JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

Abstract

פיברופיצוצים הם תאים mesenchymal כי לשנות את המבנה שלהם על ההפעלה, בסופו של דבר השפעה על מיקרואקולוגיה של הרקמה הם ממוקמים. למרות טכניקות הדמיה מסורתיות שימושיות בזיהוי אינטראקציות חלבונים ומורפולוגיה ברקמה קבועה, הם לא מסוגלים לתת תובנה לגבי איך תאים במהירות מסוגלים לאגד וספיגת חלבונים, ולאחר הפעלת כיצד שינויי המבנה שלהם ב vivo. במחקר הנוכחי, אנו שואלים 2 שאלות עיקריות: 1) מה הוא הזמן-קורס של הפעלת פיברובלסט דרך קולטן כמו חיוג 4 (TLR4) ו ליפופוליד (LPS) אינטראקציה 2) איך תאים אלה להתנהג פעם הופעל? באמצעות 2-פוטון הדמיה, פיתחנו טכניקה הרומן כדי להעריך את היכולת של lps-fitc לאגד קולטן קנצוני שלה, TLR4, הביע על פיברופיצוצים היקפיים קו העכבר העיתונאי הגנטי; FSP1cre; . vivo, לקס. גישה ייחודית זו מאפשרת לחוקרים ליצור מעמיק, קטעי וידאו ו/או תמונות של חלבונים אינטראקציה עם תאים חיים המאפשר אחד יש רמה מוגברת של צפיפות הרשת בהבנת איך חלבונים יכולים לשנות התנהגות תאית.

Introduction

ליפופוליסכריד (LPS) הוא אנדוטוקסין שנמצא בקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים1. LPS יש זיקה מחייבת גבוהה עבור קולטן כמו אגרה 4 (TLR4)/CD14/MD2 מורכבת הקולטן2. TLR4 הוא הזיהוי דפוס הקולטן נמצא בדרך כלל על הקרום החיצוני של מגוון רחב של תאים חיסוניים, התאים mesenchymal, וקבוצת משנה של נוירונים סנסטיים3,4,5. ההפעלה של TLR4 ביטא על התאים החיסוניים מוביל למערכות שליחה התלויים בMyD88 ועצמאיים, ומסתיים באמצעות הטרנסלוקציה של הגורם הגרעיני ביתא (NFκB) לגרעין התא. זה גורם תא החיסון prototypic לייצר ולשחרר ציטוקינים פרו דלקתיים כגון Interleukin (IL) -1 β, IL-6 ו-TNF-α6. עם זאת, האופן שבו סוגי תאים אחרים מגיבים לגירוי TLR4 אינו ברור. פיברותקיעות כבר היה מעורב במגוון רחב של פתווגיות כגון סרטן סיסטיק פיברוזיס לאחרונה הוכחו לשחק תפקיד מונוציט כימותרפיה-אטרקציה וקידום דלקת7,8,9.  המעבדה שלנו מעוניינת בתפקיד של בעיות בהתפתחות של כאב חריף וכרוני, כפי שראיות מוקדמות מצביעות על כך שגורמים שפורסמו על ידי פיברוטיטים (Mps מטריקס), רקמות מעכבי של מטאלוסים (TIMPs), ופיברוביסט גורמי גדילה (FGFs)) מעורבים בכאבים נוירופתיים10.

