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Resumen

Los productos químicos disruptores endocrinos (EDC) representan un problema grave para los organismos y para los entornos naturales. Drosophila melanogaster representa un modelo ideal para estudiar los efectos de la EDC in vivo. Aquí, presentamos métodos para investigar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC sobre la fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo, y la vida útil de la mosca.

Resumen

En los últimos años ha habido creciente evidencia de que todos los organismos y el medio ambiente están expuestos a productos químicos similares a las hormonas, conocidos como productos químicos disruptores endocrinos (EDC). Estos productos químicos pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos y conducir a efectos adversos, así como un número creciente de trastornos hormonales en la población humana o crecimiento perturbado y reproducción reducida en las especies de vida silvestre. Para algunas EDCs, hay efectos documentados para la salud y restricciones en su uso. Sin embargo, para la mayoría de ellos, todavía no hay evidencia científica en este sentido. Con el fin de verificar los posibles efectos endocrinos de un producto químico en todo el organismo, necesitamos probarlo en sistemas modelo adecuados, así como en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Aquí informamos protocolos in vivo detallados para estudiar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC en la fecundidad/fertilidad, tiempo de desarrollo y vida útil de la mosca. En los últimos años, utilizamos estos rasgos de vida Drosophila para investigar los efectos de la exposición a 17-o-etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA), y bisfenol AF (BPA F). En conjunto, estos ensayos cubrieron todas las etapas de la vida de Drosophila y hicieron posible evaluar la interrupción endocrina en todos los procesos mediados por hormonas. Los ensayos de fecundidad/fertilidad y tiempo de desarrollo fueron útiles para medir el impacto de la EDC en el rendimiento reproductivo de la mosca y en las etapas del desarrollo, respectivamente. Por último, el ensayo de vida útil implicó exposiciones crónicas de la EDC a adultos y midió su supervivencia. Sin embargo, estos rasgos de vida también pueden ser influenciados por varios factores experimentales que tuvieron que ser cuidadosamente controlados. Por lo tanto, en este trabajo, sugerimos una serie de procedimientos que hemos optimizado para el resultado correcto de estos ensayos. Estos métodos permiten a los científicos establecer la interrupción endocrina para cualquier EDC o para una mezcla de diferentes EDC en Drosophila, aunque para identificar el mecanismo endocrino responsable del efecto, podrían ser necesarios ensayos adicionales.

Introducción

Las actividades humanas han estado liberando al medio ambiente una enorme cantidad de productos químicos, que representan un grave problema para los organismos y para los ecosistemas naturales1. De estos contaminantes, se estima que unos 1.000 productos químicos diferentes pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos; según esta propiedad, se clasifican como sustancias químicas disruptoras endocrinas (EDC). Específicamente, sobre la base de una definición reciente de la Sociedad Endocrina, las EDC son "un químico exógeno, o mezcla de productos químicos, que puede interferir con cualquier aspecto de la acción hormonal"2. En las últimas tres décadas, ha habido cada vez más evidencia científica de que las EDC pueden afectar a la reproducción y desarrollo de animales y plantas3,4,5,6,7, 8. Además, la exposición a la EDC se ha relacionado con la creciente prevalencia de algunas enfermedades humanas, incluyendo cáncer, obesidad, diabetes, enfermedades tiroideas, y trastornos del comportamiento9,10,11.

Mecanismos generales de la EDC

Debido a sus propiedades moleculares, los EDC se comportan como hormonas o precursores hormonales3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. En este sentido, pueden unirse al receptor de una hormona y interrumpir los sistemas endocrinos ya sea imitando la actividad hormonal o bloqueando la unión de hormonas endógenas. En el primer caso, después de la unión al receptor, pueden activarlo como su hormona natural haría. En el otro caso, la unión de la EDC al receptor impide la unión de su hormona natural, por lo que el receptor está bloqueado y ya no se puede activar, incluso en presencia de su hormona natural3. Como consecuencia, los EDC pueden afectar a varios procesos, como la síntesis, secreción, transporte, metabolismo o acción periférica de hormonas endógenas que son responsables del mantenimiento de la homeostasis, reproducción, desarrollo y/o comportamiento de el organismo. La unión del receptor no es la única forma de acción descrita hasta ahora para las EDC. Ahora está claro que también pueden actuar reclutando coactivadores o corepresores en vías enzimáticas o modificando marcadores epigenéticos que desreguladoran la expresión génica10,11,12,13 ,14, con consecuencias no sólo para la generación actual, sino también para la salud de las generaciones venideros8.

Hormonas drosofílicas

Los efectos potenciales de las EDC seleccionadas se han estudiado ampliamente, tanto en especies de vida silvestre como en varios sistemas de modelos en los que los mecanismos endocrinos son razonablemente bien conocidos. En el caso de los invertebrados, los sistemas endocrinos que influyen en el crecimiento, el desarrollo y la reproducción se han caracterizado ampliamente en insectos por varias razones, lo que implica su uso extensivo en el campo de la investigación biológica, su importancia económica y finalmente el desarrollo de insecticidas capaces de interferir específicamente con el sistema hormonal de los insectos de plagas.

En particular, entre los insectos, la mosca de la fruta D. melanogaster ha demostrado ser un sistema modelo muy potente para evaluar los posibles efectos endocrinos de las EDC. En D. melanogaster, así como en los vertebrados, las hormonas juegan un papel importante a lo largo de todo el ciclo de vida. En este organismo, hay tres sistemas hormonales principales, que involucran la hormona esteroide 20-hidroxiediseano (20E)15,16, la hormona juvenil sesquiterpenoides (JH)17, y los neuropéptidos y péptidos /proteínas hormonas18. Este tercer grupo consta de varios péptidos descubiertos más recientemente pero claramente involucrados en una gran variedad de procesos fisiológicos y conductuales, tales como longevidad, homeostasis, metabolismo, reproducción, memoria, y control locomotor. 20E es homólogo a las hormonas esteroides derivadas del colesterol como el estradiol, mientras que la JH comparte algunas similitudes con el ácido retinoico; ambos son las hormonas más conocidas en Drosophila19,20. Su equilibrio es vital en la coordinación de la muda y la metamorfosis, así como en el control de varios procesos de postdesarrollo, como la reproducción, la vida útil y el comportamiento21,ofreciendo así diferentes posibilidades para probar endocrinos disrupción en Drosophila. Además, las hormonas ecdysteroid y los JH son los principales objetivos de los llamados insecticidas de tercera generación, desarrollados para interferir con los procesos mediados endocrinos en el desarrollo y la reproducción en los insectos. El modo agonista o antagonista de acción de estos productos químicos es bien conocido, y por lo tanto pueden servir como normas de referencia para evaluar los efectos de los posibles EDC en el crecimiento, reproducción y desarrollo de insectos22. Por ejemplo, el metopreno, que ha sido ampliamente utilizado en el control de mosquitos y otros insectos acuáticos23,24, funciona como un agonista JH y reprime la transcripción genética inducida por 20E y la metamorfosis.

Además de las hormonas, la superfamilia del receptor nuclear (NR) en Drosophila también es bien conocida; consiste en 18 factores de transcripción evolutivamente conservados involucrados en el control de las vías de desarrollo dependientes de las hormonas, así como la reproducción y fisiología25. Estas hormonas NR pertenecen a los seis subtipos de superfamilia NR, incluidos los involucrados en la neurotransmisión26,dos para los NR de ácido retinoico, y los de los NR esteroides que, en los vertebrados, representan uno de los objetivos principales de los EDC27.

Drosophila como sistema modelo para el estudio de las EDC

Actualmente, sobre la base de propiedades moleculares, varias agencias ambientales de todo el mundo están atribuyendo el potencial de interferir con los sistemas endocrinos a diferentes productos químicos artificiales. Dado que las EDC son un problema global y omnipresente para el medio ambiente y para los organismos, el objetivo general de la investigación en este campo es reducir su carga de morbilidad, así como proteger a los organismos vivos de sus efectos adversos. Con el fin de profundizar la comprensión sobre los posibles efectos endocrinos de un producto químico, es necesario probarlo in vivo. Con este fin, D. melanogaster representa un sistema de modelos válido. Hasta la fecha, la mosca de la fruta se ha utilizado ampliamente como modelo in vivo para evaluar los efectos de varias EDC ambientales; se ha informado de que la exposición a varios EDC, como el dibutilo ftalato (DBP)28,el bisfenol A (BPA), el 4-nonilfenol (4-NP), el 4-tert-octilfenol (4-tert-OP)29, el metilparabeno (MP)30, el etilparabeno (EP)31, 32, bis-(2-etilhexilo) ftalato (DEHP)33y 17-o-etinilestradiol (EE2)34, influye en el metabolismo y las funciones endocrinas como en los modelos de vertebrados. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Más allá de un excelente conocimiento de sus sistemas endocrinos, otras ventajas incluyen su corto ciclo de vida, bajo costo, genoma fácilmente manipulable, una larga historia de investigación, y varias posibilidades técnicas (ver el sitio web de FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster también proporciona un modelo potente para estudiar fácilmente los efectos transgeneracionales y las respuestas de la población a los factores ambientales8 y evita cuestiones éticas relevantes para los estudios in vivo en animales superiores. Además, la mosca de la fruta comparte un alto grado de conservación de genes con los seres humanos que podría hacer posible que los ensayos de Drosophila EDC ayuden a predecir o sugerir los efectos potenciales de estos productos químicos para la salud humana. Además de ampliar la comprensión sobre los efectos en la salud humana, Drosophila puede ayudar a evaluar los riesgos de exposición de la EDC al medio ambiente, como la pérdida de biodiversidad y la degradación del medio ambiente. Por último, la mosca de la fruta ofrece la ventaja adicional de ser utilizada en laboratorios, donde los factores que pueden afectar a su desarrollo, reproducción y vida útil pueden mantenerse bajo control con el fin de atribuir cualquier variación a la sustancia a probar.

Con esto en mente, hemos optimizado ensayos de fitness simples y robustos para determinar los efectos de la EDC en algunos rasgos hormonales de Drosophila, como la fecundidad/fertilidad, el tiempo de desarrollo y la vida útil de los adultos. Estos ensayos han sido ampliamente utilizados para algunos EDCs23,24,25,26,27. En particular, hemos utilizado los siguientes protocolos para evaluar los efectos de la exposición al estrógeno sintético EE234 y al BPA y al bisfenol AF (BPA F) (datos no publicados). Estos protocolos pueden modificarse fácilmente para investigar los efectos de una EDC dada a la vez, así como los efectos combinados de múltiples EDC en D. melanogaster.

Protocolo

1. Preparación de alimentos

  1. Para el mantenimiento de las poblaciones y para el crecimiento larvario, utilice un medio de harina de maíz que contenga un 3 % de levadura en polvo, un 10 % de sacarosa, un 9 % de harina de maíz precocida, un 0,4 % de agar, denominado a partir de entonces medio de harina de maíz (CM).
    1. Poner 30 g de levadura en 100 ml de agua del grifo, llevarla a ebullición y dejar hervir durante 15 minutos.
    2. Por separado, mezcle bien 90 g de harina de maíz precocida, 100 g de azúcar y 4 g de agar en 900 ml de agua del grifo.
    3. Pon a hervir la solución, baja el fuego y cocina durante 5 minutos revolviendo continuamente.
    4. Después de 5 minutos, agregue la solución de levadura caliente y cocine a fuego lento durante otros 15 minutos.
    5. Apague la fuente de calor y deje que la solución se enfríe a unos 60 oC.
    6. Añadir 5 ml/L de 10% metil 4-hidroxibenzoato en etanol, mezclar bien y dejar que se quede durante 10 minutos.
      NOTA: Tenga cuidado con la cantidad de metil 4-hidroxibenzoato, dado que una alta concentración de fungicida podría ser letal para las larvas.
    7. Dispensar el medio en viales/botellas: 8 ml en cada vial de mosca (25 mm x 95 mm), 3 ml en cada vial de mosca (22 mm x 63 mm) y 60 ml en cada botella de mosca (250 ml).
    8. Cubra los viales con tela de queso y déjelos secar a temperatura ambiente (RT) durante 24 horas antes del almacenamiento.
    9. Calibre la consistencia y la hidratación del CM experimentalmente correctas modificando la cantidad de agar utilizado y/o los tiempos de enfriamiento/secado.
      Nota: los viales desenchufados, en caja y envueltos son estables durante unos 15 días a 4 oC.
  2. Para los adultos Drosophila, utilice un medio que contenga 10% de levadura en polvo, 10% sacarosa, 2% agar, a partir de entonces llamado medio adulto (AM).
    1. Mezclar 10 g de levadura en polvo, 10 g de sacarosa, 2 g de agar en 100 ml de agua destilada.
    2. Pon a hervir esta mezcla dos veces, con un intervalo de 3 minutos, o hasta que el agar se disuelva, usando un microondas.
    3. Una vez que la solución se enfríe a 60 oC, añadir 5 ml/l de metil4-hidroxibenzoato en etanol, mezclar bien y dispensar en viales (10 ml por vial).
    4. Cubra los viales con tela de queso y déjelos secar a RT durante 24 horas antes de guardarlos.
      NOTA: los viales desenchufados, en caja y envueltos son estables durante unos 15 días a 4 oC.
  3. Para el ensayo de fecundidad/fertilidad, utilice el medio de harina de maíz de jugo de tomate Drosophila.
    1. Vierta 70 ml de harina de maíz tibia en un vaso de precipitados de 100 ml y agregue 30 ml de jugo de tomate (30% v/v).
    2. Mezclar bien con un procesador de alimentos y pipeta 3 ml en viales pequeños.
    3. Cubra los viales con tela de queso y déjelos secar a RT durante 24 horas antes del almacenamiento.
      NOTA: los viales desenchufados, en caja y envueltos son estables durante unos 15 días a 4 oC.
  4. Para la recolección de embriones, use placas de agar, que contengan 3% de agar, 30% de salsa de tomate y 3% de azúcar.
    NOTA: tenga cuidado de no hacer burbujas al verter el medio en las placas.

2. Dosis de Drosophila EDC

  1. Preparar una solución de stock adecuada disolviendo la EDC seleccionada en el disolvente adecuado. Para el EE2 (peso molecular 296.403), disolver 1,48 g en 10 ml de etanol 100% para hacer una solución de stock de 0,5 M y almacenar a -80 oC.
    PRECAUCION: Los EDC se consideran contaminantes ambientales y se deben tomar precauciones para manipularlos.
  2. Diluir la solución de stock EE2 en etanol al 10% en agua (v/v) para obtener una solución de 100 mM. Realizar las siguientes diluciones (0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM) en alimentos CM, comenzando con la concentración más baja y utilizando la misma concentración final de disolvente para cada grupo de tratamiento. Para los viales de control utilice el mismo volumen del disolvente solo.
    Nota: se recomienda mantener la concentración final del disolvente lo más baja posible, teniendo en cuenta que la concentración final de etanol no debe superar el 2% en los alimentos con mosca.
  3. Añadir la solución que contiene la dilución correcta de la EDC seleccionada al alimento a base de harina de maíz antes de la solidificación, mezclar bien con un procesador de alimentos, dispensar 10 ml en viales, cubrir con gasa de algodón y dejar secar a RT durante 16 horas antes de usar.
    NOTA: utilice este medio inmediatamente después de su preparación.
  4. Para la cría de adultos, preparar diferentes soluciones EE2 de trabajo (10 mM, 50 mM y 100 mM, respectivamente) en etanol 10% en agua (v/v) y capa de 100 l de cada una sobre la superficie de la AM, con el fin de obtener la concentración deseada del EE2 (0,1 mM , 0,5 mM y 1 mM). Para el control utilice el mismo volumen del disolvente solo.
    NOTA: alternativamente, añadir la solución que contiene la dilución correcta de la EDC seleccionada a una pequeña cantidad de AM en un tubo cónico de 50 ml, vórtice a fondo y estratificar 1 ml de ella en la superficie de los viales de AM.
    1. Cubra los viales con gasa de algodón, deje secar a RT durante 12-16 h bajo agitación suave y utilícelos inmediatamente.
      NOTA: el proceso de secado debe ajustarse experimentalmente porque depende de la humedad ambiente.
  5. Para el ensayo de alimentación, añadir tanto la solución que contiene la dilución correcta de la EDC seleccionada (EE2 0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM) como un alimento colorante (por ejemplo, el tinte rojo no 40 a 1 mg/ml)35 al CM antes de la solidificación, mezclar fuertemente con un procesador de alimentos y luego dispensar e en viales.

3. Retrasando moscas

  1. Utilice una cepa isogénica robusta, como Oregon R, mantenida por varias generaciones en el laboratorio.
  2. Mantener las moscas en una incubadora humidificada y controlada por temperatura, con una luz natural de 12 h: fotoperiodo oscuro de 12 h a 25 oC en viales que contengan alimentos CM.
  3. En cada ensayo, utilice viales en RT.

4. Ensayo de alimentación

NOTA: Este ensayo se recomienda para comprobar si la presencia de la EDC seleccionada en el medio podría afectar a la alimentación de las moscas.

  1. Poner 15 moscas jóvenes en viales que contienen CM complementado con diferentes concentraciones de la EDC seleccionada y un alimento para colorear. Permita que las moscas se alimenten en los medios durante 1 día.
    NOTA:por ejemplo, utilice el tinte rojo no 4035 (1 mg/ml).
  2. Poner 15 moscas jóvenes en viales que contienen CM complementado con el disolvente solo y un alimento colorante para el control. Permita que las moscas se alimenten en los medios durante 1 día.
  3. Anestesia individualmente cada grupo de moscas con éter.
    1. Transfiera las moscas de cada grupo a un recipiente de vidrio cilíndrico (etherizer) con un embudo insertado en el extremo abierto, invirtiendo el vial sobre el embudo y tocando suavemente los dos recipientes juntos para hacer que las moscas caigan en el etherizador.
      NOTA:  El embudo evitará que salgan del etherizer.
    2. Derribe las moscas tocando suavemente el etherizer sobre una superficie suave, como una almohadilla de ratón, y reemplace rápidamente el embudo con un tapón de algodón y gasa empapado en éter.
    3. Espere aproximadamente 1 minuto hasta que las moscas caigan al fondo y deje de moverse.
      NOTA: no exceda el tiempo o las moscas morirán.
  4. Coloque las moscas inmovilizadas bajo un microscopio estereoscópico y compare la coloración abdominal de cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control.

5. Ensayo fecundidad/fertilidad

  1. Para cada concentración de EDC, preparar 3 viales de moscas, a partir de entonces llamados viales parentales, con 8 hembras y 4 machos en alimentos de 10 ml CM/EDC; para el control preparar 6 viales de moscas con 8 hembras y 4 machos en 10 ml CM alimento complementado con disolvente. Las moscas traseras en una incubadora a 25oC.
    NOTA: evitar el hacinamiento de las larvas durante su desarrollo y tratar de utilizar densidades larvales consistentes en todos los tratamientos.
  2. Después de 4 días, retire a los padres y devuelva los viales a la incubadora durante 5 días más.
  3. A última hora de la tarde del día 9, retire todas las moscas recién de los viales y coloque los viales en una incubadora a 18oC durante la noche.
    NOTA: Esta extracción debe hacerse con mucho cuidado, comprobando la superficie del pozo medio.
    1. En la mañana del día 10, para cada grupo de tratamiento, recoger a las hembras vírgenes y a los machos jóvenes en dos grupos, bajo la luz CO2 anestesia. Subdividir aleatoriamente cada grupo de moscas en pequeños subgrupos (10 hembras y 20 machos por vial) en viales independientes llenos de CM fresco correspondiente.
      1. Repita el paso 5.3.1 teniendo cuidado tanto de retirar cuidadosamente todas las moscas de los viales 8-10 h antes de la recolección y dejar los viales a 18 oC, hasta obtener al menos 30 hembras vírgenes y 30 machos por cada concentración de EDC y al menos 90 hembras vírgenes y 90 machos para el control.
    2. Alojen estos grupos de moscas a 25oC hasta que tengan una crianza de 4 días después de la eclosión, transfiriéndolas a nuevos viales que contengan el medio fresco correspondiente cada dos días.
      Nota: 4 días es tiempo suficiente para que las moscas se conviertan en adultos maduros, pero está muy lejos del comienzo de la senescencia.
    3. Después de dos días asegúrese de que no haya larvas en los viales de las hembras. Si lo hacen, las moscas no son utilizables porque no son vírgenes y deben ser desechadas.
  4. Utilice 20 moscas individuales de cada sexo para cada grupo de tratamiento para establecer 20 cruces individuales en viales pequeños que contengan un medio fresco de CM-tomate sin EDC, como se describe a continuación.
    1. A cada grupo de tratamiento asignar una serie diferente de números secuenciales, que lo identifican de forma única y etiquetan los viales respectivos; por ejemplo, grupo1 (solo disolvente) de 1 a 20, grupo 2 (concentración de EDC x) de 20 a 40, y así sucesivamente.
    2. Haga una hoja de cálculo de fertilidad para registrar las diferentes series, cada una correspondiente a un grupo de tratamiento.
    3. Para cada sexo anestesiar todas las moscas que pertenecen a cada grupo de tratamiento bajo la luz CO2 y transferirlas aleatoriamente de la siguiente manera.
      1. Transfiera una hembra tratada con disolventes a un vial pequeño que contenga un medio fresco de cm-tomate sin EDC y agregue un macho tratado con disolvente para la cruz de control.
        Nota: el jugo de tomate debe añadirse a un medio durante su preparación porque el medio oscuro aumenta el contraste con los embriones blancos.
      2. Transfiera una hembra tratada con EDC a un vial pequeño que contenga CM-tomate fresco sin EDC y agregue un macho tratado con disolvente sin disolvente para cada tratamiento.
      3. Transfiera un macho tratado con EDC a un vial pequeño que contenga un medio fresco de cm-tomate sin EDC y agregue una hembra tratada con disolvente para cada tratamiento.
    4. Casa todas estas cruces individuales a 25oC.
  5. Transfiera cada par de apareamiento en viales frescos de cm-tomate sin EDC todos los días durante los siguientes diez días. Etiquetar secuencialmente los viales replicados de cada serie; por ejemplo, 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c e informe de esta cifra en la hoja de cálculo de fertilidad.
  6. Inspeccione visualmente cada vial todos los días en busca de huevos e informe su número en la hoja de cálculo de fertilidad.
  7. Guarde cada vial y, cuando las moscas recién emergentes comiencen a emerger, también registre el número diario de progenies adultas durante el período de 10 días. Después de 10 días desde el apareamiento inicial, retire a los padres.
    NOTA: desechar el vial en el que uno o ambos padres murieron; en caso de escape de uno o ambos padres, incluir en el análisis todos los datos hasta el día en que se perdieron.
  8. Suma el número diario de óvulos y el número diario de progenies adultas de cada grupo de tratamiento, para obtener la fecundidad total/fertilidad, la producción media de óvulos y progenie adultas por mosca durante diez días, y la proporción de progenie total con respecto al número total de óvulos puestos. Calcular las diferencias en el porcentaje de cada valor de tratamiento con respecto al control.
  9. Llevar a cabo tres experimentos independientes para cada grupo de moscas, utilizando un mínimo de 10 moscas para cada grupo de tratamiento.
  10. Realice análisis estadísticos para comparar los diferentes grupos.

6. Tiempo de desarrollo

NOTA: En los dos protocolos alternativos siguientes, el momento del desarrollo se evalúa contando tanto el número de puas que se forman por día como el número de progenie súbditos adultos que se ecierran por día.

  1. Protocolo de ensayo de eclosión 1
    1. Para cada grupo de tratamiento, configure 10 viales de moscas jóvenes (<2 días), moscas sanas, cada uno con 6 hembras y 3 machos en alimentos de harina de maíz de 10 ml sin EDC.
    2. Dejar volar en la comida durante 24 h, y dejar que se apareen.
    3. Preparar 10 viales paralelos por grupo de tratamiento con 10 ml cada uno de alimentos frescos de harina de maíz complementados con diferentes concentraciones de EDC o el disolvente solo para el control. Transfiera moscas apareadas a estos nuevos viales.
      NOTA: para cada grupo de tratamiento, asigne una serie diferente de números secuenciales, que lo identifiquen de forma única y etiqueten los viales respectivos.
    4. Haga una hoja de cálculo de desarrollo para grabar las diferentes series.
    5. Dejar que las moscas pongan huevos durante 16 h. Luego retire a los padres de los viales.
      NOTA: Las moscas madre se pueden utilizar para repetir el paso 6.1.5, transfiriéndolos a otros viales correspondientes.
    6. Incubar viales durante 3-4 días a 25 oC, o hasta que no se formen pusias más. Todos los días cuenta el número de pupupas recién en cada vial e infórmelas en la hoja de cálculo del desarrollo. Para evitar contar la misma pupa dos veces, escriba un número en secuencia en cada pupa con un marcador permanente en el exterior del vial.
    7. A partir del día 9, cuente diariamente el número de adultos emergentes hasta que no salden más adultos, e informe en la hoja de cálculo del desarrollo.
    8. A partir de estos datos brutos, calcular el período larvario medio, el período pupal medio, así como las diferencias en porcentaje de cada tratamiento con respecto al control.
    9. Llevar a cabo tres experimentos independientes para cada grupo de moscas, utilizando un mínimo de 5 viales para cada grupo de tratamiento.
    10. Realice análisis estadísticos para comparar los diferentes grupos.
  2. Protocolo de ensayo de eclosión 2
    1. La hembra joven y sana (alrededor de 150) y el macho (alrededor de 50) vuelan en una jaula de recolección (Tablade Materiales)con medio de agar-tomate complementado con pasta de levadura fresca de panadero (3 g de levadura de panadero en 5 ml de agua), a partir de entonces llamada bandeja de colocación, durante 2 días a 25oC.
    2. Durante estos 2 días, permita que las moscas se aclimaten a la jaula en un lugar oscuro y tranquilo, antes de comenzar la recolección de huevos, y cambie la bandeja de puesta dos veces al día.
    3. Al tercer día, cambie la bandeja de colocación temprano en la mañana. Después de 1 h, reemplace la bandeja de puesta, desechando estos huevos puestos.
    4. Deje que las moscas pongan huevos durante 2 h y sustitúyalos por una bandeja de puesta fresca.
      NOTA: Para el día 3, una buena bandeja de puesta debe producir 100-200 huevos en 2 h.
    5. Para cada grupo de tratamiento, prepare una serie de tres platos de 60 mm que contengan alimentos de harina de maíz de tomate complementados con la concentración de EDC correspondiente o con disolvente solo e informe cada serie en la hoja de cálculo de tiempo del desarrollo. Alternativamente, si se prefiere, utilice viales en lugar de platos.
    6. Recoja suavemente los huevos bajo un microscopio usando un pincel o una sonda y transfieralos a la parte superior del medio en cada plato/vial. Para facilitar el conteo, en la bandeja de colocación, organizar los huevos en 5 grupos de 10 cada uno y transferirlos uno a la vez.
      NOTA: Repita el paso 6.2.4 tantas veces como sea necesario para obtener suficientes embriones.
    7. Casa rinde todos estos platos/viales a 25oC. Almacene también cada bandeja de puesta a 25oC y cuente el número total de huevos puestos.
    8. Después de 24-30 h, revise cada plato/vial bajo un estereomicroscopio y cuente tanto el número de óvulos blancos y no fecundados como el número de embriones muertos oscuros.
    9. Restar el número de huevos blancos no fecundados del valor de 50 huevos transferidos para obtener el valor de los «embriones totales» por plato/vial. El número de embriones muertos oscuros se puede utilizar para determinar posibles efectos tóxicos de la EDC durante la embriogénesis.
    10. Repita los pasos 6.1.6-6.1.10 del Protocolo 1 del ensayo de Eclosión.

7. Protocolo de vida útil

  1. Instalar 20 viales de moscas con 8 hembras y 4 machos y casa a 25 oC en CM (10 ml cada uno).
  2. Después de 4 días deseche las moscas y vuelva a colocar los viales en la incubadora.
    NOTA: estas moscas se pueden utilizar para empezar de nuevo para obtener otras cohortes sincronizadas por la edad de las moscas.
  3. A última hora de la tarde del día 9, retire todas las moscas recién de los viales y devuelva los viales a la incubadora.
    Nota: algunos adultos deben comenzar a hablar tan pronto como el noveno día; desechar estas moscas permite recoger un número máximo de moscas sincronizadas, evitando la selección descuidada de los primeros emergentes.
  4. 16-24 h más tarde, transferir las moscas adultas (1 día de edad) de ambos sexos en cuatro grupos de botellas de 250 ml que contienen alimentos AM complementados con tres concentraciones diferentes de EDC y uno con el disolvente solo. Si es necesario, recoja otro lote al día siguiente.
  5. Mantener las moscas a 25 oC durante 2-3 días para permitir que se apareen.
    NOTA: el día de traslado a los viales de alimentos AM corresponde al primer día de la edad adulta.
  6. Después de dos-tres días, ordenar cada cohorte de moscas por sexo en dos grupos bajo anestesia CO2 ligera. Subdivide aleatoriamente cada sexo en cinco viales por tratamiento a una densidad de 20 individuos por vial, hasta que haya tres réplicas de 5 viales paralelos para cada sexo por cada tratamiento.
    NOTA: Trabaje con pequeños grupos de moscas para prevenir posibles problemas desalud duraderos debido al largo tiempo de exposición al CO2.
  7. Preparar una hoja de cálculo de vida útil en la que el número de moscas muertas se resta del número de moscas supervivientes a la transferencia anterior, de tal manera que se obtenga automáticamente el número de sobrevivientes en cada transferencia.
  8. Transfiera las moscas a viales nuevos que contengan los alimentos correspondientes cada 3 días al mismo tiempo y compruebe si hay muerte.
    NOTA: la transferencia debe tener lugar sin anestesia que podría tener un efecto negativo a largo plazo en la longevidad de la mosca.
    1. En cada transferencia, registre la edad de las moscas y el número de moscas muertas.
      NOTA: el número de moscas supervivientes se calcula automáticamente en la hoja de cálculo, pero se recomienda comprobarlo visualmente. Las moscas que accidentalmente escapan o mueren durante la transferencia no deben ser consideradas. Tenga cuidado de no contar dos moscas muertas llevadas al nuevo vial que informa de esta nota en la hoja de cálculo.
    2. Repita los pasos 7.8 y 7.8.1 hasta que todas las moscas mueran.
  9. Para cada grupo de tratamiento, cree una curva de supervivencia como se muestra en la Figura6, con el fin de mostrar la probabilidad de supervivencia de una mosca en un momento determinado.
  10. Realice tres experimentos independientes para cada grupo de tratamiento de moscas, utilizando 100 moscas recién cerradas para cada experimento.
  11. Preparar una tabla en la que informar de la vida media (días medios de supervivencia de todas las moscas para cada grupo), la mitad del tiempo de mortalidad (período de tiempo en días requeridopara alcanzar el 50% de mortalidad) y la vida útil máxima (cantidad máxima de días necesarios para alcanzar el 90% de mortalidad).
  12. Calcular las diferencias de porcentaje entre cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control.
  13. Realizar análisis estadísticos para comparar los diferentes grupos de tratamiento.

Resultados

En esta sección, los pasos clave de los protocolos anteriores se notifican en forma de esquemas simplificados. Dado que las moscas tienden a evitar compuestos desagradables, lo primero que hay que hacer es probar el sabor de la EDC seleccionada. Esto se puede hacer mezclando un colorante alimentario (por ejemplo, tinte de alimentos rojos no 40)35 con el alimento complementado con la EDC seleccionada en varias dosis o solo con el disolvente. Las moscas alimentadas en estos medios se examinan bajo ...

Discusión

La mosca de la fruta D. melanogaster ha sido ampliamente empleada como un sistema modelo in vivo para investigar los efectos potenciales de los EDC ambientales como DBP28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33y EE234. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Aparte de sus ventajas indiscu...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Orsolina Petillo por su apoyo técnico. Los autores agradecen a la Dra. Mariarosaria Aletta (CNR) su apoyo bibliográfico. Los autores agradecen al Dr. Gustavo Damiano Mita por presentarlos al mundo de la EDC. Los autores agradecen a Leica Microsystems y Pasquale Romano por su ayuda. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Compromiso: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Proyecto PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
17α-EthinylestradiolSigmaE4876-1G
Agar for Drosophila mediumBIOSIGMA789148
Bisphenol ASigma239658-50G
Bisphenol AFSigma90477-100MG
CornmealCA' BIANCA
Diethyl etherSigma
Drosophila VialsBIOSIGMA78900825x95 mm
Drosophila VialsBIOSIGMA78900929x95 mm
Drosophila VialsKaltek18722X63
Embryo collection cageCraftsPlexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
EthanolFLUKA2860
EtherizerCraftscylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle250mL Bottles
Glass VialsMicrotechST 10024FLAT BOTTOM TUBE 100X24
Hand blender PimmyArietefood processor
Instant Success yeastESKAPowdered yeast
Laying trayCraftsplexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoateSIGMAH5501
Petri DishFalcon35101660x5
Red dye no. 40SIGMA16035
Stereomicroscope with LED lightsLeicaS4E
SucroseHIMEDIAMB025
Tomato sauceCirio

Referencias

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