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Resumen

El análisis de múltiples biomoléculas en todo el sistema es crucial para obtener información funcional y mecanicista sobre los procesos biológicos. Por lo tanto, se describe un protocolo extenso para la extracción de alto rendimiento de lípidos, metabolitos, proteínas y almidón de una sola muestra cosechada del cultivo sincronizado de Chlamydomonas.

Resumen

Las microalgas han sido el foco de investigación para sus aplicaciones en la producción de compuestos de alto valor, alimentos y combustible. Además, son valiosos modelos fotosintéticos que facilitan la comprensión de los procesos celulares básicos. Los estudios amplios del sistema permiten una comprensión completa y profunda de las funciones moleculares de los organismos. Sin embargo, se requieren múltiples muestras y protocolos independientes para estudios proteómicos, lipidómicos y metabolómicos que introducen un mayor error y variabilidad. Aquí se presenta un sólido método de extracción de alto rendimiento para la extracción simultánea de clorofila, lípidos, metabolitos, proteínas y almidón de una sola muestra de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii. La configuración experimental ilustrada es para cultivos Chlamydomonas sincronizados utilizando condiciones de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Se recogieron muestras durante un ciclo celular de 24 h para demostrar que los metabolitos, lípidos y datos de almidón obtenidos utilizando diversas plataformas analíticas están bien conformados. Además, se utilizaron muestras de proteínas recogidas utilizando el mismo protocolo de extracción para realizar análisis proteómicos detallados para evaluar su calidad y reproducibilidad. Sobre la base de los datos, se puede inferir que el método ilustrado proporciona un enfoque robusto y reproducible para avanzar en la comprensión de varias vías bioquímicas y sus funciones con mayor confianza para la investigación básica y aplicada.

Introducción

Las microalgas son una rica fuente de productos naturales (por ejemplo, combustibles, nutrición humana y animal, cosméticos y sustancias farmacológicas). Numerosos esfuerzos de investigación se llevan a cabo para mejorar la eficiencia de la producción de productos de alto valor a partir de microalgas1,2,3,4. La comprensión a nivel de sistemas del metabolismo es unrequisito previo para mejorar la calidad y el rendimiento de los productos naturales 5,6,7. Con el advenimiento de técnicas genómicas funcionales y métodos mejorados de espectrometría de masas, miles de genes, transcripciones, proteínas y metabolitos pueden ser monitoreados simultáneamente. Sin embargo, se requieren múltiples muestras para estudios proteómicos, lipidómicos y metabolómicos en profundidad, que a menudo es difícil de lograr en organismos unicelulares, especialmente si se deben realizar estudios de curso de tiempo. Además, la recopilación y el procesamiento de diferentes alícuotas de muestra según los mismos en combinación con diferentes protocolos para recopilar los datos omics altamente complejos (es decir, proteómicos, lipidómicos y metabolómicos) introduce la variabilidad, haciendo de la integración de datos una tarea desafiante.

Chlamydomonas proporciona no sólo un excelente sistema microbiano para la investigación de procesos celulares, sino también un modelo conveniente para estudiar la coordinación del ciclo celular y el metabolismo. En consecuencia, se ha demostrado una fuerte coordinación de la expresión de transcripciones con el ciclo celular utilizando perfiles de transcriptoma de transcriptoma de alta resolución de cultivo sincronizado de Chlamydomonas8. Alrededor del 80% de las transcripciones analizadas mostraron una periodicidad robusta en un ciclo celular de 24 horas8. Del mismo modo, se demostró que el peso seco, las proteínas, la clorofila, los aminoácidos y los ácidos grasosde dos cepas diferentes de Chlamydomonas se correlacionaron con la división celular en un estudio en el que se realizaba el muestreo cada 4 h 9. Recientemente, se informó que la dinámica de metabolitos y lípidos del cambio celular basado en fases específicas del ciclo celular10. Los cambios sutiles en diferentes biomoléculas fueron posibles de monitorear usando un robusto éter de metilter-butilo (MTBE): metanol: método de extracción a base de agua, que ofrece un punto de partida ideal para el análisis multi-ómico integral10 , 11.

El protocolo presentado guía a través de una estrategia reproducible y eficiente10, para la extracción simultánea de lípidos, metabolitos, proteínas y almidón de una sola muestra de alícuota, para el estudio metabolómico y lipidómico resuelto por el tiempo de cultivos de Chlamydomonas de crecimiento sincrónico. Además de ilustrar los datos metabólicos y lipidémicos robustos y reproducibles10,aquí también se demuestra la calidad de las muestras proteómicas obtenidas del mismo pellet.

Protocolo

1. Precultivos de Chlamydomonas reinhardtii

  1. Preparar los precultivos de Chlamydomonas reinhardtii (tipo salvaje de cepa CC-1690 mt+) transfiriendo células de placas sólidas de medio TAP a matraces Erlenmeyer con 200 ml de HSM medio12.
  2. Cultivar los precultivos en una coctelera rotatoria a 24 oC a 100 oM-2s-1 luz continua hasta que la densidad celular alcance 2 x 106 células/ml.

2. Sincronización de cultivos líquidos Chlamydomonas en fermentadores

NOTA: Los parámetros presentados en este protocolo,como temperatura, luz y CO 2, son específicos de la sincronización de la cepa CC-1690 mt+. Para desarrollar un cultivo sincronizado utilizando otra cepa, es necesario probar las condiciones óptimas.

  1. Transfiera el precultivo a un sistema de fermentador (consulte la figura suplementaria 1 para el diseño de fermentador hecho a medida), conectado a un enfriador de recirculación para mantener la temperatura, con burbujeo de CO2 filtrado (2%, v/v) y agitado con un barra de agitación magnética en la parte inferior del fermentador con agitación constante.
  2. Para iniciar la sincronización, ajuste el fermentador en un régimen de luz-oscuridad de 12:12 h, por debajo de 34oC y 200oC -2oC-1y asegúrate de que contenga 500 ml de cultivo en medio HSM con una densidad celular de 1 x 106 células/ml.
  3. Al final del ciclo de 24 h, rediluir el cultivo a 1 x 106 células/ml con medio fresco HSM con mínima perturbación mediante el uso de un sistema de tubo en combinación con bombas peristálticas, que permite bombear primero una cantidad distinta de cultivo y después bombear en medio esterilizado por autoclave.
    NOTA: Como alternativa a las bombas peristálticas, se pueden utilizar jeringas inoculantes para extraer el cultivo, mientras que el volumen requerido de medio fresco se puede añadir directamente al fermentador en condiciones estériles.
  4. Repita el paso 2.3 tres veces para obtener los cultivos sincronizados en 4o día de inoculación.
  5. Para validar la sincronización de células, coseche muestras a un intervalo de cada 2 h y mida la densidad de celdas y el volumen de celdautilizando un contador de celdas y un analizador de tamaño (consulte Tabla de materiales). Dependiendo de la densidad celular, diluir las muestras entre 1:10 a 1:100 y medir en un rango de tamaño de 30 – 1900 m3.

3. Cosecha de células de Chlamydomonas

  1. Etiquetar tubos de centrífuga cónica de 15 ml y preparar una dewar llena de nitrógeno líquido.
  2. Cosecha muestras utilizando una jeringa (50 cm3) a través del tubo de vidrio interno del fermentador. Distribuya la muestra en tubos de centrífuga cónica que deben contener 10-15 x 106 células. Observe el volumen transferido a cada tubo y mida la densidad de celda y el tamaño de celda de cada punto de tiempo utilizando el contador de celdas y el analizador de tamaño (consulte Tabla de materiales)
  3. Pellet las células por centrifugación durante 5 min a 4000 x g. A continuación, deseche el sobrenadante, congele los gránulos en nitrógeno líquido y luego guárdelos a -80 oC.

4. Preparación de tampones de extracción y clorofila de extracción, lípidos y metabolitos

ADVERTENCIA: El metanol (MeOH) y el MTBE son inflamables y pueden causar irritación de las vías respiratorias, los ojos o la piel al exponerse y/o al contacto prolongados. Por favor, manéjelos con cuidado sólo en una campana de humos y utilice los procedimientos de seguridad adecuados durante la extracción (capa de laboratorio, gafas de seguridad, guantes, etc.).

  1. Búfer de extracción 1
    1. En un matraz volumétrico de 100 ml, añadir 75 ml de MTBE, 25 ml de MeOH (grado UHPLC) y homogeneizar (3:1, vol/vol).
    2. Añadir la siguiente solución de normas internas: 50 l de corticosterona (1 mg/ml en MeOH), 50 l 1,2-diheptadecanoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (17:0 PC) (1 mg/ml en grado de cloroformo HPLC), 25 ml de ampicilina (1 mg/ml en agua grado UHPLC) y 50 oL de grado UHPLC) y 50 oL de grado UHPLC) y 50 oL de grado UHPLC) y 50 oL de grado UHPLC) y 50 oL de grado UHPLC) D-Sorbitol-1-13C (1 mg/ml en agua grado UHPLC).
    3. Transfiera el tampón de extracción a una botella de vidrio limpia y enfríe previamente la solución a -20 oC, 1 h antes de su uso. Utilice una solución recién preparada para las extracciones. Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
  2. Búfer de extracción 2
    1. En un matraz volumétrico de 100 ml, añadir 75 ml de agua grado UHPLC y 25 ml de grado MeOH UHPLC y homogeneizar.
    2. Transfiera el tampón de extracción a una botella de vidrio limpia. Utilice una solución fresca para las extracciones. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas.

5. Extracción de clorofila, lípidos y metabolitos

  1. Organizar los tubos, con el pellet celular (que contiene 10-15 x 106 células), en nitrógeno líquido.
  2. Resuspenda el pellet celular en cada tubo con 1 ml de tampón de extracción preenfriado (-20 oC) 1.
    NOTA: Realice este paso rápidamente para evitar la evaporación del tampón de extracción de baja viscosidad. Después de añadir el búfer de extracción 1, mantenga los tubos a temperatura ambiente.
  3. Vórtice hasta que las células estén bien homogeneizadas dentro de la mezcla de extracción y alístresen la mezcla en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
  4. Sonicar los cultivos usando baño de sonicación (ver Tabla de Materiales)en agua enfriada por hielo durante 10 min.
  5. Incubar todas las muestras en un agitador orbital a 1000 rpm durante 60 min a 4 oC.
  6. Para inducir la separación de fases, agregue 650 s de la zona de extracción 2.
  7. Vortex seguido brevemente por centrifugación a 20000 x g durante 5 min a 4oC.
    NOTA: Después de este paso, hay una separación de las fases líquidas y un pellet sólido en la parte inferior del tubo. Manipule los tubos con cuidado para evitar la mezcla de las dos fases líquidas. La fase SUPERIOR de MTBE contiene lípidos y clorofila, mientras que la fase inferior contiene los metabolitos polares y semipolares. El pellet precipitado en la parte inferior contiene proteínas, almidón y otras moléculas insolubles.

6. Alícuota de las fracciones

  1. Transfiera 500 l de fase MTBE superior (lípidos) a un tubo etiquetado de 1,5 ml. Seque las muestras utilizando un concentrador de vacío (ver Tabla de Materiales)y guárdelas a -80 oC hasta la medición.
  2. Retire la fase MTBE restante utilizando una pipeta de 200 ml.
  3. Transfiera 650 l de la fase inferior (metabolitos polares y semipolares) a un nuevo tubo etiquetado. Seque las muestras utilizando un concentrador de vacío (ver Tabla de Materiales)y guárdelas a -80 oC hasta la medición.
  4. Retire la fase inferior restante pipeteando el exceso de volumen.
  5. Congele el pellet sólido en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 oC hasta su posterior extracción.

7. Determinación de metabolitos polares (metabolitos primarios)

  1. Resuspender el pellet seco de la fase polar (paso 6.3) en la solución de metoxiamina-hidrocloruro/piridina para la metoximización de grupos de carbonilo.
  2. Calentar las muestras a 37 oC durante 90 min.
  3. Derivatizar las muestras con N-metil-N-trimetilsilyltrifloracetamide (MSTFA) durante 30 min a 37 oC como se describió anteriormente13.
  4. Utilice la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tiempo de vuelo (GC-TOF-MS) para analizar los metabolitos primarios. Los parámetros de gradiente utilizados se realizaron de acuerdo con el protocolo14descrito anteriormente.

8. Determinación de metabolitos no polares (Lípidos)

  1. Vuelva a suspender el pellet seco de fase no polar (paso 6.1) en una mezcla de acetonitrilo:isopropanol (7:3, v:v).
  2. Centrifugar a 20000 x g y separar en una columna C8 de fase inversa (partículas de 100 mm x 2,1 mm x 1,7 mm), utilizando un sistema UPLC (véase la tabla de materiales). Las dos fases móviles fueron agua con 1% 1 M de acetato de amonio, 0,1% de ácido acético (Buffer A) y acetonitrilo:isopropanol (7:3) que contiene 1% 1% de acetato de amonio, 0,1% de ácido acético (Buffer B).
  3. Utilice los parámetros de degradado de acuerdo con el protocolo14descrito anteriormente.

9. Determinación del contenido de clorofila

  1. Mezclar 100 l de la fase MTBE (paso 6.1) con 900 l de metanol al 90% para un método en blanco, así como las muestras experimentales.
  2. Mida la absorbancia utilizando espectrofotómetro a una longitud de onda de 665 nm y 652 nm para distinguir entre clorofila a y clorofila b.
    NOTA: La absorción debe oscilar entre 0,1 y 1 para el cálculo de la concentración válida. Diluir las muestras, si es necesario.
  3. Calcular el contenido de clorofila a y b, y también el contenido total de clorofila de acuerdo con las siguientes fórmulas.
    Chla a 16.82A665 – 9.28A652
    Chlb a 36,92A652 – 16,54A665
    Chla-b a 0,28A665 + 27,64A652
    NOTA: Las fórmulas fueron descritas por Bar-Nun y Ohad15.

10. Extracción y determinación del contenido proteico, digestión y análisis

NOTA: Para resuspender la proteína, se utilizó un tampón de urea/tiourea de pellets (6 M de urea, 2 M de tioureay proteasa e inhibidores de la fosfatasa) con modificaciones en el protocolo descrito anteriormente16. Sin embargo, cualquier tampón de elección se puede utilizar para la resuspensión de proteínas.

  1. Preparar el tampón proteico utilizando las siguientes concentraciones: 6 M de urea y 2 M de tiourea.
  2. Disolver el pellet (paso 6.5) en 200 ml de tampón proteico (10.1).
  3. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 min, seguido de centrifugación a 20000 x g durante 5 min.
  4. Transfiera el sobrenadante, que contiene las proteínas, a un tubo nuevo.
  5. Determinar la concentración de proteínas por ensayo de Bradford17.
  6. Digestir 50 g de proteína en solución con un protocolo de elección. Aquí, utilice el siguiente protocolo.
    1. Reduzca 50 g de muestras de proteínas utilizando TDT de 5 mM durante 30 min seguido de alquilación utilizando iodoacetamida de 10 mM durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    2. Añadir mezcla de trypsin/Lys-C a una proporción de 25:1 proteína:proteasa (p/p), mezclar e incubar durante 3 h a 37 oC.
    3. Diluir las muestras seis pliegues utilizando 50 mM TrisHCl (pH 8) e incubar durante la noche a 37 oC.
    4. Terminar la digestión mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final de 0.5–1%.
  7. Después de la digestión, realizar la desalación de los péptidos antes de la espectrometría de masas utilizando C18 puntas de etapa y eluir los péptidos digeridos18.
  8. Concentrar las muestras a una casi sequedad, dejando 2-5 l de solución en un concentrador de vacío (ver Tabla de Materiales)sin calefacción.
  9. Resuspenda las muestras en el búfer de carga (5% acetonitrilo, 0,5% ácido fórmico) y analice las mezclas de péptidos mediante LC-MS/MS utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución (ver Tabla de Materiales)conectado a un sistema nano-UPLC.
  10. Separe los péptidos utilizando el sistema UPLC (ver Tabla de Materiales)en una columna híbrida de superficie cargada en fase inversa de 20 cm (ver Tabla de Materiales)con un diámetro interior de 75 m y un tamaño de partícula de 1,7 m.
  11. Cargue 4 ml de muestra y corra a través de un gradiente de 90 min a un caudal de 300 nL/min.
  12. Establezca el degradado. Utilice ajustes parciales de bucle fuera de línea con gradiente isocrático establecido en el 3% del buffer B (99,9% acetonitrilo + 0,1% ácido fórmico) mantenido durante 14 minutos antes de que el bucle se desplace a la posición en línea con la columna, a partir de entonces el gradiente se incrementa linealmente durante 50 min, hasta 20% buffer B se alcanza.
  13. Dentro de los siguientes 15 min, aumente la concentración de tampón B al 30%. Luego, en los siguientes 15 minutos, aumente el tampón B al 40%, antes de llegar al 90% del Tampón B después de otros 4 min. Realice el paso de lavado, que se requiere para limpiar la columna, a 400 nL/min y sostenga durante 10 min adicionales (ver Tabla 1 para obtener un gradiente detallado condiciones).
  14. Finalmente, vuelva a ajustar el sistema a un caudal de 300 nL/min y una concentración de 3% de tampón B dentro de 1 min. Equilibrar la columna durante 15 minutos antes de que se inyecte la siguiente muestra.
    NOTA: En la Tabla 2se presenta una lista completa de proteínas identificadas después del análisis de LCMS/MS.

11. Extracción y determinación del contenido de almidón

NOTA: Para la determinación del contenido total de proteínas y almidón, el pellet sólido se extrajo en un procedimiento de dos pasos como se describió anteriormente10.

  1. Añadir 500 l de etanol del 80% (v/v) al pellet celular (paso 6.5) e incubar durante 10 min a 80 oC.
  2. Centrífuga a 4000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, disolver el gránulo en 250 ml de agua estéril seguido de la adición de 250 ml de acetato de sodio de 100 mM.
  3. Hidrolizar el almidón calentando durante 3 h a 99oC. Digerir el almidón disuelto en monómeros de glucosa durante la noche añadiendo una mezcla enzimática de amilasa (4,2 unidades por muestra) y -amiloglucosidasa (10 unidades por muestra). Incubar los tubos a 37oC durante la noche.
    NOTA: Después de la incubación, las muestras se pueden congelar a -20 oC durante unos días, o a -80 oC durante varios meses, antes de las mediciones de glucosa.
  4. Centrifugar el extracto digerido a 20000 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante. Disolver el sobrenadante (con los monómeros de glucosa derivados del almidón) en 100 mMde HEPES-buffer (pH 7) que contiene 5 mM MgCl 2, 60 mg/mL ATP, 36 mg/ml NADP y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (1 unidad por muestra).
  5. Para analizar el contenido de almidón, primero mida la absorbancia basal a 340 nm. A continuación, añada hexoquinasa (1 unidad por muestra) para iniciar la reacción. Finalmente mida el aumento de NADPH+H+ (indicando el nivel de almidón digerido a glucosa) a 340 nm con un lector de placas de 96 pocillos.
    NOTA: La diferencia del valor máximo en 340 nm (no debe exceder el rango lineal de 1) y la línea de base es equivalente a la concentración de glucosa del almidón digerido. Se debe realizar una curva de glucosa para determinar la concentración de glucosa en nmol de glucosa por ml.

Resultados

Chlamydomonas reinhardtii Sincronización cultural CC-1690
Para demostrar los resultados representativos del protocolo dado, presentamos el ejemplo de datos multiómicos obtenidos después de la cosecha y extracción de muestras de cultivos sincronizados de Chlamydomonas reinhardtii 10. Los cultivos sincronizados de Chlamydomonas comprenden células pertenecientes a una fase de crecimiento uniforme en un momento específico. Los cultivos de Chlamydomonas se sincronizaron a 12 h/12 h ciclo claro/oscuro, 34oC con una intensidad de luz de 200 om-2s-1 y la concentración de CO2 de2%, v/v, descrita como concentración óptima para la cepa CC-1690 mt+10 . Estas condiciones habían sido previamente optimizadas y validadas utilizando varios parámetros de ciclo celular10. La Figura 1 muestra la distribución del tamaño de celda medida con Coulter Counter en puntos de tiempo distintos de los cultivos sincronizados. Un cambio en el volumen de la célula se puede observar a medida que las células crecen en tamaño a lo largo de la fase de luz, seguido por la liberación de células hijas a partir del final de la fase de luz a partir de 10 h. Una vez que se liberan todas las células hijas, se puede observar el cambio en el volumen de celdas a medida que las células hijas recién liberadas se eliminan para comenzar el siguiente ciclo 10 (Figura1).

Recolección de muestras, manipulación y extracción
La recolección rápida de las muestras se lleva a cabo utilizando centrifugación y después de desechar el sobrenadante, los pellets se pueden almacenar a -80 oC hasta la extracción. Como se describió anteriormente (paso 5), la extracción de MTBE resulta en tres fases distintas: a) se utilizó la fase orgánica para medir los lípidos, así como los niveles de clorofila (factor de normalización), b) se recogió la fase polar para medir los metabolitos en GCMS mientras que, c) se utilizó el pellet para medir el contenido de almidón y las proteínas. En la Figura 2se ilustra una visión general de la distribución de las diferentes fases y su empleo.

Metabolitos polares y no polares
Sobre la base del análisis GCMS de la fracción polar, se anotaron 65 metabolitos, que abarcan aminoácidos, ácidos nucleicos, intermedios de glucolisis, gluconeogénesis, ciclo de ácido tricarboxílico, vía de fosfato de pentosa y poliaminas (Figura 3A). El análisis LCMS de la fase neutra que contiene lípidos condujo a la identificación de 204 especies de lípidos distintos que cubren diversas clases de lípidos, a saber, fosfatidilglicerols, fosfatidiletanolamina, sulfoquinovosyl diacilglicerols, monogalactoslyldiacylglycerols, digalactosyldiacylglycerols, diacilglycerylmethylhomoserine, ácidos grasos, diacilglicéridos y tricilglicéridos. Para visualizar los cambios globales en los metabolitos y lípidos a través del ciclo celular, se utilizó el análisis de componentes principales (PCA). El PCA muestra una separación de fases claras y oscuras para datos metabolómicos y lipidómicos. Además, se puede notar un semicíclico (círculo parcialmente abierto) para ambos datos (Figura3C,D). La brecha parcial en el patrón circular se atribuye al hecho de que las muestras a 24 h del ciclo celular se recogieron bajo la oscuridad en contraste con las muestras recogidas en el comienzo del ciclo celular después de 0,25 h de exposición a la luz (Figura3C ,D).

Análisis de proteínas y almidón
Para examinar la calidad del pellet proteico obtenido como resultado de la extracción de MTBE, se utilizaron 6 muestras para el análisis proteómico. La calidad de los datos proteómicos obtenidos mediante la digestión de 50 g de proteína/muestra, se examinó utilizando una herramienta de control de calidad computacional -Control de calidad proteómica (PTXQC)19,indicando reproducibles y de alta calidad de los datos proteómicos obtenidos de datos proteómicos obtenidos de todas las réplicas (Figurasuplementaria 1). La cobertura funcional molecular de las proteínas se examinó utilizando REVIGO20. En la Figura 4Ase presenta una descripción general del enriquecimiento funcional de las 2463 proteínas identificadas (véase el Cuadro 2). El pellet restante después de la extracción de proteínas se utilizó para la cuantificación reproducible del almidón, como lo indica la baja desviación estándar entre varias réplicas (Figura4B).

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Figura 1: Ejemplo ilustrativo de los cambios en el volumen celular a través de diferentes fases del ciclo celular en Chlamydomonas reinhardtii. El eje X que representa el volumen de celda mientras que el eje Y representa el número de celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Flujo de trabajo ilustrado para el empleo de diferentes fases durante pellets de células de extracción multiómica. La figura ha sido reutilizada de Juppner, J.et al. 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ejemplo representativo de metabolitos y lípidos identificados mediante el protocolo descrito. (A) Clases de metabolito identificadas por el análisis GCMS. (B) Especies lipídicas pertenecientes a diferentes clases identificadas por el análisis LCMS. (C) Análisis del componente principal de los niveles de metabolito a lo largo del ciclo celular de 24 h. (D) Análisis del componente principal de los lípidos a lo largo del ciclo celular de 24 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Ejemplo representativo de los datos de proteínas y almidón. A) Enriquecimiento molecular funcional de las proteínas identificadas mediante el análisis LCMS, treemap dibujado utilizando datos representativos de almidón REVIGO 20 B) que muestran la reproducibilidad del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura Suplementaria 1: Diseño personalizado del sistema fermentador para el crecimiento síncrono controlado por temperatura y aireación de los cultivos de Chlamydomonas. La figura ha sido reutilizada de Juppner, J.et al. 10. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Resultado representativo de la calidad de los datos proteómicos. Mapa de calor trazado con la herramienta computacional PTXQC19. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tiempo (min)% Búfer B a Búfer A
0 a 15 minDegradado lineal de 0 a 3%Tampón A: 0,1% ácido fórmico en agua de grado UPLC
15 a 75 minDegradado lineal de 3% a 30%Tampón B: 0,1% ácido fórmico en 60% acetonitrilo grado UPLC
75 a 90 minDegradado lineal de 30% a 40%Caudal 300 nL/min
90 a 94 minDegradado lineal de 40% a 90%Volumen de inyección 4 l
94 a 104 mincolumna de lavado con 90%
105 a 120 minEquilibrar la columna durante 15 min al 3%

Tabla 1: Cromatografía líquida de muestras de péptidos, parámetros de gradiente.

Tabla 2: Lista de proteínas identificadas después del análisis de LCMS/MS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este artículo, ilustramos un protocolo de extracción robusto y altamente aplicable para el análisis integral de lipidómica, metabolómica, almidón y proteómica a partir de un solo pellet de 10-15 x 106 células. El método se ha implementado con éxito en varios estudios para una amplia gama de células y tejidos10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Aquí, presentamos un gasoducto escalonado para el análisis multi-ómico de diferentes biomoléculas de una sola muestra cosechada del cultivo Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt+).

El protocolo proporciona un enfoque robusto y reproducible para procesar múltiples muestras a la vez, para el análisis de varias biomoléculas. Sin embargo, una serie de pasos críticos deben ser tomados cuidados con el fin de minimizar la variación técnica. En primer lugar, la recolección de las células debe realizarse lo más rápidamente posible manteniendo las condiciones uniformes para todas las muestras cosechadas para preservar el estado biológico de las células. Aunque utilizamos centrifugación para cosechar las células, se pueden utilizar estrategias de cosecha alternativas para la cosecha de las muestras. Sin embargo, es importante tener en cuenta que se sabe que diferentes estrategias de recolección influyen en el estado metabólico de las células37, por lo tanto, se debe utilizar un enfoque de cosecha consistente para todas las muestras experimentales. En segundo lugar, es importante evitar el secado de la fase no polar superior que contiene clorofila, ya que esto puede influir en los niveles de clorofila disuelta en el disolvente que afecta al factor de normalización de las muestras. Por último, se debe tener cuidado al retirar la fase polar restante para obtener la proteína y el pellet de almidón, para evitar perturbar el pellet que puede influir en el almidón y el contenido de proteína.

