JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios morfológicos in vivo.

Resumen

Los fibroblastos son células mesenquimales que cambian su morfología al activarse, influyendo en última instancia en el microambiente del tejido en el que se encuentran. Aunque las técnicas tradicionales de diagnóstico por imágenes son útiles para identificar las interacciones proteicas y la morfología en el tejido fijo, no son capaces de dar una idea de la rapidez con la que las células son capaces de unir y tomar proteínas, y una vez que se activó cómo cambia su morfología en vivo. En el presente estudio, hacemos 2 preguntas principales: 1) ¿cuál es el curso de tiempo de activación de fibroblastos a través de la interacción de receptor-4 (TLR4) y lipopolisacárido (LPS) y 2) ¿cómo se comportan estas células una vez activadas? Utilizando imágenes de 2 fotones, hemos desarrollado una técnica novedosa para evaluar la capacidad de LPS-FITC para unirse a su receptor cognado, TLR4, expresado en fibroblastos periféricos en la línea de ratón reportero genético; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Este enfoque único permite a los investigadores crear videos en profundidad y lapso de tiempo y/o imágenes de proteínas que interactúan con células vivas que permiten tener un mayor nivel de granularidad para entender cómo las proteínas pueden alterar el comportamiento celular.

Introducción

El lipopolisacárido (LPS) es una endotoxina que se encuentra en la membrana externa de las bacterias gramnegativas1. LPS tiene una alta afinidad de unión para el receptor de peaje 4 (TLR4)/CD14/MD2 complejo receptor2. TLR4 es un receptor de reconocimiento de patrones comúnmente encontrado en la membrana externa de una amplia gama de células inmunitarias, células mesenquimales, y un subconjunto de neuronas sensoriales3,4,5. La activación de TLR4 expresada en las células inmunitarias conduce a sistemas de segundo mensajero independientes y dependientes de MyD88, terminando con la translocación de kappa beta (NF-B) de factor nuclear al núcleo de la célula. Esto hace que la célula inmune prototípica produzca y libere citoquinas proinflamatorias como Interleucina (IL)-1o, IL-6, y TNF-6 . Sin embargo, la forma en que otros tipos de células responden a la estimulación TLR4 no es tan clara. Los fibroblastos se han implicado en una amplia gama de patologías como cánceres y fibrosis quística y recientemente se ha demostrado que desempeñan un papel monocitos quimioatracción y promover la inflamación7,8,9.  Nuestro laboratorio está interesado en el papel de los fibroblastos en el desarrollo del dolor agudo y crónico, como la evidencia temprana sugiere que los factores liberados por los fibroblastos (metaloproteinasas de matriz (MMP), inhibidor del tejido de las metaloproteinasas (TimOP), y fibroblastos factores de crecimiento (FMG)) están involucrados en el dolor neuropático10.

Los estados de activación de las células pueden determinarse por una variedad de factores que incluyen: inducción de genes inmediatos-tempranos, expresión de proteínas alterada, proliferación celular y cambios morfológicos11,12,13. Hay muchas técnicas que existen para responder preguntas que podemos tener sobre cómo la activación de las células contribuye a las patologías, pero todas tienen sus limitaciones. La inmunohistoquímica prototípica utiliza anticuerpos etiquetados fluorescentemente para etiquetar proteínas de interés en el tejido fijo, que pueden ser inespecíficos y a menudo requieren una solución de problemas significativa antes de producir resultados fructíferos14. La hinchazón occidental es una técnica útil cuando se comparan los niveles de expresión de proteínas en el tejido post mortem; sin embargo, el componente histológico carece de esta técnica y los investigadores son incapaces de identificar cualquier cambio en la morfología15. RNA-Seq nos permite cuantificar la presencia de ARN mensajero en una muestra que en muchos casos produce datos perspicaces; sin embargo, la brecha entre la transcripción y la traducción hace que sea difícil tener resolución temporal después de un estímulo16. La imagen confocal es útil para determinar la expresión y la colocalización de las proteínas que existen en una sección transversal de los tejidos17. A menudo, esto no es representativo de la totalidad de la muestra de tejido. Por el contrario, los microscopios multifotón permiten a los usuarios crear imágenes de aproximadamente 1 mm de profundidad en una muestra, creando una representación tridimensional completa18. Por lo tanto, elegimos centrarnos en las preparaciones de imágenes in vivo, 2 fotónes, ya que los datos recopilados de estos experimentos son más directamente relacionados con el microambiente altamente plástico e interconectado del tejido vivo.

Una ventaja de estudiar las interacciones proteína-receptor in vivo es que podemos capturar claramente cómo las células responden a un estímulo, en tiempo real, en su entorno nativo sin la influencia dañina e impredecible de la extracción de tejido post mortem19. Además, se pueden realizar estudios longitudinales para evaluar la plasticidad celular y el cebado que puede ocurrir debido a la activación.  Mediante el uso de imágenes de 2 fotones, preservamos la integridad del microambiente presente cuando se aplica un estímulo externo. Este protocolo proporciona una manera de identificar la absorción de moléculas en fibroblastos después de la inyección periférica de LPS etiquetado fluorescentemente en el transcurso de varias horas in vivo y el papel de TLR4 en la activación de fibroblastos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Los procedimientos de animales fueron aprobados por la Universidad de Texas en el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dallas y fueron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.  Todos los experimentos se realizaron utilizando ratones machos y hembras de 8-12 semanas de edad criados internamente sobre un fondo C57BL/6. Los ratones transgénicos con cre-recombinas impulsados por el promotor de proteínas-1 específicos de fibroblastos fueron comprados comercialmente (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- y cruzados con ratones tdTomatolox-stop-lox, también comprados comercialmente ( Jackson, 007914) y (FSP1cre)+/- ; tdTomatolox-stop-lox y FSP1cre-/-; los ratones tdTomatolox-stop-lox fueron criados internamente sobre un fondo C57BL/6 (Figura1A,B,C). La proteína específica de fibroblastos 1 es una proteína endógena expresada en aproximadamente el 72% del fibroblasto y representa un eficaz conductor cre en el tejido dérmico20. Los ratones fueron alojados en grupo y se les dio acceso ad libitum a alimentos y agua. La temperatura ambiente se mantuvo a 21oC. Si bien usamos ratones macho y hembra cruzados C57BL/6 a las 8-12 semanas, no creemos que la edad, el sexo o los antecedentes genéticos sean requisitos necesarios para llevar a cabo experimentos multifotón. Los ratones fueron profundamente anestesiados inmediatamente después del experimento y eutanasiados.

1. Preparación de medicamentos

  1. Preparar una solución de lipopolisacárido-FITC de 5 g/20 l (Ver tabla de materiales)en envases estériles 1x PBS (pH 7.4). Vortex la solución en stock a intensidad media durante mínimamente 30 segundos para asegurar una mezcla homogénea para una concentración igual en toda la solución antes de pipetear (LPS es una molécula glutinosa).
    NOTA: No coloque LPS en un recipiente de vidrio, si es posible, utilice tubos de microcentrífuga siliconizados. Mantener en hielo hasta su uso.

2. Configuración de imágenes

  1. Configure el sistema multifotón (consulte Tabla de materiales)para obtener imágenes en dos colores. Esto requiere el uso de dos láseres de excitación separados (ver Tabla de Materiales),un conjunto de cubos de filtro GFP/RFP (ver tabla de materiales) y un objetivo de inmersión en agua 25x (1.05 NA) (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Los usuarios pueden modificar estos ajustes para adaptarse mejor a configuraciones alternativas y capacidades de microscopio multifotón. Estos son los parámetros utilizados en el protocolo experimental. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles específicos.
  2. Coloque un aparato esteretaxico (ver Tabla de Materiales)en el escenario del microscopio multifotón. Conecte esto a una máquina de administración de anestesia (ver Tabla de Materiales)para asegurarse de que los animales son anestesiados durante el experimento. Coloque un trozo de papel negro mate en la superficie del aparato como punto de conexión para la pata del ratón.
  3. Seleccione el escáner resonante con un área de escaneado fija de 512 ám x 512 m.
    NOTA: No realice los experimentos de este protocolo utilizando un escáner de galvanómetro. Debido a la frecuencia de muestreo más lenta, habrá distorsión en los videos de lapso de tiempo de la pila z debido a la respiración del animal que es inevitable.
  4. Afinar los dos láseres de excitación a las longitudes de onda de excitación de GFP y RFP, 930 nm y 1100 nm respectivamente, y dirigir la trayectoria de luz de ambos láseres de excitación al único objetivo utilizando un espejo dicrónico de 690-1.050 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 930 nm permitiendo el láser de excitación sintonizado de 9 reflejar al escáner principal y al láser sintonizado de 1.100 nm para pasar directamente al escáner principal (Figura2).
    NOTA: Es posible alterar estas longitudes de onda de excitación dependiendo de la configuración del usuario.
  5. Ajuste la potencia láser de FITC al 5% y GFP al 20%.
    NOTA: Esta configuración proporciona una relación señal-ruido (SNR) óptima en estos experimentos. Detectar señal a través de tubos multi-alcalinos fotomultiplicadores (PMP); sin embargo, los detectores GaAsP se pueden utilizar en su lugar en experimentos de muy alta sensibilidad.
  6. Prepare la habitación para la toma de imágenes en condiciones oscuras sin luz perdida.

3. Imágenes in vivo

  1. Coloque el ratón en la cámara de inducción del sistema de administración de anestesia y utilice un 5% de isoflurano (ver Tabla de Materiales)a un caudal de 2 L/min de oxígeno para colocar el ratón bajo anestesia profunda.
    NOTA: Se recomienda usar todos los EPI apropiados durante el experimento.
    1. Transfiera el ratón al aparato estereotaxico con acceso a un cono nasal para mantener la anestesia durante todo el experimento. Reduzca el isoflurano a 1.5%-2% y mantenga el caudal constante.
    2. Fije firmemente la pata trasera a un pedazo de papel negro con cinta negra en áreas proximales y distales al área de interés (esto reduce los efectos de la respiración del ratón en la calidad de la imagen), asegurándose de que la superficie plantar de la pata no esté obstruida y mirando hacia el los mismos hacia el objetivo. Asegúrese de que la cabeza del ratón esté estable dentro del cono de la nariz conectado al aparato.
      NOTA: Supervise el ratón en busca de signos de angustia o deshidratación a lo largo del experimento y ajuste el isoflurano en consecuencia.
  2. Colocar una generosa cantidad de lubricante estéril a base de agua (gel, ver Tabla de Materiales)en la superficie plantar de la pata y tocar el objetivo a la misma con el fin de crear una columna de líquido entre la pata y el objetivo.
  3. Utilice la luz de excitación FITC para enfocar en la capa dérmica de la pata. Asegúrese de que los fibroblastos etiquetados con tdTomato se visualicen antes de continuar (este paso es importante para determinar el plano focal correcto a la imagen).
    NOTA: La capa dérmica de la pata es de unos 100-150 m en la pata.
  4. Icanse el área de las células situadas justo debajo de la superficie plantar de la pata trasera con los láseres sintonizados de 930 nm y 1100 nm y adquiera un lapso de tiempo de 15 minutos de aproximadamente 5-10 rodajas de z a aproximadamente 1 m por rebanada para establecer una representación del medio ambiente antes de inyección con LPS-FITC.
  5. Realizar una inyección intraplantar de 5 g/20 l lpS-FITC en la pata trasera del ratón utilizando una jeringa Hamilton de vidrio de 25 ml (ver Tabla de materiales)y una aguja de 30G (ver Tabla de materiales),teniendo cuidado de no alterar la posición de la pata.
  6. Icanse un área de células situadas justo debajo de la superficie plantar de la pata trasera con los láseres sintonizados de 930 nm y 1100 nm y adquiera un lapso de tiempo de 60-120 minutos de aproximadamente 5-10 rodajas de z a aproximadamente 1 m por rebanada para identificar la aceptación de LPS-FITC por células.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Inicialmente, inyectamos LPS-FITC en la pata trasera de ratones de tipo salvaje con el fin de visualizar la aceptación de LPS-FITC en todos los tipos de células presentes en la capa dérmica de la pata. Después de haber observado una miríada de células en la capa dérmica de la absorción de la pata trasera con etiqueta fluorescente LPS en un ratón de tipo salvaje (Video Figura 1, 2), tratamos de apuntar específicamente a los fibroblastos, ya que son un foco principal en nuestra investigación. An...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Podría decirse que los pasos más importantes de la imagen in vivo de 2 fotones son: 1) Elegir el ratón reportero genético adecuado y proteína etiquetada fluorescentemente para la configuración de varios fotones y las necesidades experimentales21,22; 2) tomar imágenes del plano focal correcto para tener una representación precisa de la población de células en el tejido23; 3) minimizar el movimiento debido a un animal inmovilizado ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por la subvención NS096030 (MDB). También nos gustaría dar las gracias al gerente central de imágenes Ved Prakash. También nos gustaría agradecer a las instalaciones de Olympus Discovery Center/Imaging Core en UT Dallas por proporcionar equipo y apoyo

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBS, 4 LFisherbrandBP3994
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT SyringeHamilton80501
BD Precision Glide Needle 30GVWR305106
Blue PadFisherbrand1420665
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)OlympusFV30-FGR
Isoflurane, USP 250 mLVedco50989-150-15
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugateSigma-AldrichF3665-1MG
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen planeSpectra Physics
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mLVWR20170-333
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWINOlympusMPE-RS TWIN
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WDOlympusXLPLN25XWMP2
Personal Lubricant Jelly (Gel)equateZH727 2E F1
SGM-4 Stereotaxic ApparatusNarishige16030
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-01
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen planeSpectra Physics

Referencias

  1. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  2. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
  3. Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
  4. Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
  5. Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
  6. Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179(2015).
  7. Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
  8. Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
  9. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  10. Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
  11. Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
  12. Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  13. Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
  14. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  18. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  19. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  20. Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
  21. Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
  22. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  23. Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
  24. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
  25. Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
  26. Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
  27. Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
  28. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  29. Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
  30. Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
  31. Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
  32. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  33. Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184(2015).
  34. Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032(2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioingenier aN mero 149Im genes multifotonareceptor similar al peaje 4gen ticoreporterolipopolisac ridoin vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados