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  • Divulgaciones
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe un sistema in vitro de fermentación de cultivo por lotes de microbiota fecal humana, utilizando inulina (un prebiótico bien conocido y uno de los moduladores de microbiota más ampliamente estudiados) para demostrar el uso de este sistema en la estimación de efectos específicos de sobre la composición de la microbiota fecal y las actividades metabólicas.

Resumen

El papel emergente del microbioma intestinal en varias enfermedades humanas exige un avance de nuevas herramientas, técnicas y tecnologías. Estas mejoras son necesarias para descifrar la utilización de moduladores de microbioma para beneficios para la salud humana. Sin embargo, el cribado a gran escala y la optimización de moduladores para validar la modulación del microbioma y predecir los beneficios relacionados con la salud pueden ser prácticamente difíciles debido a la necesidad de un gran número de animales y/o sujetos humanos. Con este fin, los modelos in vitro o ex vivo pueden facilitar el cribado preliminar de moduladores de microbioma. Aquí, se optimiza y se demuestra un sistema de cultivo de microbiota fecal ex vivo que se puede utilizar para examinar los efectos de diversas intervenciones de moduladores de microbioma intestinal incluyendo probióticos, prebióticos y otros ingredientes alimentarios, aparte de nutracéuticos y fármacos, sobre la diversidad y composición de la microbiota intestinal humana. La inulina, uno de los compuestos prebióticos y moduladores de microbioma más ampliamente estudiados, se utiliza como ejemplo aquí para examinar su efecto sobre la composición saludable de la microbiota fecal y sus actividades metabólicas, como el pH fecal y los niveles fecales de ácidos orgánicos incluyendo lactato y ácidos grasos de cadena corta (SCFA). El protocolo puede ser útil para estudios destinados a estimar los efectos de diferentes intervenciones de moduladores en los perfiles de microbiota fecal y a predecir sus impactos en la salud.

Introducción

La microbiota humana es una comunidad compleja que consiste en bacterias, arqueas, virus y microbios eucariotas1,que habitan el cuerpo humano interna y externamente. Las pruebas recientes han establecido el papel fundamental de la microbiota intestinal y el microbioma intestinal (toda la colección de microbios y sus genes que se encuentran en el tracto gastrointestinal humano) en diversas enfermedades humanas, incluyendo obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares, y el cáncer1,2,3. Además, los microorganismos que viven en nuestro intestino producen un amplio espectro de metabolitos que afectan significativamente a nuestra salud y también pueden contribuir a la fisiopatología de varias enfermedades, así como una variedad de funciones metabólicas4, 5. Los cambios anormales (perturbaciones) en la composición y función de esta población microbiana intestinal se denominan generalmente "disbiosis intestinal". La disbiosis generalmente se asocia con un estado incorrecto del huésped y, por lo tanto, se puede diferenciar de la comunidad microbiana normal (homeostática) asociada con un estado de control saludable del huésped. Patrones específicos de disbiosis del microbioma intestinal se encuentran a menudo en varias enfermedades diferentes1,2,3,6,7.

La fermentación de alimentos no digeridos, en particular los carbohidratos/fibras fermentables, por la microbiota intestinal no sólo produce energía, sino que también produce metabolitos divergentes, incluidos los ácidos grasos de cadena corta (SCFAs), lactato, formate, dióxido de carbono, metano, hidrógeno y etanol6. Además, la microbiota intestinal también produce un número de otras sustancias bioactivas como folato, biotina, trimetilamina-N-óxido, serotonina, triptófano, ácido gamma-aminobutírico, dopamina, noradrenalina, acetilcolina, histamina, ácido desoxicólico, y sulfato de 4-etilfenilo. Esto ocurre principalmente a través de la utilización de flujos metabólicos intrínsecos dentro del nicho huésped-microbio, que contribuye en varios procesos corporales, funciones metabólicas y cambios epigenéticos1,8,9, 10. Sin embargo, los efectos de diversas intervenciones en estos productos microbianos siguen sin ser kójeos o poco claros debido a la falta de protocolos fáciles, eficientes y reproducibles. La composición de la microbiota intestinal humana es un ecosistema extremadamente complejo y diverso, y por lo tanto, muchas preguntas sobre su papel en la salud humana y la patología de la enfermedad siguen sin respuesta. Los efectos de muchos moduladores de microbioma intestinal comunes (por ejemplo, probióticos, prebióticos, antibióticos, trasplante fecal e infecciones) en la composición y las funciones metabólicas de la microbiota intestinal siguen siendo en gran medida esquivas. Además, el examen y validación de estos efectos in vivo es difícil, sobre todo porque la mayoría de los nutrientes y metabolitos producidos por la microbiota intestinal se absorben o eliminan simultáneamente y rápidamente en el intestino; por lo tanto, la medición de la producción, la cantidad y la transformación de estos metabolitos (por ejemplo, los sCFA) in vivo sigue siendo un desafío práctico. De hecho, los modelos fisiológicos como los animales y los sujetos humanos son fundamentales para determinar el papel del microbioma intestinal y su modulación en la salud del huésped, pero estos pueden no ser adecuados para el cribado a gran escala de diferentes tipos de moduladores de microbioma debido a limitaciones éticas, monetarias o de tiempo. Con este fin, los modelos in vitro y/o ex vivo, como el cultivo de microbiota intestinal in vitro y luego intervenir con diferentes moduladores de microbiota, pueden ofrecer oportunidades de ahorro de tiempo y dinero y, por lo tanto, pueden permitir un cribado preliminar o a gran escala de diversos componentes (como probióticos, prebióticos, y otros compuestos de intervención) para examinar / predecir sus efectos sobre la diversidad de la microbiota fecal, composición y perfiles metabólicos. Los estudios que utilizan estos sistemas in vitro y ex vivo del microbioma intestinal pueden facilitar una mayor comprensión de las interacciones huésped-microbioma que contribuyen a la salud y la enfermedad del huésped, y también podrían conducir a la búsqueda de nuevas terapias dirigidas al microbioma mejorar la salud del huésped y prevenir y tratar diversas enfermedades1.

Aunque los sistemas in vitro de cultivo de microbiota intestinal no pueden replicar realmente las condiciones intestinales reales, varios laboratorios se han esforzado por desarrollar tales modelos, algunos de los cuales se han encontrado practicables en cierta medida y se han utilizado con éxito para diferentes propósitos. Uno de los modelos intestinales recientes es el Simulador del Ecosistema Microbiano Intestinal Humano, que imita todo el tracto gastrointestinal humano, incluyendo el estómago, intestino delgado, y diferentes regiones del colon. Sin embargo, es posible que otros modelos de investigación de todo el mundo no puedan acceder a estos modelos técnicamente complejos. Por lo tanto, todavía existe una necesidad crítica para el desarrollo de nuevos modelos alternativos que sean relativamente simples, asequibles y prácticos para los laboratorios que estudian los moduladores de microbioma y sus efectos sobre la microbiota intestinal y la salud del huésped. Por lo tanto, el uso de un sistema de cultivo de microbiota fecal in vitro (o ex vivo) sería útil para estudiar los efectos de tales intervenciones11,12. Específicamente, el efecto de diferentes prebióticos en la capacidad de fermentación de la microbiota en términos de cambios periódicos en la diversidad y composición de la microbiota intestinal, el pH fecal, y los niveles de metabolitos microbianos incluyendo SCFAs y lactato pueden ser estudiados 13. En este documento, utilizando la inulina (uno de los componentes prebióticos más estudiados) como ejemplo del modulador de microbioma, se describe un protocolo paso a paso de este sencillo sistema de cultivo por lotes de microbiota ex vivo para demostrar su uso cambios en la microbiota fecal y metabolitos microbianos después de la intervención con los moduladores de microbioma.

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Protocolo

ADVERTENCIA: Consulte las fichas de datos de seguridad de materiales adecuadas y siga las instrucciones y directrices para la capacitación adecuada de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Siga todos los pasos de cultivo según las normas estándar de bioseguridad y utilice un gabinete BSL-2 utilizando condiciones asépticas. Además, las muestras fecales de diferentes modelos y sujetos humanos pueden tener un riesgo potencial de propagación de enfermedades transmitidas por microbios. Busque inmediatamente ayuda médica en caso de cualquier lesión e infección. Además, el uso de muestras de heces humanas y animales debe ser aprobado a través de comités éticos institucionales y debe cumplir con los protocolos para utilizar muestras e información de temas.

1. Preparación de medios de comunicación culturales

  1. Preparación de los medios de cultivo, preparar nueve tipos de soluciones de stock
    1. Solución A (1.000 ml): Disolver 5,4 g de cloruro sódico (NaCl), 2,7 g de fosfato de dihidrógeno potásico (KH2PO4),0,16 g de cloruro de calcio dihidrato (CaCl2x 2H2O), 0,12 g de cloruro de magnesio hexahidrato (MgCl2 6H2O), 0,06 g de cloruro de manganeso tetrahidrato (MnCl2x 4H2O), 0,06 g de cloruro cobaltohe hexahidrato (CoCl2x 6H2O) y 5,4 g de sulfato de amonio (NH4)2SO4, en agua desionizada para hacer un volumen total de 1.000 ml.
    2. Solución B (1.000 ml): Disolver 2,7 g de fosfato de hidrógeno potásico (K2HPO4) en agua desionizada para hacer un volumen total de 1000 ml.
    3. Solución mineral traza (1.000 ml): Disolver 500 mg de etilendiamina-tetraacetato dihidrato de etilemetilo disódico (Na2EDTA), 200 mg de sulfato ferroso heptahidrato (FeSO4x 7H2O), 10 mg de sulfato de zinc heptahidrato (ZnSO4 7H2O), 3 mg de cloruro de manganeso(II) tetrahidrato (MnCl2x 4H2O), 30 mg de ácido fosfórico (H3PO4), 20 mg de CoCl2s 6H2O, 1 mg de cloruro hergeno dihidrato (CuCl2 2H2O), 2 mg de cloruro de níquel (II) hexahidrato (NiCl2x 6H2O) y 3 mg de molibdato sódico dihidrato (Na2MoO4x 2H2O) en agua desionizada para hacer un volumen total de 1.000 ml.
      NOTA: Esta solución es sensible a la luz, por lo tanto, asegúrese de ser almacenado en tubos / botellas envueltos en oscuro/negro o aluminio.
    4. Solución vitamínico soluble en agua (1.000 ml): Disolver 100 mg de clorhidrato de tiamina (Tiamina-HCl), 100 mg de ácido D-pantoténico, 100 mg de niacina, 100 mg de piridoxina, 5 mg de ácido P-aminobenzoico y 0,25 mg de vitamina B12 en agua desionizada para hacer volumen total 1.000 mL.
    5. Folato: solución de biotina (1.000 ml): Disolver 10 mg de ácido fólico, 2 mg de D-biotina y 100 mg de bicarbonato de amonio (NH4HCO3) en agua desionizada para hacer un volumen total de 1.000 ml.
    6. Solución de riboflavina (1.000 ml): Disolver 10 mg de Riboflavina en solución HEPES de 5 mM (1,19 g/L) para realizar un volumen total de 1.000 ml.
    7. Solución de Hemin (10 mL): Disolver 5.000 mg de Hemin en solución de hidróxido sódico de 10 ml (NaOH) (0,4 g/L) para realizar un volumen total de 10 ml.
    8. Mezcla de ácidos grasos de cadena corta (10 ml): Combinar 2,5 ml de N-valerate, 2,5 ml de isovalel, 2,5 ml de isobutirate y 2,5 ml: DL-o-metilbutirate.
      NOTA: Esta solución se recomienda utilizar en la campana de humos para evitar el olor y los humos.
    9. Resazurin (1.000 ml): Disolver 1 g de resazurina en agua desionizada y hacer un volumen total de 1.000 ml.
  2. Medio utilizado para la fermentación anaeróbica in vitro
    1. Para preparar este medio, mezclar 330 mL de Solución A, 330 mL de Solución B, 10 mL de Solución mineral Trace, 20 mL de solución de vitamina soluble en agua, 5 mL de Folato:solución biotina, 5 mL de solución Riboflavina; 2,5 ml de solución de Hemin, 0,4 ml de mezcla de ácidos grasos de cadena corta, 1 ml de resazurina, 0,5 g de extracto de levadura, 4 g de carbonato sódico (Na2CO3), 0,5 g de cisteína HCl-H2O y 0,5 g de trippticasa, y añadir 296,1 ml de agua destilada.
    2. Compruebe el pH y asegúrese de que está alrededor de 7.0, si no, ajustar el pH con 1 N HCl o 1 NNaOH. Esterilice filtrando al vacío el medio utilizando un filtro de botella debajo de la estación de trabajo aséptica.
    3. Alternativamente, mezcle todos los componentes (excepto las soluciones de vitaminas y hemin) y el autoclave a 121 oC durante 20 min y déjelo enfriar a temperatura ambiente. Simultáneamente, el filtro-esterilizar las soluciones de vitaminas y hemin a través de filtros de membrana de 0,22 m y añadirlos a los medios autoclavedos y refrigerados antes de dispensar.

2. Preparación de la cámara anaeróbica y el material requerido

  1. Mantener todos los materiales, soluciones y herramientas necesarias para el experimento de fermentación dentro de la cámara anaeróbica al menos 48 h antes del inicio del experimento, para asegurar que cualquier oxígeno residual asociado con herramientas y oxígeno soluble en tampones/soluciones sea y todos los materiales se aclimatan a las condiciones anaeróbicas establecidas.
    NOTA: Materiales necesarios dentro de la cámara anaeróbica (48 h antes del experimento de inicio): (i) medios de fermentación; (ii) solución anaeróbica (preparada según la sección 4.1), (iii) vórtice, (iv) peso de pesaje, (v) paños de queso mosqui, (vi) tijeras, (vii) embudo, (viii) 1.5, 2.0, 15, tubos de 50 ml, (ix) pipetador (2, 20, 200 y 1.000 ol) y pipeta compatible, x pipetas y pipetas (5 y 10 ml), (xi) pañuelos de papel, (xii) marcadores, (xiii) tubos significa diferentes tubos, (xiv) caja de residuos, (xv) Indicador O2 y (xvi) 70% botella de aerosol de etanol (desinfectante).

3. Preparación de tubos y fibras

  1. Peso 300 mg de inulina y transferencia a un tubo de 50 ml seguido de la adición aséptica de 26 ml de medios de fermentación ya preparados y almacenados en la cámara anaeróbica. Preparar un tubo en blanco para cada tipo de muestra fecal y tubo(s) experimental(es) (según el número de compuestos que se están probando), en triplicado.
  2. Deje estos tubos dentro de la cámara anaeróbica durante alrededor de 24 horas para permitir la hidratación de las muestras antes de iniciar el experimento de fermentación. Asegúrese de que la temperatura del tubo sea de 37 oC en el momento de la inoculación, por lo tanto, lleve los tubos en la incubadora encerrados dentro de la cámara anaeróbica.

4. Preparación de Inóculo

  1. Solución de dilución anaeróbica (al menos 48 h antes del experimento de fermentación): Disolver 5 g de NaCl, 2 g de glucosa y 0,3 g de cisteína-HCl en agua desionizada y hacer un volumen total de 1.000 ml. Autoclave y guárdelo dentro de la cámara anaeróbica al menos 48 h antes de su uso.
  2. Preparación del inóculo fecal (en el día del experimento de fermentación): Pesar 5 g de muestra fecal fresca en un tubo cónico de 50 ml, añadir solución de dilución anaeróbica para un volumen final de 50 ml (1:10 w/v) y vórtice durante 15 min o hasta que esté completamente homogeneizado. Filtrar la mezcla homogeneizada a través de 4 capas de tela de queso estéril (autoclavedo) y utilizarla inmediatamente para la inoculación en los tubos que contienen medios.
    NOTA: Las muestras fecales de un grupo de sujetos se pueden agrupar si el objetivo experimental es comparar el efecto de un compuesto/ingrediente determinado en la microbiota fecal sana en general.

5. Fermentación y muestreo

  1. Preparar tubos de acuerdo con la sección 4.2 e inocular tubos en blanco/control y experimentales con 4 ml de inóculo fecal diluido y filtrado. Incubar los tubos inoculados a 37oC dentro de la cámara anaeróbica. Agitar los tubos una vez cada hora invirtiendo suavemente para volver a suspender las fibras y el inóculo.
  2. Recoger muestras con la frecuencia necesaria, por ejemplo, cada hora a 0, 3, 6, 9 y 24 h durante la fermentación tomando una muestra de alícuota de 2 ml en un tubo de 2 ml de los respectivos tubos de fermentación.
  3. Mida el pH de las alícuotas utilizando un medidor de pH de laboratorio (insertando directamente el electrodo de pH en la muestra); centrifugar la muestra restante a 14.000 x g durante 10 min a 4oC. Congelar inmediatamente el sobrenadante y el pellet en nitrógeno líquido, y después de la congelación rápida, almacenar el sobrenadante para el análisis de SCFAs y pellet para el análisis de microbioma a -80 oC.

6. Los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y la cuantificación de lactato

NOTA: Los SCFAs y lactato en el sobrenadante del cultivo del microbioma se pueden medir exactamente de acuerdo con los métodos detallados en otros lugares13,14,15,16.

  1. Brevemente, descongelar los sobrenatantes congelados a presión obtenidos en la sección 5 de muestras de control y tratamiento sobre hielo y llevar a cabo todos los pasos de procesamiento adicionales sobre hielo. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,45 m y utilice las muestras libres de células para medir las concentraciones de SCFAs y lactato utilizando el sistema HPLC con detector DAD a 210 nm, equipado con una columna HPX-87H. Utilice el volumen de inyección de 10 l para cada muestra y utilice H2SO4 (0,005 N) para eluir la columna a un caudal de 0,6 ml/min a 35 oC.

7. Análisis de microbioma fecal

NOTA: Realizar análisis de microbioma siguiendo los métodos y tuberías detalladas en otros lugares7,13,14,17.

  1. Brevemente, extraiga ADN genómico de aproximadamente 200 mg de pellets de lodos fecales utilizando un kit de extracción de ADN fecal13.
  2. Amplificar la región hipervariable del gen bacteriano 16S rRNA utilizando las imprimaciones de código según el método descrito en otros lugares13,utilizando las secuencias de imprimación como se describe en el protocolo18del Proyecto de Microbioma terrestre.
  3. Purificar los amplicons resultantes con perlas de purificación magnética y cuantificar por Picogreen o un método equivalente. Auna runde los productos de PCR purificados en la misma concentración molar y secuencia en un secuenciador13.
  4. Procesar las secuencias resultantes para la desmultiplexación, el filtrado de calidad y clustering, la asignación taxonómica y la rarefacción, y los análisis posteriores mediante el uso del software Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) según los métodos descritos por 19.

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Resultados

El protocolo se utiliza para demostrar el efecto de un prebiótico específico (es decir, inulina en la composición de la microbiota y las actividades metabólicas en términos de cambios en el pH fecal y la concentración de lactato y CFFa sensatos en las heces de sujetos humanos sanos diferentes plazos después del tratamiento con inulina). El pH fecal, los niveles fecales delactato y SCFAs (Figura 1) y la composición de la microbiota (Figura

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Discusión

El modelo de fermentación de purines fecales in vitro presentado aquí es un modelo simple de un solo lote para aproximar los efectos de diferentes sustratos y cepas microbianas (por ejemplo, prebióticos y probióticos) en la composición de la microbiota fecal humana, así como su actividades metabólicas en términos de niveles de pH fecal y SCFAs. Los resultados presentados en este documento demuestran que la inoculación de la inulinación disminuye el pH fecal y aumenta significativamente los niveles de SCFAs y la...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo de fondos del Centro para la Diabetes, la Obesidad y el Metabolismo y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales, la Escuela de Medicina Wake Forest, la financiación del Departamento de Defensa (Número de subvención: W81XWH-18-1-0118), la Cátedra Kermit Glenn Phillips II en Medicina Cardiovascular; los Institutos Nacionales de Salud financiados por Claude D. Pepper Older Americans Center (financiado por P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales (Unidad de Investigación Clínica, financiado por UL1TR001420), también se reconocen afortunadamente. También agradecemos a los voluntarios por proporcionar muestras fecales, y a nuestros otros miembros del laboratorio por sus ayudas técnicas durante este experimento.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)Sigma-Aldrich217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGIC2388Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O)Sigma-AldrichC3306Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O)Sigma-Aldrich255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O)Acros organics2063450000Toxic, Irritating
Cysteine-HClSigma-AldrichC121800
D-biotinSigma-AldrichB4501
D-Pantothenic acidAlfa AesarA16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)Biorad1610729
DL-α-methylbutyrateSigma-AldrichW271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O)Sigma-AldrichF8263Toxic
Folic acidAlfa AesarJ62937
GlucoseSigma-AldrichG8270
HeminSigma-AldrichH9039
HepesAlfa AesarA14777
IsobutyrateAlfa AesarL04038
IsovalerateAlfa AesarA18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O)Sigma-AldrichM8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O)Sigma-Aldrich221279
Niacin (Nicotinic acid)Sigma-AldrichN4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O)Alfa AesarA14366Toxic
N-valerateSigma-Aldrich240370
P-aminobenzoic acidMP China102569Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4)Sigma-AldrichP5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)Sigma-AldrichP5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)Sigma-Aldrich1551128
PyridoxineAlfa AesarA12041
ResazurinSigma-AldrichR7017
RiboflavinAlfa AesarA11764
Sodium carbonate (Na2CO3)Sigma-Aldrich1613757
Sodium chloride (NaCl)Fisher BioReagents7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ChemicalsS320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O)Acros organics206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)Acros organics148991000
TrypticaseBD Biosciences211921
Vitamin B12Sigma-AldrichV2876
Yeast extractSigma-Aldrich70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O)Sigma-AldrichZ0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beadsAgencourt
Anaerobic chamber with incubatoreForma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filterCorning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencerMiseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kitQiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeterInVitrogen
VortexThermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC systemWaters Corporation

Referencias

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