De este modo, el protocolo de extracción presentado ofrece varios beneficios para el análisis de datos de múltiples ómicos. Además de minimizar el número de alícuotas de muestra requeridas, también reduce la variación entre los resultados analíticos obtenidos para diferentes biomoléculas. Esto permite la comparación directa de los resultados obtenidos de los metabolitos primarios, lípidos y datos proteómicos. Del mismo modo, la extracción simultánea de varias clases compuestas permite una estrategia de normalización coherente y uniforme de los diferentes conjuntos de datos. Esto es especialmente aplicable si la normalización es difícil de lograr usando el peso seco o fresco38 o el número de celda.

El protocolo se puede implementar para el cribado rutinario de una muestra biológica compleja. Estos conjuntos holísticos de datos metabolómicos, lipidómicos y proteómicos pueden ofrecer información completa sobre los cambios sistemáticos en el metabolismo. Además, los datos obtenidos del análisis proteómico, proporcionan información sobre los cambios cuantitativos (abundancia) y cualitativos (modificaciones) en las proteínas en relación con los metabolitos. Por lo tanto, la integración de datos de omics podría revelar información detallada sobre los cambios inducidos por perturbaciones genéticas o bióticas y/o abióticas de un sistema biológico. Por lo tanto, elucidar los cambios moleculares de vías metabólicas específicas o procesos celulares. Del mismo modo, estos datos de alto rendimiento pueden permitir la identificación de objetivos para la ingeniería metabólica y refinar o probar predicciones de modelos metabólicos a escala del genoma37,39.

Divulgaciones

Los autores no tienen revelaciones.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a Gudrun Wolter y a Michaelis por su excelente asistencia técnica. Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio Giavalisco por su ayuda. Estamos agradecidos a la Sociedad Max Planck por financiar la investigación y FAPESP para la beca de L A Giraldi

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and standards
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)Avanti Polar Lipids850360PInternal standard for lipids
13C SorbitolSigma Aldrich605514Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes
AmpicillinSigma AldrichA9393-5GInternal standard for metabolites
CorticosteroneSigma Aldrich27840-500MGInternal standard for metabolites, HPLC grade
Methanol (MeOH)Biosolve Chemicals13684102ULC-MS grade
Methyl tert-butyl ether (MTBE)Biosolve Chemicals13890602HPLC grade
Trypsin/Lys-C mixPromegaV5072Enzymatic digestion of proteins
WaterBiosolve Chemicals23214102ULC-MS grade
Equipment
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubesEppendorf30120086Used for fractions
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubesEppendorf30120094Used for sample extarction
BalanceSartorius Corporation14 557 572
Fermenter systemGlasbläserei Müller, Berlin, Germanycustom made fermenter of 800ml capacity
Q-exactive HF Orbitrap Mass SpectrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMBFZ
Refrigerated microcentrifugeEppendorf, model 5427R22620701
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles)Waters, Machester, UK186002878Analysis of lipids
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μmWaters, Machester, UK186007477Analysis of proteins
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles)Waters, Machester, UK186003539Analysis of metabolites
ShakerEppendorf Thermomixer 54362050-100-05
SonicatorUSC 300 TH142-0084standard preset sonication power at 45kHz
UPLC systemWaters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)
Vacuum concentratorScan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators7.008.500.002
Vortex mixerVortex-Genie 2, Model G560SI-0236
Z2 Coulter Particle Count and Size AnalyzerBeckman Coulter6605700particle (cells) volume and number analyser

Referencias

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