מצבי הפעלה של תאים יכולים להיקבע על ידי מגוון של גורמים הכוללים: אינדוקציה של גנים מוקדמים מיידית, ביטוי חלבון משתנה, הפצת תאים, ושינויים מורפולוגיים11,12,13. ישנן טכניקות רבות הקיימות כדי לענות על שאלות שאולי יש לנו על איך הפעלה של תאים תורמת הפתווגיות, אבל לכולם יש מגבלות שלהם. פרוטוסטיאוסטוכימיה משתמשת בנוגדנים מתויגים פלואורוסקופים כדי לתייג חלבונים של עניין ברקמה קבועה, אשר עשוי להיות בלתי ספציפי ולעתים קרובות דורשים פתרון בעיות משמעותיות לפני מניב תוצאות פוריות14. כתמים מערביים היא טכניקה שימושית בעת השוואת רמות של ביטוי חלבון ברקמה שלאחר המוות; עם זאת, המרכיב היסטולוגית חסר בטכניקה זו וחוקרים אינם יכולים לזהות שינויים במבנה מורפולוגיה15. RNA-Seq מאפשר לנו לכמת את הנוכחות של RNA שליח במדגם אשר במקרים רבים תשואות נתונים תובנה; עם זאת, הפער בין תמלול ותרגום מקשה על הרזולוציה הטמפורלית לאחר גירוי16. הדמיה קונפוקלית שימושית בקביעת הביטוי והלוקליזציה של חלבונים הקיימים בחתך של רקמות17. לעתים קרובות, אין זה נציג של כל דגימת הרקמה. לעומת זאת, מיקרוסקופ multiphoton לאפשר למשתמשים תמונה בערך 1 מ"מ עמוק לתוך מדגם, יצירת ייצוג תלת מימדי מקיף18. לכן, אנחנו בוחרים להתמקד ב-vivo, 2-פוטון הדמיה preps, כאשר הנתונים שנאספו מניסויים אלה הם יותר ישירות לתרגום מאוד פלסטיק והדדית מיקרוסביבה של רקמות החיים.

היתרון של לימוד אינטראקציות של קולטן חלבון ב vivo הוא שאנחנו יכולים ללכוד בבירור כיצד תאים להגיב גירוי, בזמן אמת, בסביבה הטבעית שלהם ללא השפעה מזיקה ובלתי צפויה של הוצאת רקמות שלאחר המוות19. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים לאורך כדי להעריך את הפלסטיות התאית והטרמה שעלולות להתרחש עקב הפעלה.  באמצעות הדמיה 2-פוטון, אנו שומרים על השלמות של המיקרו-סביבה בהווה כאשר מוחל גירוי חיצוני. פרוטוקול זה מספק דרך לזהות ספיגת מולקולות באמצעות הזרקה היקפית בעקבות הזרקת היקפי של מתויג LPS במהלך מספר שעות בvivo ואת התפקיד של TLR4 בהפעלת פיברובלסט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הליכים בעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס של דאלאס טיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה היו בהתאם לאומי מכונים הנחיות בריאות.  כל הניסויים בוצעו באמצעות 8-12-שבוע-גברים עכברים ונשים שנולדו ב-הבית על רקע C57BL/6. עכברים טרנסגניים עם recombinase מונע על ידי המקדם חלבון-1 הספציפי לפיברוהפיצוץ נרכשו מסחרית (ג'קסון, 012641) (FSP1cre)+/- וחצה עם עכברים tdtomatoלקס-stop-לקס , רכשו גם מסחרית ( ג'קסון, 007914) ו-(FSP1cre)+/- ; להפסיק את הFSP1cre. tdTomatoלקס-לעצור-לקס עכברים הונולדו ב-הבית על C57BL/6 רקע (איור 1א, ב, ג). חלבון פיברופיצוץ ספציפי 1 הוא חלבון אנדוגני המבוטא על בערך 72% של פיברובלסט ומייצג נהג יצור יעיל ברקמה העורי20. עכברים היו בקבוצה שוכנו ונתנו גישה מודעת ad למזון ומים. טמפרטורת החדר נשמרה ב -21 ± 2 ° c. בעוד השתמשנו C57BL/6 מוצלב עכברים זכר ונקבה ב 8-12 שבועות, אנחנו לא מאמינים הגיל, מין, או הרקע הגנטי הם דרישות הכרחי להריץ ניסויים בריבוי פוטון. עכברים היו מורדמים עמוקות מיד לאחר הניסוי והורדמים.

1. הכנת תרופות

  1. להכין 5 μg/20 μL פתרון של ליפופוליסכלידה-FITC (ראה שולחן חומרים) ב-1x מעקר PBS (pH 7.4). מערבולת הפתרון המניות בעוצמה בינונית עבור 30 שניות מינימלית כדי להבטיח ערבוב הומוגנית עבור ריכוז שווה לאורך הפתרון לפני ליטוף (LPS הוא מולקולה הדבקי).
    הערה: אל תמקם את LPS במיכל זכוכית, אם אפשר, השתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגה. . שמור על הקרח עד השימוש

2. הגדרת הדמיה

  1. הגדר את מערכת ריבוי הפוטון (ראה טבלת חומרים) עבור הדמיה של שני צבעים. זה דורש שימוש בשני לייזרים עירור נפרד (ראה טבלה של חומרים), קוביית מסנן gfp/rfp להגדיר (לראות את הטבלה חומרים), ו 25x (1.05 NA) מטרה טבילה במים (ראה טבלת חומרים).
    הערה: משתמשים יכולים לשנות הגדרות אלה כדי להתאים בצורה טובה יותר כיוונונים חלופיים ויכולות מיקרוסקופ רב-פוטון. אלו הפרמטרים המשמשים. בפרוטוקול הניסיוני ראה טבלת חומרים לפרטים ספציפיים.
  2. מניחים מנגנון סטריאוטקאלי (ראו טבלת חומרים) על הבמה של מיקרוסקופ רב-פוטון. חבר את זה למכונת משלוח הרדמה (ראה טבלת חומרים) כדי להבטיח את החיות מורדם למשך הניסוי. מניחים פיסת נייר שחור מאט על פני השטח של המנגנון כנקודת חיבור לכף העכבר.
  3. בחר את סורק התהודה עם שטח סריקה קבוע של 512 יקרומטר x 512 יקרומטר.
    הערה: אל תבצעו את הניסויים בפרוטוקול זה באמצעות סורק גלוונומטר. בשל קצב המדגם איטי יותר, תהיה עיוות z מחסנית זמן וידאו לשגות בשל הנשימה של החיה כי הוא בלתי נמנע.
  4. לכוון את שני לייזרים עירור כדי אורכי גל עירור של GFP ו RFP, 930 nm ו 1100 nm בהתאמה, ולהפנות את הנתיב האור של שני לייזרים עירור למטרה אחת באמצעות מראה דיקרואיק של 690-1050 ננומטר המאפשר את 930 ננומטר לייזר עירור מכוון להיות משתקף הסורק הראשי 1,100 ננומטר לייזר מכוון לעבור ישירות לתוך הסורק הראשי (איור 2).
    הערה: ניתן לשנות את אורכי הגל האלה בהתאם לכיוונון המשתמש.
  5. הגדר את כוח הלייזר של FITC ל-5% ו-GFP עד 20%.
    הערה: התקנה זו מספקת יחס מיטבי של אות לרעש (SNR) בניסויים אלה. זיהוי אות באמצעות צינורות מכפיל תמונות רב אלקליות (PMTs); עם זאת, גלאי GaAsP עשוי לשמש במקום ניסויים ברגישות גבוהה מאוד.
  6. הכינו את החדר להדמיה בתנאים אפלים ללא אור תועה.

3. בהדמיה vivo

  1. מניחים את העכבר לתוך החדר אינדוקציה של מערכת משלוח הרדמה ולהשתמש 5% isofלאנה (ראה שולחן חומרים) בקצב זרימה 2 L/min של חמצן למקום העכבר תחת הרדמה עמוקה.
    הערה: מומלץ מאוד ללבוש את כל ה-PPE המתאים במהלך הניסוי.
    1. העבר את העכבר למנגנון הסטריאוטקאלי עם גישה לקונוס האף כדי לשמור על ההרדמה במהלך הניסוי. הפחת את isof, to 1.5%-2% ושמור על קבוע קצב הזרימה.
    2. בחוזקה לצרף את הכף האחוריות אל פיסת נייר שחור עם קלטת שחור על האזורים האבובית והמרוחק לאזור העניין (זה מפחית את ההשפעות של הנשימה בעכבר על איכות התמונה), וודא את משטח plantar של כף הרגל הוא הללא השפעה ופנים לכיוון המטרה. ודא כי ראשו של העכבר יציב בתוך חרוט האף מחובר המנגנון.
      הערה: לעקוב אחר העכבר על כל סימן של מצוקה או התייבשות במהלך הניסוי ולהתאים את isofלוריאן בהתאם.
  2. מניחים כמות נדיבה של חומר סיכה סטרילי המבוסס על מים (ג'ל, ראה טבלת חומרים) על משטח plantar של כף היד ולגעת במטרה כדי ליצור טור של נוזל בין כף הרגל והמטרה.
  3. השתמש אור עירור FITC להתמקד לתוך השכבה העורי של כף היד. ודא כי tdTomato-שתייגת פיברופיצוצים הם דמיינו לפני המשך (שלב זה חשוב בקביעת מישור מוקד הנכון לתמונה).
    הערה: שכבת העורי של כפה הוא על 100-150 יקרומטר לתוך כף היד.
  4. תמונה באזור של תאים ממוקם ממש מתחת למשטח plantar של הרגל האחוריות עם שני 930 ננומטר ו 1100 ננומטר מכוון לייזרים ולרכוש 15 דקות זמן-פקיעה של כ 5-10 z-פרוסות ב כ 1 יקרומטר לכל פרוסה כדי להקים ייצוג של הסביבה לפני הזרקה עם LPS-FITC.
  5. ביצוע הזרקה של 5 μg/20 μL LPS-FITC על כף הרגל של העכבר באמצעות 25 μL זכוכית המילטון מזרק (ראה טבלת חומרים) ו 30g המחט (ראה לוח חומרים), מטפלת לא להפריע את המיקום של כף היד.
  6. תמונה באזור של תאים ממוקם ממש מתחת למשטח plantar של הרגל האחוריות עם שני 930 ננומטר ו 1100 ננומטר מכוון לייזרים ולרכוש 60-120 דקה זמן-פקיעה של אודות 5-10 z-פרוסות ב כ 1 יקרומטר לכל פרוסה כדי לזהות ספיגת lps-fitc על ידי תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בתחילה, הזרקנו LPS-FITC לתוך האחוריות של עכברים מסוג פראי כדי להמחיש את ספיגת LPS-FITC בכל סוגי התאים הנמצאים בשכבה העורי של כף היד. לאחר שנצפתה מספר עצום של תאים בשכבת העורי של ספיגת כף הרגל האחוריות fluorescently אופן-מתויג LPS בעכבר סוג פראי (וידאו איור 1, 2), ניסינו במיוחד היעד פיברופיצוצים כפי ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לטעון את הצעדים החשובים ביותר של vivo 2-פוטון הדמיה הם: 1) בחירת העכבר הכתב הגנטי הנכון ו-fluorescently אופן מתויג חלבון עבור ההתקנה multi-פוטון ואת הצרכים הניסיוניים21,22; 2) הדמיה של מטוס המוקד הנכון לייצוג מדויק של אוכלוסיית התאים ברקמה23; 3) מזעור התנועה בשל ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי המענק NS096030 (MDB). בנוסף, אנו רוצים להודות למנהל ליבת ההדמיה Prakash. אנחנו גם רוצים להודות האולימפוס דיסקברי מרכז/הדמיה ליבה מתקן ב UT דאלאס לאספקת ציוד ותמיכה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBS, 4 LFisherbrandBP3994
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT SyringeHamilton80501
BD Precision Glide Needle 30GVWR305106
Blue PadFisherbrand1420665
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)OlympusFV30-FGR
Isoflurane, USP 250 mLVedco50989-150-15
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugateSigma-AldrichF3665-1MG
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen planeSpectra Physics
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mLVWR20170-333
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWINOlympusMPE-RS TWIN
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WDOlympusXLPLN25XWMP2
Personal Lubricant Jelly (Gel)equateZH727 2E F1
SGM-4 Stereotaxic ApparatusNarishige16030
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-01
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen planeSpectra Physics

References

  1. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  2. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
  3. Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
  4. Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
  5. Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
  6. Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179(2015).
  7. Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
  8. Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
  9. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  10. Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
  11. Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
  12. Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  13. Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
  14. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  18. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  19. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  20. Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
  21. Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
  22. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  23. Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
  24. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
  25. Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
  26. Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
  27. Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
  28. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  29. Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
  30. Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
  31. Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
  32. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  33. Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184(2015).
  34. Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032(2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1494vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved