JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ניתוח כלל מערכת של biomolecules מרובות הוא חיוני להשגת תובנות פונקציונליות ומכניסטיות לתהליכים ביולוגיים. בזאת, פרוטוקול נרחב מתואר עבור הפקת תפוקה גבוהה של שומנים, מטבוליטים, חלבונים ועמילן ממדגם אחד שנקטפו מן התרבות Chlamydomonas מסונכרן.

Abstract

מיקרואצות היו המוקד של מחקר עבור היישומים שלהם בייצור של תרכובות ערך גבוה, מזון ודלק. כמו-כן, הם מודלים פוטוסינתטיים יקרי ערך הקוראים להבנת התהליכים הסלולאריים הבסיסיים. מחקרים רחבים מאפשרים הבנה מקיפה ומעמיקה של פונקציות מולקולריות של האורגניזמים. עם זאת, דגימות עצמאיות ופרוטוקולים מרובים נדרשים עבור פרוטמרים, lipidomics ו טבולומיקס מחקרים המציגים שגיאה גבוהה יותר והשתנות. שיטה חזקה הפקת תפוקה גבוהה עבור החילוץ סימולטני של כלורופיל, שומנים, מטבוליטים, חלבונים ועמילן ממדגם אחד של הירוק אצה Chlamydomonas ריינהרט מוצג כאן. ההתקנה הניסיונית מאוירת היא עבור תרבויות Chlamydomonas מסונכרנים באמצעות 12 h/12 h תנאים אור/כהה. דגימות נאספו מעל מחזור תא 24 h כדי להדגים את מטבוליטים, שומנים ונתונים עמילן המתקבלים באמצעות פלטפורמות אנליטיות שונות הם הותאמו היטב. יתר על כן, דגימות חלבונים שנאספו באמצעות אותו פרוטוקול החילוץ שימשו כדי לבצע ניתוח פרוטאומוניקס מפורט כדי להעריך את איכותם ואת התוכסות. בהתבסס על הנתונים, ניתן להסיק כי השיטה מומחש מספקת גישה איתנה ומגובשת להבנת המסלולים הביוכימיים השונים והתפקודים שלהם בעלי ביטחון רב יותר עבור מחקר בסיסי ומיושם.

Introduction

מיקרואצות הן מקור עשיר למוצרים טבעיים (לדוגמה, דלקים, תזונה אנושית ובעלי חיים, תמרוקים וחומרים פרמקולוגיים). מאמצי מחקר רבים מתבצעים כדי לשפר את יעילות הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה ממיקרואצות1,2,3,4. מערכות ברמת הבנה של חילוף החומרים הוא הכרחי כדי לשפר את איכות ותשואה של מוצרים טבעיים5,6,7. עם הופעתו של טכניקות גנומית תפקודית ושיטות משופרות ספקטרומטר המסה, אלפי גנים, תעתיקים, חלבונים, מטבוליטים ניתן לפקח בו זמנית. עם זאת, מספר רב של דגימות נדרשות עבור פרוטאומיקס מעמיק, lipidomics ו טבולומיקס מחקרים, אשר לעתים קרובות קשה להשיג אורגניזמים חד-תאיים, במיוחד אם מחקרים בזמן הקורס הם להתבצע. יתר על כן, איסוף ועיבוד של מדגם שונה מדגימה בשילוב עם פרוטוקולים שונים כדי לאסוף את הנתונים מורכבים מאוד omics (כלומר, פרוטאומומית, lipidomic, ו טבולומיקס) מציג את השונות, ובכך עושה שילוב של נתונים משימה מאתגרת.

Chlamydomonas מספק לא רק מערכת חיידקים מעולה לחקירת תהליכים סלולריים, אלא גם מודל נוח ללמוד את הקואורדינציה של מחזור התא וחילוף החומרים. לפיכך, תיאום חזק של ביטוי התעתיקים עם מחזור התא הוכח באמצעות ברזולוציה גבוהה ההמרה פרופיל של תרבות מסונכרנת של Chlamydomonas8. כ 80% של התעתיקים שנותחו הציגו חזק תקופתיות על מחזור תא 24 h8. כמו כן, יבש משקל, חלבונים, כלורופיל, חומצות אמינו וחומצות שומן של שני זנים שונים של Chlamydomonas הוכחו לתאם עם חלוקת התא במחקר שבו הדגימה בוצעה כל 4 h9. לאחרונה, דווח כי הדינמיקה המטטבוליט והשומנים של המשמרת התא מבוסס על שלבים ספציפיים של מחזור התא10. השינויים העדינים בbiomolecules שונים היו ניתנים לניטור באמצעות אתר מתילבוטיל חזק (mtbe): מתנול: מבוסס מים שיטת החילוץ, אשר מציעה נקודת התחלה אידיאלית עבור ניתוח multi-omics מקיפה10 , . בסדר, 11

הפרוטוקול המוצג מדריכים באמצעות אסטרטגיה מקבילה ויעילה10, עבור החילוץ בו של שומנים, מטבוליטים, חלבונים ועמילן מתוך מדגם יחיד aliquot, עבור הזמן נפתרה metabolomic ו lipidomic המחקר של תרבויות Chlamydomonas הגדלות בצורה סינכרונית. בנוסף הממחישות את הנתונים החזקים והמטבוליים מטבולית ו lipidomic10, כאן, את האיכות של דגימות פרוטאומית שהתקבלו מן הגלולה אותו הוא גם הפגינו.

Protocol

1. טרום תרבויות של Chlamydomonas ריינהרט

  1. הכינו את התרבויות הקדם של Chlamydomonas ריינהרט (סוג פראי לזן CC-1690 mt +) על ידי העברת תאים מלוחות מוצק של בינוני ברז כדי מבחנות erlenmeyer אייר עם 200 mL של מדיום hsm12.
  2. לגדל את התרבויות הקדם על שייקר ב 24 ° צ' ב 100 μשומות · m-2· s-1 אור רציף עד צפיפות התא מגיע ~ 2 x 106 תאים/mL.

2. סנכרון Chlamydomonas של תרבויות הנוזלים בפרמנטרס

הערה: הפרמטרים המוצגים בפרוטוקול זה, כגון טמפרטורה, אור ו-CO2, הם ספציפיים לסנכרון של המתח CC-1690 mt +. כדי לפתח תרבות מסונכרנת תוך שימוש בנבג אחר, יש לבחון את התנאים האופטימליים.

  1. העבר את התרבות הקדם למערכת fermenter (ראה איור משלים 1 עבור עיצוב fermenter המותאם אישית), המחובר לצידנית משלימה כדי לשמור על הטמפרטורה, עם מבעבע של CO2 מסוננים (2%, v/v) ו מעורבב עם מגנטי בר בתחתית הfermenter עם עצבנות תמידית.
  2. כדי ליזום את הסנכרון, להגדיר את fermenter במשטר אור כהה של 12:12 h, תחת 34 ° צ' ו 200 μשומות · m-2· s-1 אור ולהבטיח שהוא מכיל 500 mL של התרבות במדיום hsm עם צפיפות תא של 1 x 106 תאים/mL.
  3. בסוף 24 מחזור h, לדלל מחדש את התרבות עד 1 x 106 תאים/mL עם בינוני hsm טרי עם הפריה מינימלית באמצעות מערכת צינור בשילוב עם משאבות קנולות, אשר מאפשר תחילה משאבת כמות ברורה של התרבות החוצה ולאחר מכן משאבה אוטוקלב-מעוקר מדיום.
    הערה: כחלופה למשאבות הפריסטלטיות, ניתן להשתמש בהמזרקים מחדש לנסיגה התרבות, בעוד הנפח הנדרש של בינוני טרי ניתן להוסיף ישירות לתוך הfermenter בתנאים סטריליים.
  4. חזור על שלב 2.3 שלוש פעמים כדי להשיג את התרבויות המסונכרניםביום 4 של חיסונים.
  5. על מנת לאמת את סנכרון של תאים, דגימות הקציר במרווח של כל 2 h ולמדוד את צפיפות התא ואת נפח התא באמצעות מונה תא ומנתח גודל (ראה טבלת חומרים). בהתאם לצפיפות התא, לדלל את הדגימות בין 1:10 כדי 1:100 ולמדוד בטווח גודל של 30 – 1900 יקרומטר3.

3. קצירת תאים Chlamydomonas

  1. תווית 15 מ"ל מנורות צנטריפוגה ו להכין דיואר מלא חנקן נוזלי.
  2. דגימות הקציר באמצעות מזרק (50 ס"מ3) דרך שפופרת הזכוכית הפנימית של fermenter. הפץ את המדגם לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט אשר צריך להכיל 10-15 x 106 תאים. שים לב לעוצמת הקול המועברת לכל צינור ולמדוד את צפיפות התא ואת גודל התא של כל נקודת זמן באמצעות מונה התא ומנתח גודל (ראה טבלת חומרים)
  3. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 4000 x g. ואז להיפטר supernatant, להקפיא את כדורי בחנקן נוזלי ומאוחר יותר בחנות ב-80 ° c.

4. הכנת מאגרי החילוץ וכלורופיל החילוץ, שומנים ומטבוליטים

התראה: מתנול (MeOH) ו MTBE הם דליקים ויכולים לגרום לגירוי של מערכת הנשימה, עין או עור על חשיפה ממושכת ו/או מגע. נא לטפל בהם בזהירות רק בתוך מכסה המנוע ולהשתמש בנהלי הבטיחות המתאימים במהלך החילוץ (מעיל מעבדה, משקפיים בטיחות, כפפות, וכו ').

  1. מאגר החילוץ 1
    1. בבקבוקון 100 mL, להוסיף 75 mL של MTBE, 25 מ ל של MeOH (UHPLC כיתה) ו הומוגון (3:1, vol/vol).
    2. הוסף את פתרון הסטנדרטים הפנימיים הבאים: 50 μL של corticosterone (1 מ"ג/mL ב MeOH), 50 μL 1, 2-diheptadecanoyl-SN-שלוש-פוספולינולינה (17:0 PC) (1 מ"ג/ml בכיתה כלורופורם), 25 μL של אמפיצילין (1 מ"ג/mL ב UHPLC כיתה) ו 50 μL של D-Sorbitol-1-13C (1 מ"ג/mL במים UHPLC כיתה).
    3. העבר את מאגר החילוץ לבקבוק זכוכית נקי ומצננים את הפתרון ב-20 ° c, 1 h לפני השימוש. השתמש בפתרון טרי מוכן עבור העקירות. ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c עד 2 שבועות.
  2. מאגר החילוץ 2
    1. ב 100 mL בקבוקון נפחי, להוסיף 75 mL של מים כיתה UHPLC 25 מ ל של MeOH UHPLC כיתה ו המגון המגון.
    2. להעביר את מאגר החילוץ לבקבוק זכוכית נקייה. השתמש בפתרון טרי עבור העקירות. ניתן לאחסן פתרון זה בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות.

5. הפקת מכלורופיל, שומנים ומטבוליטים

  1. לסדר את הצינורות, עם הגלולה תא (המכיל 10-15 x 106 תאים), בחנקן נוזלי.
  2. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית בכל צינורית בעלת 1 מ ל של מאגר החילוץ מראש (-20 ° c) 1.
    הערה: בצע שלב זה במהירות כדי למנוע אידוי של מאגר הפקת צמיגות נמוכה. לאחר הוספת מאגר החילוץ 1, לשמור על הצינורות בטמפרטורת החדר.
  3. מערבולת עד התאים הם הומוגניים היטב בתוך תערובת החילוץ ואת התערובת לתוך 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה.
  4. Sonicate התרבויות באמצעות אמבטיה sonication (ראה לוח חומרים) במים מקורר קרח עבור 10 דקות.
  5. דגירה כל הדגימות על שייקר מסלולית ב 1000 סל ד עבור 60 דקות ב 4 ° c.
  6. כדי לגרום להפרדה שלב, להוסיף 650 μL של מאגר החילוץ 2.
  7. וורטקס לאחר זמן קצר צנטריפוגה ב 20000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    הערה: לאחר שלב זה יש הפרדה בין שלבים נוזליים לבין גלולה מוצקה בתחתית הצינורית. לטפל בצינורות בזהירות כדי למנוע ערבוב של שני שלבים נוזליים. העליון MTBE-שלב מכיל שומנים ו כלורופיל, בעוד השלב התחתון מכיל מטבוליטים קוטבי חצי קוטבי. הגלולה בתחתית מכילה חלבונים, עמילן ומולקולות לא מסיסים אחרות.

6. מצטט את השברים

  1. העבר 500 μL של השלבים העליונים של השלב (שומנים) לתוך שפופרת מתויג 1.5 mL. מייבשים את הדגימות באמצעות מרכז ואקום (ראו טבלת חומרים) ומאחסנים ב-80 ° צ' עד למדידה.
  2. הסר את המהלך MTBE-שלב הנותר באמצעות פיפטה 200 μL.
  3. העבר 650 μL של השלב התחתון (מטבוליטים קוטבי וחצי קוטבי) לצינור חדש המסומן בתווית. מייבשים את הדגימות באמצעות מרכז ואקום (ראו טבלת חומרים) ומאחסנים ב-80 ° צ' עד למדידה.
  4. הסר את השלב התחתון הנותר על-ידי ביטול ליטוף של עוצמת הקול העודפת.
  5. הקפא את הגלולה המוצק בחנקן נוזלי ואחסן ב-80 ° c עד לחילוץ נוסף.

7. קביעת מטבוליטים קוטביים (מטבוליטים ראשוניים)

  1. השהה מחדש את הגלולה המיובשת של השלב הקוטבי (שלב 6.3) במתיאוקסיאמין-הידרוכלוריד/פירידיין הפתרון למונואוקסיזציה לקבוצות של קרבונקסיל.
  2. מחממים דגימות ב-37 ° c עבור 90 דקות.
  3. לריקי הדגימות עם N-מתיל-N-טרימתיל (מסטפה) עבור 30 דקות ב 37 ° c כמתואר בעבר13.
  4. השתמש כרומטוגרפיה גז מצמידים לזמן של טיסה ספקטרומטר מסה (GC-תוף-MS) כדי לנתח את מטבוליטים הראשי. הפרמטרים של מעבר הצבע שבשימוש היו בהתאם לפרוטוקול הקודם שתואר14.

8. קביעת מטבוליטים לא קוטביים (שומנים)

  1. להשעות מחדש את הגלולה מיובש של שלב לא קוטבי (שלב 6.1) בתערובת של acetonitrile: איזופנול (7:3, v:v).
  2. צנטריפוגה ב 20000 x g ונפרד על השלב ההפוך C8 עמודה (100 mm × 2.1 mm × 1.7 מילימטר), באמצעות מערכת ה-mc (ראה טבלת חומרים). שני השלבים הניידים היו מים עם 1% 1 מ ' אמוניום אצטט, 0.1% חומצה אצטית (מאגר A), ו acetonitrile: איזופנול (7:3) המכיל 1% 1 ז ' אמוניום אצטט, 0.1% חומצה אצטית (מאגר B).
  3. השתמש בפרמטרים של מעבר הצבע בהתאם לפרוטוקול14המתואר בעבר.

9. קביעת תוכן כלורופיל

  1. לערבב 100 μL של MTBE-שלב (שלב 6.1) עם 900 μL של 90% מתנול עבור שיטה ריקה, כמו גם את הדגימות ניסיוני.
  2. למדוד את ספיגת באמצעות ספקטרוסקופיה באורך גל של 665 ננומטר ו 652 nm להבחין בין כלורופיל a ו כלורופיל b.
    הערה: הספיגה צריכה לנוע בין 0.1 ל -1 לחישובי ריכוז תקפים. , דלל את הדגימות. אם יש צורך
  3. חשב את התוכן כלורופיל a ו-b, וגם את התוכן הכולל כלורופיל בהתאם לנוסחאות הבאות.
    Chla = 16.82 a665 – 9.28 a652
    Chlb = 36.92 a652 – 16.54 a665
    Chla = b = 0.28 a665 + 27.64 a652
    הערה: הנוסחאות תוארו על ידי בר-נון ואוהד15.

10. הפקת וקביעת תכולת החלבון, העיכול והניתוח

הערה: כדי להשעות מחדש את החלבון, גלולה אוריאה/thiourea מאגר (6 שתנן M, 2 M thioureaו פרוטאז ומעכבי פוספאטאז) שימש עם שינויים בפרוטוקול תיאר בעבר16. עם זאת, ניתן להשתמש בכל מאגר של בחירה עבור השעיה של חלבונים.

  1. הכן את מאגר החלבון באמצעות הריכוזים הבאים: 6 M של אוריאה ו 2 M של thiourea.
  2. מפזר את הגלולה (שלב 6.5) ב 200 μL של מאגר חלבונים (10.1).
  3. דגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות, ואחריו צנטריפוגה ב 20000 x g עבור 5 דקות.
  4. העבר את הסופרנטאנט, המכיל את החלבונים, לצינורית חדשה.
  5. לקבוע את ריכוז החלבון. מאת ברדפורד בשנת17
  6. לעכל 50 μg של חלבון in-פתרון עם פרוטוקול של בחירה. . הנה, השתמש בפרוטוקול הבא
    1. להפחית 50 μg של דגימות חלבון באמצעות 5 מ"מ DTT עבור 30 דקות ואחריו האללציה באמצעות 10 מילימטר iodoamide עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    2. הוסף טריפסין/ליס-C מערבבים בחלבון 25:1: יחס פרוטאז (w/w), לערבב ו דגירה עבור 3 h ב 37 ° c.
    3. לדלל את הדגימות 6 קפלי באמצעות 50 mM TrisHCl (pH 8) ו-דגירה הלילה ב 37 ° c.
    4. לסיים את העיכול על ידי הוספת חומצה trifluoroacetic (TFA) לריכוז הסופי של 0.5 – 1%.
  7. לאחר העיכול, לבצע התפלה של פפטידים לפני ספקטרומטר מסה באמצעות C18 הבמה טיפים ו elute הפפטידים מתעכל18.
  8. לרכז את הדגימות כדי יובש ליד, עוזב 2-5 μL של פתרון בתוך מרכז ואקום (ראה טבלת חומרים) ללא חימום.
  9. השהה את הדגימות במאגר ההעמסה (5% acetonitrile, 0.5% פורמית חומצה) ולנתח את תערובות פפטיד על ידי LC-ms/ms באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים) מחובר למערכת nano-האדם.
  10. הפרד את פפטידים באמצעות מערכת ה-, היברידית (ראה טבלת חומרים) על 20 ס מ הפוכה השלב האחורי טעונה משטח (csh) עמודה (ראה טבלת חומרים) עם קוטר פנימי של 75 יקרומטר וגודל חלקיק של 1.7 יקרומטר.
  11. טען 4 μL של דגימה ולהפעיל באמצעות הדרגתי 90 דקות בקצב הזרימה של 300 nL/min.
  12. הגדר את מעבר הצבע. השתמש בהגדרות לולאה לא מקוונות חלקיות עם מעבר הדרגתי isocratic להגדיר ב-3% של מאגר B (99.9% acetonitrile + 0.1% פורמית חומצה) שנערך 14 דקות לפני הלולאה הוא העביר למיקום מקוון עם העמודה, לאחר מכן מעבר הצבע הוא גדל ליניארי עבור 50 דקות, עד 20% מאגר B מגיע.
  13. בתוך 15 דקות הבאות, להגדיל את הריכוז של מאגר B ל 30%. לאחר מכן ב 15 דקות הבאות, להגדיל את מאגר B כדי 40%, לפני שהגיע 90% של מאגר B לאחר 4 דקות נוספות. בצע את שלב הכביסה, הנדרש כדי לנקות את העמודה, ב 400 nL/min והחזק עבור 10 דקות נוספות (ראה טבלה 1 למעבר הדרגתי מפורט תנאים).
  14. לבסוף, להגדיר את המערכת בחזרה לקצב הזרימה של 300 nL/min וריכוז של 3% מאגר B בתוך 1 דקות. באופן מזערי העמודה עבור 15 דקות לפני המדגם הבא מוזרק.
    הערה: רשימה מלאה של חלבונים מזוהים לאחר ניתוח LCMS/MS מוצג בטבלה 2.

11. הוצאת וקביעת תוכן עמילן

הערה: לקביעת תוכן חלבון ועמילן מוחלט, הגלולה המוצק הופק בהליך דו-שלבים כמתואר בעבר10.

  1. הוסף 500 μL של 80% (v/v) אתנול לתוך הגלולה תא (שלב 6.5) ו דגירה עבור 10 דקות ב 80 ° c.
  2. צנטריפוגה ב 4000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לפזר את הגלולה ב-250 μL של מים סטריליים ואחריו תוספת של 250 μL של 100 mM אצטט נתרן.
  3. הידרוייז העמילן על ידי חימום עבור 3 h ב 99 ° c. לעכל את העמילן מומס לתוך גלוקוז ונומרים לילה על ידי הוספת שילוב אנזים של α-עמילאז (4.2 יחידות לדוגמה) ו-α-עמילוגילוקוזידאז (10 יחידות לכל מדגם). מודג את הצינורות ב 37 ° c בלילה.
    הערה: לאחר הדגירה ניתן להקפיא דגימות ב-20 ° c לכמה ימים, או ב-80 ° c במשך מספר חודשים, לפני מדידות גלוקוז.
  4. צנטריפוגה את תמצית מתעכל ב 20000 x g עבור 5 דקות ולאסוף את supernatant. לפזר את סופרנטאנט (עם מונומרים גלוקוז הנגזרים) ב 100 מ"מ של HEPES-מאגר (pH 7) המכיל 5 מ"מ MgCl2, 60 Mg/ml, 36 Mg/ML nadp ו גלוקוז-6-פוספט-דהידרוגנאז (יחידה אחת לכל מדגם).
  5. כדי לנתח את תכולת העמילן, למדוד תחילה את ספיגת הבסיס ב 340 ננומטר. לאחר מכן להוסיף הקסאוקיאז (1 יחידה לכל מדגם) כדי להתחיל את התגובה. לבסוף למדוד את הגידול של NADPH + H+ (המציין את רמת העמילן מתעכל לגלוקוז) ב 340 ננומטר עם קורא צלחת 96 טוב.
    הערה: ההפרש בין הערך המירבי ב340 ננומטר (לא יעלה על הטווח הליניארי של 1) והבסיס הוא שווה ערך לריכוז הגלוקוז של העמילן התעכל. עקומת גלוקוז יש לעשות כדי לקבוע את הריכוז גלוקוז ב nmol של גלוקוז לכל mL.

תוצאות

Chlamydomonas ריינהרט סנכרון התרבות של CC-1690
כדי להדגים את תוצאות הנציג עבור הפרוטוקול הנתון, אנו מציגים לדוגמה נתונים מרובי-omics שהתקבלו לאחר קציר וחילוץ של דגימות מסונכרנים Chlamydomonas ריינהרט התרבויות10. תרבויות מסונכרנות של Chlamydomonas מהווים תאים השייכים לשלב הצמיחה אחיד בנקודת זמן מסוימת. התרבויות Chlamydomonas סונכרנו על 12 h/12 h מחזור אור/כהה, 34 ° c עם עוצמת האור של 200 μ:· m-2· s-1 ו- CO2 ריכוז of2%, v/v, תיאר כריכוז אופטימלי עבור המתח CC-1690mt +10 . תנאים אלה בעבר אופטימיזציה ואומת באמצעות פרמטרים שונים מחזור התא10. איור 1 מציג את התפלגות גודל התא הנמדד עם מונה קולטר בנקודות זמן נפרדות של תרבויות מסונכרנות. משמרת בנפח התא ניתן לצפות כאשר התאים גדלים בגודל במהלך האור בשלב, ואחריו שחרורו של תאי הבת החל בסוף שלב האור מ 10 h. לאחר כל התאים בנות משתחררים, משמרת בנפח התא ניתן לצפות כמו תאים בנות שפורסמו לאחרונה מושלך להתחיל את המחזור הבא 10 (איור 1).

קצירת דגימות, טיפול והוצאה
איסוף מהיר של דגימות מתבצע באמצעות צנטריפוגה ולאחר מחיקת supernatant, כדורי ניתן לאחסן ב-80 ° צ' עד החילוץ. כפי שמתואר לעיל (שלב 5), החילוץ התוצאות MTBE בשלושה שלבים שונים: a) השלב האורגני שימש למדידת ליפידים, כמו גם כלורופיל רמות (מקדם נורמליזציה), b) שלב הקוטב נאסף כדי למדוד מטבוליטים ב GCMS בעוד, c) הגלולה היתה בשימוש למדוד תוכן עמילן וחלבונים. מבט כולל על חלוקת השלבים השונים והתעסוקה שלהם מומחש באיור 2.

מטבוליטים קוטביים ושאינם קוטביים
בהתבסס על ניתוח GCMS של השבר הקוטבי, 65 מטבוליטים היו מסומן, כיסוי חומצות אמינו, גרעין חומצות, intermediates של גליקוליזיס, גלוקונאוגנזה, מחזור חומצה tricarboxylic מסלול פוספט ו polyamines (איור 3A). ניתוח LCMS של השלב הנייטרלי המכיל שומנים הוביל לזיהוי של 204 מינים שומנים ברורים המכסים שיעורים שונים השומנים כלומר זרחן, פוספולידילטהולאיאמין, sulfoquinovosyl diacylglycerols, מונוגלטוסידיליגלילפוספונזים, דיאלאכטוסידיקלגלילאכאלילים, דיקלגלילילפיסיללגלאנפסיט, חומצות שומן, דיקלליגלידס וטריקלגלידס. כדי להמחיש את השינויים הגלובליים ב מטבוליטים ושומנים על פני מחזור התא, ניתוח המרכיב העיקרי (PCA) שימש. ה-PCA מציג הפרדה של שלבים בהירים וכהים עבור נתונים טבולומיקס ו-lipidomic. יתר על כן, חצי מחזורי (מעגל פתוח חלקית) ניתן להבחין בשני הנתונים (איור 3C, D). הפער החלקי בתבנית המעגלית מיוחס לעובדה שהדגימות ב -24 למחזור התאים נאספו תחת שחור בניגוד לדגימות שנאספו בתחילת מחזור התא לאחר 0.25 h של חשיפה לאור (איור 3C , ד).

ניתוח חלבונים ועמילן
כדי לבחון את האיכות של גלולה חלבון שהושג כתוצאה של החילוץ MTBE, 6 דגימות שימשו ניתוח פרוטמית. האיכות של הנתונים פרוטאומניקס המתקבלים על ידי עיכול 50 μg חלבון/לדוגמה, נבדק באמצעות כלי בקרת איכות חישובית-פרוטאומניקס בקרת איכות (פטין XQC)19, המציין את האיכות הגבוהה של נתונים פרוטאומניקס שהתקבלו מ כל המשכפלת (איור משלים 1). הכיסוי התפקודי המולקולרי של החלבונים נבדק באמצעות מחזור20. סקירה של העשרה פונקציונלית של 2463 החלבונים שזוהו (ראו טבלה 2), מוצג באיור 4a. הגלולה שנותרה לאחר חילוץ החלבון שימש לכימות הקוונפיקציה של עמילן כפי שצוין על ידי סטיית תקן נמוכה בקרב משכפל שונים (איור 4B).

figure-results-3774
איור 1: המחשה לדוגמה של השינויים באמצעי האחסון של התא לאורך שלבים שונים של מחזור התא ב Chlamydomonas ריינהרט. ציר ה-x המייצג את עוצמת הקול של התא כאשר ציר y מייצג את מספר התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4265
איור 2: זרימת עבודה מאוירים לתעסוקה של שלבים שונים במהלך הפקת כדורי מולטי-omics. הדמות שנעשה שימוש חוזר מגואח '. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4721
איור 3: הדוגמה המייצגת של מטבוליטים ושומנים שזוהו באמצעות הפרוטוקול המתואר. (A) שיעורי מטבוליט המזוהים על ידי ניתוח gcms. (ב) מינים משומנים השייכים לכיתות שונות המזוהים באמצעות ניתוח lcms. (ג) ניתוח המרכיב העיקרי של רמות מטבוליט על פני מחזור התאים 24 שעות. (ד) ניתוח המרכיב העיקרי של השומנים על פני מחזור התא 24 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5413
איור 4: הדוגמה המייצגת של נתוני החלבון והעמילן. A) העשרה בתפקוד המולקולרי של החלבונים המזוהים באמצעות ניתוח LCMS, מפת עצים שצוירה באמצעות הפונקציה סקירה 20 B) מייצגת מידע עמילן המציג את השימוש בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: עיצוב מותאם אישית של מערכת fermenter עבור הטמפרטורה והאנטנה מבוקרת הצמיחה סינכרוני של תרבויות Chlamydomonas. הדמות שנעשה שימוש חוזר מגואח '. 10. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: התוצאה הייצוגית עבור איכות הנתונים פרוטאומניקס. מיפוי החום מותווה באמצעותכליהעבודה החישובית ב-פטין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

זמן (מזערי)% מאגר B למאגר A
0 עד 15 דקותמעבר צבע ליניארי מ-0 to3%מאגר A: 0.1% החומצה הפורמית במים ברמת החסות
15 עד 75 דקותמעבר ליניארי בין 3% ל-30%מאגר B: 0.1% החומצה פורמית ב 60% כיתה החסות של הבנק
75 עד 90 דקותמעבר ליניארי בין 30% עד 40%תזרים קצב 300 nL/מזערי
90 עד 94 דקותמעבר ליניארי בין 40% ל-90%הזרקת נפח 4 μL
94 to104 דקותשטוף עמודה עם 90%
105 עד 120 דקותמשקל העמודה עבור 15 דקות ב-3%

טבלה 1: כרומטוגרפיה נוזלית של דגימות פפטיד, פרמטרים של מעבר צבע.

טבלה 2: רשימת החלבונים המזוהים לאחר ניתוח LCMS/MS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

במאמר זה, אנו מאוירים פרוטוקול החילוץ חזקה וישימה מאוד עבור lipidomics מקיפה, טבולומיקס, עמילן וניתוח פרוטאומניקס מתוך גלולה אחת של 10-15 x 106 תאים. השיטה יושמה בהצלחה במספר מחקרים למגוון רחב של תאים ורקמות10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. כאן, הצגנו קו הצינור לאבחון מולטי-omics של biomolecules שונים ממדגם אחד שנקטפו Chlamydomonas ריינהרט (CC-1690 mt +) תרבות.

הפרוטוקול מספק גישה איתנה ומגובשת לעיבוד דגימות מרובות בבת אחת, לניתוח biomolecules שונות. עם זאת, יש לטפל במספר שלבים קריטיים כדי למזער את הווריאציה הטכנית. ראשית, קצירת התאים צריך להיעשות במהירות האפשרית תוך שמירה על התנאים אחיד עבור כל הדגימות שנקטפו כדי לשמר את המצב הביולוגי של התאים. למרות שנהגנו צנטריפוגה לקצור את התאים, אסטרטגיות קציר חלופי ניתן להשתמש לקצירת דגימות. עם זאת, חשוב לציין כי אסטרטגיות קציר שונות ידועים להשפיע על מצב חילוף החומרים של התאים37 ולכן, הגישה הקציר עקבית חייב לשמש עבור כל הדגימות ניסיוני. שנית, חשוב להימנע מייבוש של השלב העליון שאינו קוטבי המכיל כלורופיל, מאז זה יכול להשפיע על רמות של כלורופיל מומס הממס המשפיעים על פקטור הנורמליזציה עבור הדגימות. לבסוף, הטיפול צריך להילקח תוך הסרת שלב הקוטב הנותרים כדי להשיג את החלבון ואת הגלולה עמילן, כדי למנוע מפריע את הגלולה אשר יכול להשפיע על העמילן ואת תכולת החלבון.

ובכך הציג פרוטוקול החילוץ מציע מספר יתרונות עבור ניתוח נתונים מרובים-omics. מלבד למזער את מספר המדגם הנדרש, זה גם מפחית את הווריאציה בין התוצאות האנליטיות שהתקבלו עבור biomolecules שונים. זה מאפשר השוואה ישירה של התוצאות המתקבלות מטבוליטים העיקריים, שומנים ונתונים פרוטאומית. באופן דומה, ההוצאה הזמנית של מחלקות מורכבות מרובות מאפשרת אסטרטגיית נורמליזציה עקבית ואחידה של ערכות נתונים שונות. הדבר ישים במיוחד אם הנורמליזציה קשה להשגה באמצעות משקל יבש או טרי38 או מספר תאים.

ניתן ליישם את הפרוטוקול להקרנה שגרתית של דגימה ביולוגית מורכבת. אלה metabolomic הוליסטית, ערכות מידע lipidomic ו פרוטאומית יכול להציע מידע מקיף על שינויים שיטתית בחילוף החומרים. בנוסף, את הנתונים שהתקבלו מניתוח פרוטאומניקס, מספק תובנות לגבי כמותי (שפע) ואיכותי (שינויים) שינויים בחלבונים ביחס מטבוליטים. מכאן, שילוב נתונים omics יכול לחשוף מידע מעמיק על שינויים הנגרמת על ידי גנטי או ביוטי ו/או אביוטיים רטבאליות של מערכת ביולוגית. לפיכך, להבהיר שינויים מולקולריים של מסלולים מטבוליים ספציפיים או תהליכים סלולריים. באופן דומה, אלה נתונים תפוקה גבוהה יכול לאפשר זיהוי של מטרות עבור הנדסת חילוף החומרים ולחדד או לבדוק תחזיות מודלים מטבולית בקנה מידה של הגנום37,39.

Disclosures

למחברים אין כל גילוי.

Acknowledgements

אנו מודים מאוד לגורון וולטר ולאנטה מיכיין לקבלת סיוע טכני מעולה. היינו רוצים להודות לכל חברי מעבדת Giavalisco על עזרתם. אנו מודים לחברת מקס פלאנק למימון המחקר ו-FAPESP עבור האחווה של L ' גירלדי

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and standards
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)Avanti Polar Lipids850360PInternal standard for lipids
13C SorbitolSigma Aldrich605514Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes
AmpicillinSigma AldrichA9393-5GInternal standard for metabolites
CorticosteroneSigma Aldrich27840-500MGInternal standard for metabolites, HPLC grade
Methanol (MeOH)Biosolve Chemicals13684102ULC-MS grade
Methyl tert-butyl ether (MTBE)Biosolve Chemicals13890602HPLC grade
Trypsin/Lys-C mixPromegaV5072Enzymatic digestion of proteins
WaterBiosolve Chemicals23214102ULC-MS grade
Equipment
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubesEppendorf30120086Used for fractions
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubesEppendorf30120094Used for sample extarction
BalanceSartorius Corporation14 557 572
Fermenter systemGlasbläserei Müller, Berlin, Germanycustom made fermenter of 800ml capacity
Q-exactive HF Orbitrap Mass SpectrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMBFZ
Refrigerated microcentrifugeEppendorf, model 5427R22620701
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles)Waters, Machester, UK186002878Analysis of lipids
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μmWaters, Machester, UK186007477Analysis of proteins
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles)Waters, Machester, UK186003539Analysis of metabolites
ShakerEppendorf Thermomixer 54362050-100-05
SonicatorUSC 300 TH142-0084standard preset sonication power at 45kHz
UPLC systemWaters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)
Vacuum concentratorScan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators7.008.500.002
Vortex mixerVortex-Genie 2, Model G560SI-0236
Z2 Coulter Particle Count and Size AnalyzerBeckman Coulter6605700particle (cells) volume and number analyser

References

  1. Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
  2. Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
  3. Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
  4. Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
  5. Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
  6. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518(2011).
  7. Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5(2011).
  8. Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
  9. Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
  10. Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
  11. Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45(2016).
  12. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
  13. Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
  14. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  15. Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
  16. Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  19. Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159(2017).
  20. Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800(2011).
  21. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  22. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
  23. Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
  24. Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54(2011).
  25. Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
  26. Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
  27. Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
  28. Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
  29. Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
  30. Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053(2015).
  31. Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
  32. Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
  33. Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  34. Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
  35. Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584(2014).
  36. Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871(2014).
  37. Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
  38. Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
  39. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150lipidomicsChlamydomonas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved