultivados y tratados durante 3 semanas(Figura 1). El medio de cultivo se cambió con la adición de tratamiento 3 veces por semana. Una vez por semana, la actividad metabólica se midió mediante el ensayo de resazurina. Los biomarcadores de la rotación de ECM se midieron en el sobrenadante cosechado de la placa de cultivo 3 veces por semana. Los explantas se dividieron en 4 grupos para el tratamiento: 1) Oncostatin M y TNF (O+T); 2) O+T...

Discusión

El protocolo presentado aquí para la elaboración de perfiles de rotación de tejido de cartílago en explantas de cartílago bovino se puede utilizar para caracterizar los efectos del tratamiento de muchos tipos de fármacos, incluidos los inhibidores de las vías intracelulares inflamatorias, los inhibidores de enzimas proteolíticas, o factores de crecimiento anabólicos.

En este protocolo se describieron dos configuraciones diferentes: una configuración anabólica en la que se estimularo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955